WO2019181999A1 - 多能性幹細胞を三次元培養する方法 - Google Patents

多能性幹細胞を三次元培養する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019181999A1
WO2019181999A1 PCT/JP2019/011644 JP2019011644W WO2019181999A1 WO 2019181999 A1 WO2019181999 A1 WO 2019181999A1 JP 2019011644 W JP2019011644 W JP 2019011644W WO 2019181999 A1 WO2019181999 A1 WO 2019181999A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
culture
medium
pluripotent stem
stem cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/011644
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕太 村上
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to CN201980020257.4A priority Critical patent/CN111886334A/zh
Priority to JP2020507866A priority patent/JPWO2019181999A1/ja
Priority to EP19770977.7A priority patent/EP3770249A4/en
Publication of WO2019181999A1 publication Critical patent/WO2019181999A1/ja
Priority to US17/025,821 priority patent/US20210002605A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method for three-dimensional culture of pluripotent stem cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • Non-Patent Document 1 establishes retrovirus vectors, episomal vectors, etc. by using a specific three-dimensional suspension stirring culture device (bioreactor) and setting the appropriate rotation speed, pH, and dissolved oxygen concentration of the stirring blades.
  • human iPS cells maintained on mouse fetal fibroblasts (MEF) or SNL feeder cells and on Matrigel, vitronectin, laminin E8 fragments are transferred from single cell suspension to mTeSR1®,
  • Essential8 trade name
  • StemFit registered trademark
  • Patent Document 1 discloses a serum-free and xeno-free medium containing ascorbic acid, basic fibroblast growth factor (bFGF), xeno-free serum substitute and lipid mixture, A medium having the ability to maintain sex stem cells in an undifferentiated state in the absence of feeder cell support is described.
  • Patent Document 2 describes a method for proliferating and maintaining pluripotent stem cells in an undifferentiated state, which includes the step of culturing the pluripotent stem cells in the above medium.
  • Patent Document 2 discloses a serum-free and heterogeneous component-free medium containing basal fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor ⁇ -3 (TGF ⁇ 3) and ascorbic acid, Wherein the concentration of the ascorbic acid is at least about 50 ⁇ g / ml and the medium is for maintaining pluripotent stem cells in an undifferentiated state in the absence of feeder cell support.
  • bFGF basal fibroblast growth factor
  • TGF ⁇ 3 transforming growth factor ⁇ -3
  • ascorbic acid concentration of the ascorbic acid is at least about 50 ⁇ g / ml
  • the medium is for maintaining pluripotent stem cells in an undifferentiated state in the absence of feeder cell support.
  • Patent Document 2 describes a method for proliferating and maintaining pluripotent stem cells in an undifferentiated state, which includes the step of culturing the pluripotent stem cells in the above medium.
  • Patent Document 3 describes a three-dimensional spherical culture system containing a
  • pluripotent stem cells When pluripotent stem cells are cultured in large quantities in three dimensions, a method of replacing or supplementing with a complete medium is usually performed as the number of cells increases.
  • a complete medium is a medium capable of growing and maintaining pluripotent stem cells alone.
  • the medium for culturing pluripotent stem cells is expensive, the above method is expensive.
  • the cost is reduced by adding only the components consumed by the cells. That is, in this culturing method, a seed medium at the time of cell seeding and a feed medium to be replenished after the next day are used in combination.
  • a seed medium at the time of cell seeding and a feed medium to be replenished after the next day are used in combination.
  • a means for culturing pluripotent stem cells in three dimensions to a high cell concentration there are cases where it is insufficient.
  • the present invention provides a method for three-dimensional culture of pluripotent stem cells, which can maintain good proliferation of pluripotent stem cells even if the frequency of medium exchange or medium addition is reduced. Is a problem to be solved.
  • pluripotent stem cells As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor, when three-dimensional culture of pluripotent stem cells, always performed pluripotent stem cells with a basic fibroblast growth factor (bFGF) of 35 ng / mL or more. It has been found that pluripotent stem cells can be three-dimensionally cultured while maintaining good proliferation of pluripotent stem cells by culturing in a medium containing the cells until the cell concentration becomes 1.4 ⁇ 10 6 cells / mL or more. It was. The present invention has been completed based on the above findings.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a method for three-dimensional culture of pluripotent stem cells A method of culturing pluripotent stem cells in a medium always containing 35 ng / mL or more of basic fibroblast growth factor until a cell concentration of 1.4 ⁇ 10 6 cells / mL or more is reached.
  • the basic fibroblast growth factor comprises a temperature-stable basic fibroblast growth factor.
  • the concentration of basic fibroblast growth factor in culture is maintained at 40% or more of the concentration of basic fibroblast growth factor at the start of culture, according to (1) or (2) Method.
  • pluripotent stem cells According to the method for three-dimensional culture of pluripotent stem cells according to the present invention, good proliferation of pluripotent stem cells can be maintained even if the frequency of medium exchange is reduced.
  • FIG. 1 shows the relationship between the number of days of culture and the cell growth rate.
  • FIG. 2 shows the relationship between the number of days of culture and the bFGF concentration in the medium.
  • the method of three-dimensionally culturing pluripotent stem cells according to the present invention comprises pluripotent stem cells in a medium always containing 35 ng / mL or more of basic fibroblast growth factor at 1.4 ⁇ 10 6 cells / mL or more. This is a method of culturing until the cell concentration is reached.
  • Pluripotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into all three germ layers: endoderm, ectoderm and mesoderm.
  • Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ESC embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • a pluripotent stem cell an induced pluripotent stem cell (iPS cell) is preferable.
  • the embryonic stem cell derived from a human or a primate for example, monkey
  • a human pluripotent stem cell is more preferable.
  • human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells as embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • embryonic stem cells include cells obtained from embryonic tissues formed after pregnancy (for example, preimplantation blastocysts), and expanded blastocyst cells obtained from blastocysts in the late implantation stage / early intestinal formation stage ( EBC), and embryonic germ (EG) cells obtained from fetal genital tissue at any time during pregnancy, preferably before 10 weeks of gestation.
  • Embryonic stem cells can be obtained by well-known methods.
  • human embryonic stem cells can be isolated from human blastocysts.
  • Human blastocysts are obtained from human preimplantation embryos or in vitro fertilized (IVF) embryos.
  • single cell human embryos can be grown to the blastocyst stage.
  • Extended blastocyst cells (EBC) can be obtained from blastocysts in the early gastrulation stage at least 9 days after fertilization.
  • Embryonic germ (EG) cells can also be prepared from primordial germ cells obtained from fetuses about 8-11 weeks after pregnancy in the case of human fetuses.
  • Human embryonic stem cells can be purchased from, for example, NIH (National Institutes of Health) Human Embryonic Stem Cell Registry (NIH human stem cells registry) (www.escr.nih.gov).
  • iPS cells are pluripotent stem cells obtained by introducing reprogramming factors into somatic cells.
  • the somatic cell is not particularly limited, and any somatic cell can be used.
  • mature somatic cells may be used.
  • somatic cells include (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, and (3) fibroblasts (skin cells, etc.) ), Epithelial cells, hepatocytes, lymphocytes (T cells, B cells), endothelial cells, muscle cells, hair cells, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lungs Examples thereof include differentiated cells such as cells, kidney cells, and skin cells.
  • the living body from which the rod cells are derived is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human animals (for example, monkeys, sheep, cows, horses, dogs, cats, rabbits, rats, mice). Preferably, it is a human.
  • the reprogramming factor introduced into the somatic cell is not particularly limited.
  • Oct3 / 4 Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Klf2, L-Myc, N-Myc, Klf5, Lin28, Tert, Fbx15, ERas, ECAT15-1, ECAT15-2, Tcl1, ⁇ -catenin, ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, Grb2, Nr5a, Prm14, Nr5a cadherin.
  • two or more genes can be selected from these gene groups and introduced in any combination.
  • a combination having at least Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, a combination having at least Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and L-Myc, or a combination having at least Oct3 / 4, Sox2, Nanog and Lin28 preferable.
  • the type of gene to be introduced is preferably the same as the type of the cell to which the gene is introduced.
  • the gene introduced into a human-derived cell is a human gene.
  • genes introduced into human-derived somatic cells include human Oct3 / 4, human Sox2, human Klf4 and human c-Myc, a combination having at least human Oct3 / 4, human Sox2, human Klf4 and human L-Myc. Or a combination having at least human Oct3 / 4, human Sox2, human Nanog and human Lin28.
  • the gene for reprogramming factor can be introduced into somatic cells using a gene expression vector.
  • the gene expression vector is not particularly limited, and examples thereof include viral vectors, plasmid vectors, artificial chromosome vectors, and transposon vectors.
  • virus vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, lentivirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • Undifferentiated cells obtained by introducing reprogramming factors into somatic cells that have a relatively low ability to differentiate into specific differentiated cells can be produced by introducing reprogramming factors into somatic cells.
  • cells provided or sold by research institutions or companies may be obtained. That is, the first step in the present invention may be a step of obtaining induced pluripotent stem cells from the induced pluripotent stem cell bank.
  • iPS cells provided by Cellular Dynamics can be obtained and used.
  • 201B7, 253G1, 253G4, 1201C1, 1205D1, 1210B2, 1231A3, 1383D2, 1383D6, iPS-TIG120-3f7, iPS-TIG120-4f1, iPS-TIG114-4f1, CiRA086Ai provided by iPS Cell Research Institute, Kyoto University -M1, CiRA188Ai-M1, or iRA188Ai-W1 can be obtained and used.
  • NIH National Institutes of Health
  • California Institute of Regenerative Medicine New York StemCellCound Foundation
  • European BankInstrument Banks are also available.
  • Three-dimensional culture is a method in which cells are sterically cultured after seeding, and is different from two-dimensional culture in which cells are cultured on a flat surface of a container such as a petri dish.
  • cells can spontaneously form a three-dimensional cell mass or spheroid, but a method through an external matrix such as an extracellular matrix or a microcarrier can also be used.
  • the cell mass is suspended in a liquid medium.
  • the suspension culture is a culture in which pluripotent stem cells are not attached to the surface of the substrate but suspended in the medium.
  • Patent Document 3 discloses a method of three-dimensionally culturing pluripotent stem cells in a medium containing cell source nanofibrils without stirring.
  • ⁇ Basic fibroblast growth factor> pluripotent stem cells are cultured in a medium always containing 35 ng / mL or more of basic fibroblast growth factor.
  • Basic fibroblast growth factor (sometimes referred to as bFGF, FGF2 or FGF- ⁇ ) is a member of the fibroblast growth factor family.
  • Basic fibroblast growth factor (also known as bFGF, FGF2 or FGF- ⁇ ) is a type of cytokine that belongs to the fibroblast growth factor family and has functions such as fibroblast proliferation and angiogenesis during wounding. Have. In this invention, it has the effect
  • the bFGF used in the present invention may be any of naturally derived bFGF, chemically synthesized bFGF, or genetically modified bFGF.
  • the amino acid sequence and base sequence of human bFGF are registered as GenBank accession number NP_001997.5 and GenBank accession number NM_002006.4.
  • Various commercially available products can be used for bFGF.
  • the culture medium used in this invention when bFGF is already contained in the commercially available culture medium, what is necessary is just to use such a commercially available culture medium as it is.
  • the basic fibroblast growth factor preferably includes a temperature stable basic fibroblast growth factor.
  • the temperature-stable basic fibroblast growth factor is a basic fibroblast growth factor having temperature stability, that is, heat resistance.
  • temperature stability can be imparted by creating a mutant in which a specific amino acid of bFGF is substituted (Q65L, Q65I, Q65V, N111A, N111G, C96S, and C96T). Has been.
  • “Containing always 35 ng / mL or more of basic fibroblast growth factor” means that the concentration of basic fibroblast growth factor is always maintained at or above 35 ng / mL during the culture period, It means that there is no state in which basic fibroblast growth factor is consumed or degraded to be less than 35 ng / mL.
  • the basic fibroblast growth factor concentration in the medium is always 35 ng / mL or more, that is, the basic fibroblast growth factor concentration in the medium is less than 35 ng / mL.
  • Medium containing basic fibroblast growth factor preferably at least 40 ng / mL, more preferably at least 50 ng / mL, even more preferably at least 60 ng / mL, particularly preferably at least 70 ng / mL, most preferably at least 80 ng / mL Pluripotent stem cells are cultured in the medium.
  • concentration of the basic fibroblast growth factor in a culture medium is not specifically limited, Generally, it is 300 ng / mL or less, Preferably it is 200 ng / mL or less. More preferably, it is 150 ng / mL or less.
  • the concentration of basic fibroblast growth factor in the medium can be quantified using a human bFGF ELISA Kit (Sigma) by partially sampling a culture solution of pluripotent stem cells.
  • the basic fibroblast growth factor concentration in the culture is preferably maintained at 40% or more of the basic fibroblast growth factor concentration at the start of the culture, and is maintained at 50% or more. More preferably, it is more preferably maintained at 60% or more, particularly preferably at 70% or more, and most preferably at 80% or more.
  • ⁇ Change or supplement of medium or specific medium components> it is preferable not to perform replacement or supplementation of a medium or a specific medium component for 2 days or more, and it may not be performed for 3 days or more, and may not be performed for 4 days or more.
  • replacement or supplement of a medium or a specific medium component can be performed preferably at intervals of 2 days or more, more preferably 3 days or more, and further preferably 4 days or more.
  • a specific culture medium component For example, a basic fibroblast growth factor can be mentioned.
  • pluripotent stem cells are cultured until the cell concentration becomes 1.4 ⁇ 10 6 cells / mL or more.
  • the pluripotent stem cells are preferably 1.5 ⁇ 10 6 cells / mL or more, more preferably 1.6 ⁇ 10 6 cells / mL or more, more preferably 1.8 ⁇ 10 6 cells / mL or more, and more preferably 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL or more, more preferably 2.3 ⁇ 10 6 cells / mL or more, more preferably 2.6 ⁇ 10 6 cells / mL or more, more preferably 3.0 ⁇ 10 6 cells / mL or more.
  • the upper limit of the cell concentration of pluripotent stem cells is not particularly limited, but is generally 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL or less, preferably 5.0 ⁇ 10 6 cells / mL or less.
  • the culture amount can be appropriately selected according to the number of pluripotent stem cells required.
  • the cell concentration at the start of the three-dimensional culture is preferably 1 ⁇ 10 4 cells / mL or more and 1 ⁇ 10 6 cells / mL or less, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells / mL or more and 2 ⁇ 10 5 cells / mL. Less than mL.
  • Cell concentration and cell number can be measured by the following method. A part of the cell mass in the culture vessel is collected, washed with D-PBS (Dulbecco PBS; PBS indicates phosphate buffered saline), then TrypLE Select (trade name) is added, and the temperature is 37 ° C. for 5 minutes. Treatment is performed to separate the cells into single cells, and the cell concentration is measured by a conventional method. The number of cells in the flask can be determined from the culture volume.
  • D-PBS Dulbecco PBS
  • PBS indicates phosphate buffered saline
  • TrypLE Select trade name
  • the number of cells in the flask can be determined from the culture volume.
  • the number of cells at 4 days after the start of culture is preferably 5 times or more, preferably 10 times or more, and 13 times the number of cells at the start of culture (Day 0). More preferably, it is 14 times or more, more preferably 20 times or more, and further preferably 23 times or more.
  • the number of cells at 8 days after the start of culture is preferably 5 times or more, more preferably 100 times or more, and 200 times the number of cells at the start of culture (Day 0). More preferably, it is 300 times or more, more preferably 400 times or more, and further preferably 500 times or more.
  • a commercially available medium such as mTeSR (registered trademark) 1 (Stemcell Technologies) or StemFlex (registered trademark) can be used.
  • StemFlex registered trademark
  • DMEM Denbecco Modified Eagle medium
  • Knockout trade name
  • D-MEM Invitrogen
  • basal medium When the above-mentioned basal medium is used, alternative serum (KSR; Knockout (trade name) Serum Replacement (Invitrogen)), fetal bovine serum (FBS), non-essential amino acid (NEAA), L-glutamine, 2-mercapto Additive components such as ethanol and antibiotics (eg, streptomycin, penicillin, puromycin, mitomycin) are arbitrarily combined and added to the above basal medium, and further, basic fibroblast growth factor (preferably temperature-stable basic A medium supplemented with fibroblast growth factor) can be used. As the temperature stable basic fibroblast growth factor, for example, FGF-Basic-TS (Thermostable; HumanZyme) can be used, but is not limited thereto.
  • FGF-Basic-TS Thermostable; HumanZyme
  • the conditions of the medium used in the present invention are preferably a serum-free medium and a feeder-free cell medium.
  • the culture conditions for pluripotent stem cells in the present invention are preferably 37 ° C. and 5% CO 2 conditions, but are not particularly limited.
  • the culture is preferably agitated culture, and the rotation speed is not particularly limited, but is preferably 10 to 100 rpm, more preferably 20 to 60 rpm, and further preferably 30 to 50 rpm.
  • the culture vessel used for three-dimensional culture of pluripotent stem cells is not particularly limited, and any tissue culture vessel can be used, but the pluripotent stem cells cultured in the culture vessel are internal. Containers having an internal surface designed so that they cannot adhere or adhere to the surface may be used.
  • Three-dimensional culture of pluripotent stem cells can be performed in a culture system in which culture parameters such as temperature, stirring speed, pH, and CO 2 concentration are controlled.
  • the control of the culture parameters can be performed automatically using a suitable device.
  • a suitable device it does not specifically limit as a culture container, A 30 mL single use bioreactor or a 100 mL single use bioreactor (Able company) etc. can be used.
  • Pluripotent stem cells are grown at 37 ° C. on plates coated with mTeSR1® (Stemcell Technologies), which is a growth medium, and Matrigel®. Culture in an incubator with 5% CO 2 concentration. The medium is replaced with a new medium every day except for the day after seeding.
  • a plate coated with feeder cells may be used instead of a plate coated with Matrigel (registered trademark).
  • MEF cell mouse embryonic fibroblast
  • STO cell mouse embryo fibroblast
  • the cells are separated into single cells. After the number of cells is measured, 0.2 ⁇ 10 5 cells / mL to 5 ⁇ in a medium containing bFGF (preferably temperature-stable bFGF) (particularly preferably, StemFlex® medium (Thermo Fisher)).
  • the cells are adjusted to a concentration of 10 5 cells / mL, preferably 0.5 ⁇ 10 5 cells / mL to 2 ⁇ 10 5 cells / mL, for example 1 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the suspension is added to a culture vessel and cultured with stirring, and the number of revolutions is set to 10 to 100 rpm, and the cells are cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the medium After starting agitation culture as described above, the medium can be changed according to an appropriate schedule. However, as described above, in the present invention, it is preferable not to perform replacement or addition of a medium or a specific medium component for 2 days or more, and it may not be performed for 3 days or more, and may not be performed for 4 days or more. Also good.
  • a cell mass of a predetermined number of cells for example, 1.5 ⁇ 10 6 cells
  • the medium is removed by centrifugation.
  • An enzyme for enzymatically digesting the pluripotent stem cell mass for example, Gentle Cell Dissociation Reagent (Stemcell Technologies)
  • the treatment solution was filtered (for example, 37 ⁇ m Reversible Strainer (Stemcell Technol)).
  • the cell mass can be physically subdivided by centrifugation at a predetermined speed, and the supernatant is separated by centrifugation, followed by addition of a new medium and resuspension, and an appropriate cell concentration (0.
  • pluripotent stem cells can be propagated while maintaining pluripotency (that is, in an undifferentiated state).
  • pluripotency may be evaluated by monitoring pluripotent stem cells. Evaluation of pluripotency (or differentiation status) includes, for example, morphological evaluation and / or expression analysis of pluripotency (undifferentiation) markers (RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), cDNA microarray analysis, flow Cytometry, immunohistochemistry, etc.).
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RNA is collected from cells obtained by sampling a part of the cells in culture, and the gene expression level is evaluated by real-time quantitative PCR using the cDNA obtained by reverse transcription of the collected RNA into cDNA. be able to.
  • pluripotent markers include NANOG, SOX2, POU5F1, DNMT3B, and LIN28, but are not particularly limited. Marker names are as follows. Sox: SRY-boxes POU5F1: POU domain, class 5, transcription factor 1 DNMT3B: DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta
  • the expression level of the above-described pluripotent (undifferentiated) marker in the pluripotent stem cells cultured by the method of the present invention is only a few times as much as the undifferentiated control, and the expression level is hardly changed. This was confirmed in Examples described later.
  • the pluripotent stem cell cultured by the method of the present invention can be placed under culture conditions suitable for differentiation of the pluripotent stem cell into an embryoid body (EB) after the culture.
  • EB embryoid body
  • Pluripotent stem cells cultured by the method of the present invention are removed from the culture and cultured in suspension in the presence of a medium containing serum or a serum substitute and not containing a differentiation inhibitor to form EB. Can be made.
  • the formation of EB can be monitored by a conventional method by morphological evaluation (for example, histological staining) and determination of expression of a differentiation-specific marker. Determination of the expression of the differentiation specific marker can be performed by immunological measurement or RNA expression analysis (for example, RT-PCR, cDNA microarray).
  • ⁇ EB cells can be further obtained by placing them under culture conditions suitable for differentiation and / or proliferation of lineage specific cells.
  • “Culture conditions suitable for lineage-specific cell differentiation and / or proliferation” include culture system (eg, feeder cell layer, feeder-free matrix or suspension culture) and lineage-specific cell differentiation and / or proliferation. It can construct
  • the lineage-specific cell is any cell type of ectoderm, endoderm or mesoderm.
  • Example 1 Culture of iPS cells 1 Human iPS cells (distributed by Cellular Dynamics) were grown on an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 on a plate coated with mTeSR1 (registered trademark) (Stemcell Technologies), which is a growth medium, and Matrigel (registered trademark). Incubated inside. The medium was replaced with a new medium every day except for the day after seeding. Subculture was performed after 4 days of culture. The passage is performed by treating the cells with 0.5 mmol / L EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (Thermo Fisher) for about 7 to 8 minutes, detaching the cells, and separating the cells to an appropriate size by pipetting. Carried out. After the passage operation, the cells were further cultured for 4 days.
  • mTeSR1 registered trademark
  • Matrigel registered trademark
  • the bFGF contained in the mTeSR1 (registered trademark) medium is a recombinant protein that mimics the sequence of natural bFGF
  • the bFGF contained in the StemFlex (registered trademark) is a recombinant protein that has been modified to impart temperature stability. It is. 15 mL of these cell suspensions were added into a 30 mL single-use bioreactor (Able) and stirred and cultured with a dedicated 6-channel magnetic stirrer. The number of revolutions was set to 40 rpm, and the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
  • a cell mass of 1.5 ⁇ 10 6 cells was collected from the obtained cell concentration information, and the medium was removed by centrifugation. After adding Gentle Cell Dissociation Reagent (Stemcell Technologies) and treating for 7 minutes at room temperature, the treatment solution was 37 ⁇ m Reversible Strainer (Stemcell Technologies) at a speed of 1 mL / min. did. After separating the supernatant by centrifugation, 15 mL of mTeSR1 medium or StemFlex (registered trademark) medium containing Y-27632 at a final concentration of 1 mmol / L is added and resuspended, and 1 ⁇ 10 5 cells / mL cells Cells were adjusted to a concentration. 30 mL of the same culture solution was again added to the 30 ml single-use bioreactor, and cultured in the same manner as in “(2) iPS cell culture 2” above.
  • FIG. 1 shows the result of calculating the relative cell number as the growth rate when the number of cells at the start of culture is 1, and Table 2 shows the results of changes in cell concentration and cell number during the culture process.
  • RNA was collected from partially sampled cells using RNeasy Micro Kit (Qiagen) and reverse-transcribed to cDNA using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Thermo Fisher).
  • the resulting cDNA was evaluated by qPCR using Taqman (registered trademark) Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher) and Taqman (registered trademark) Gene Expression Assay (Thermo Fisher) shown in Table 3. .
  • Assay ID in Table 3 is the code name of Probe primer set for performing PCR of a certain gene in Taqman (registered trademark) Gene Expression Assay of Thermo Fisher.
  • the comparison was performed by the ⁇ CT method (Comparative CT method), and the iPS cells before the start of stirring culture were quantified as a reference (undifferentiated control).
  • iPS cells were cultured for 2 weeks in Essential 6 (trade name) medium (Thermo Fisher), and cells that promoted spontaneous differentiation were used (differentiation control).
  • Essential 6 trade name
  • Differentiation control cells that promoted spontaneous differentiation were used (differentiation control).
  • Table 4 The numerical values in Table 4 show the relative expression level when the gene expression level in the undifferentiated control is 1.000.
  • iPS cells cultured in mTeSR1 tend to decrease in proliferation by decreasing the frequency of medium replacement, whereas StemFlex (registered trademark) medium. All of the iPS cells cultured in the medium showed good growth properties, and Example 3 in which the medium was not changed was more proliferative than Comparative Example 1 in which the medium was changed daily with mTeSR1 (registered trademark). It became clear that it was expensive. In addition, it was found that the cell mass cultured in StemFlex (registered trademark) finally yielded a cell culture solution having a very high cell concentration of 3.6 ⁇ 10 6 cells / mL at the maximum.
  • the expression level of the pluripotency-related genes (NANOG, SOX2, POU5F1, DNMT3B, LIN28) in the cell mass of iPS cells cultured under these conditions is only a few times as much as the undifferentiated control. It was confirmed that the expression level hardly fluctuated.
  • iPS cells are cultured in suspension in a StemFlex (registered trademark) medium containing bFGF with temperature stability, and thus show good growth characteristics even when the frequency of medium exchange is reduced, and the properties as iPS cells. It was found that a cell culture solution with a high cell concentration can be obtained while maintaining the above.
  • StemFlex registered trademark
  • Example 2 Quantification of bFGF in the medium
  • a part of the culture solution of iPS cells cultured by the methods of "(2) iPS cell culture 2" and “(3) iPS cell culture 3" above was sampled.
  • the amount of bFGF in the culture medium was quantified using Human bFGF ELISA Kit (Sigma). The results are shown in FIG.
  • bFGF in mTeSR1 decreases to 20 ng / mL or less in one day of culture. This is due to the low stability of natural bFGF in the medium, and it is considered that iPS cells in the flask are not always subjected to growth stimulation by bFGF.
  • bFGF in StemFlex is constantly maintained at a concentration of 35 ng / mL or higher under any condition, and it is considered that iPS cells in the flask continuously receive growth stimulation by bFGF. . From the above, it can be seen that maintaining bFGF at a concentration of at least 35 ng / mL during culture is effective in improving the proliferation of iPS cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明の課題は、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、培地交換の頻度を減少させても、多能性幹細胞が良好な増殖性を維持できる方法を提供することである。本発明によれば、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法が提供される。

Description

多能性幹細胞を三次元培養する方法
　本発明は、多能性幹細胞を三次元培養する方法に関する。
　多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞とも言う）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞とも言う）などが知られている。再生医療分野においては、特にｉＰＳ細胞の実用化に向けた研究が進められている。
　多能性幹細胞の実用化に際しては、多能性幹細胞の三次元大量培養システムを確立することが重要である。非特許文献１には、特定の３次元浮遊撹拌培養装置（バイオリアクター）を用い、適切な撹拌翼の回転数，ｐＨおよび溶存酸素濃度を設定することで、レトロウイルスベクターやエピソーマルベクターなど樹立方法の種類によらず、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）またはＳＮＬフィーダー細胞上およびマトリゲル、ビトロネクチン、ラミニンＥ８フラグメント上で維持されたヒトｉＰＳ細胞を、単一細胞浮遊状態からｍＴｅＳＲ１（登録商標）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商品名）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３を用いて培養することにより、細胞凝集塊形成を介して４日で約５倍、１００ｍＬの培養槽あたり１×１０８個までの未分化細胞増幅が可能となったことが記載されている。
　また、特許文献１には、アスコルビン酸、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する培地が記載されている。特許文献２には、多能性幹細胞を上記の培地中で培養するステップを含む、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法が記載されている。さらに、特許文献２には、 塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、培地中の上記アスコルビン酸の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌであり、かつここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持するためのものである、培地が記載されている。特許文献２には、多能性幹細胞を上記の培地中で培養するステップを含む、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法が記載されている。特許文献３には、ヒト多能性幹細胞の大量生産のための機能ポリマーを含む三次元球状培養システムが記載されている。また、特許文献４には、線維芽細胞増殖因子の熱安定性変異体が報告されている。
特表２０１３－５１０５６７号公報 特開２０１７－２２５４５６号公報 特表２０１５－５３０１０４号公報 特開２０１４－５０７９５１号公報
生物工学、２０１４年、第９２巻、第９号、４８３－４８６頁
　多能性幹細胞を三次元で大量培養する際には、通常、細胞数の増加に従い、完全培地に交換、または追添していく方法が行なわれている。完全培地とは、単独で多能性幹細胞を増殖・維持することが可能な培地である。しかしながら、多能性幹細胞の培養のための培地は高価であることから、上記の方法は高コストである。その解決策として、細胞が消費する成分のみを添加することでコストを低減することが行われている。即ち、この培養方法においては、細胞播種時のシード（Ｓｅｅｄ）培地と翌日以降に補給するフィード（Ｆｅｅｄ）培地とを組み合わせて使用する。しかし、多能性幹細胞を三次元で高い細胞濃度に培養するための手段としては、不十分な場合があった。
　本発明は、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、培地交換、または培地追添の頻度を減少させても、多能性幹細胞が良好な増殖性を維持できる方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞を三次元培養する際に、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養することによって、多能性幹細胞の良好な増殖性を維持しつつ多能性幹細胞を三次元培養できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、
多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法。
（２）　上記塩基性線維芽細胞成長因子が温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含む、（１）に記載の方法。
（３）　培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されている、（１）または（２）に記載の方法。
（４）　培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上の間隔で行う、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（５）　三次元培養の培養開始時における細胞濃度が、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）　培養開始時における細胞数に対して、培養開始から４日後における細胞数が５倍以上である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）　多能性幹細胞が、多能性を維持した状態で増殖される、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
　本発明による多能性幹細胞を三次元培養する方法によれば、培地交換の頻度を減少させても、多能性幹細胞の良好な増殖性を維持することができる。
図１は、培養日数と細胞の増殖率の関係を示す。 図２は、培養日数と培地中のｂＦＧＦ濃度との関係を示す。
　以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
　本発明による多能性幹細胞を三次元培養する方法は、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法である。
＜多能性幹細胞＞
　多能性幹細胞とは、３つの胚葉、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉の全てに分化する能力を有する細胞を示す。
　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好ましい。
　また、多能性幹細胞としては、ヒトまたは霊長動物（例えば、サル）由来の胚性幹細胞が好ましく、ヒト多能性幹細胞がより好ましい。
　胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）としては、ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞を使用することが好ましい。
  胚性幹細胞としては、妊娠後に形成される胚性組織から得られる細胞（例えば、着床前胚盤胞）、着床後期／原腸形成前期の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）、および妊娠期間中の任意の時期、好ましくは妊娠の１０週以前に胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞が挙げられる。
  胚性幹細胞は、周知の方法により入手することができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期まで増殖させることができる。 拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、受精の少なくとも９日後の原腸形成前期の胚盤胞から入手することができる。また、胚性生殖（ＥＧ）細胞は、ヒト胎児の場合には妊娠から約８～１１週目の胎児から得られる始原生殖細胞から調製することができる。
  また、市販の胚性幹細胞を使用することも可能である。ヒト胚性幹細胞は、例えば、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）ヒト胚性幹細胞レジストリー（ＮＩＨ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ）（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより得られる多能性幹細胞である。
　体細胞としては、特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。
  体細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
　体細胞に導入される初期化因子としては特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬ－Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
　また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞へ導入される遺伝子としては、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４およびヒトｃ－Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４およびヒトＬ－Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＮａｎｏｇおよびヒトＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
  初期化因子の遺伝子は、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞に導入することができる。遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
　体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞は、体細胞に初期化因子を導入することによって自ら作製してもよいが、研究機関や企業から提供または販売されている細胞を入手してもよい。即ち、本発明における第一の工程は、人工多能性幹細胞バンクから人工多能性幹細胞を得る工程でもよい。
　例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社から提供されているｉＰＳ細胞を入手して使用することができる。
　また、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から提供されている２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２、１２３１Ａ３、１３８３Ｄ２、１３８３Ｄ６、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１、ＣｉＲＡ０８６Ａｉ－ｍ１、ＣｉＲＡ１８８Ａｉ－Ｍ１、またはｉＲＡ１８８Ａｉ－Ｗ１を入手して、使用することができる。
　さらに、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）やＣａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂａｎｋ　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ等が作成しているｉＰＳ細胞バンクから入手することもできる。
＜三次元培養＞
　三次元培養とは、細胞を播種後に立体的に培養する方法であり、シャーレなどの容器平面上に細胞を接着させて培養する二次元培養とは異なる。三次元培養では、細胞は自発的に立体的な細胞塊、もしくはスフェロイドを形成することができるが、細胞外マトリクスやマイクロキャリアなどの外部基質を介する方法を使用することもできる。三次元培養では細胞塊は液体培地中に浮遊している。浮遊培養とは、多能性幹細胞が、基質の表面に付着するのではなく、培地中に懸濁されている状態での培養である。即ち、浮遊培養においては、浮遊力を得るために培地を撹拌したり、培地中に浮遊力を獲得するためのポリマーを添加することもできる。例えば特許文献３には、セルソースナノフィブリルを含む培地中で、多能性幹細胞を無撹拌状態で三次元培養する方法が開示されている。
＜塩基性線維芽細胞成長因子＞
　本発明においては、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において多能性幹細胞の培養を行う。
　塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βと表記される場合もある）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。
　塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βとしても既知）は、線維芽細胞成長因子ファミリーに属する一種のサイトカインであり、創傷時における線維芽細胞の増殖や血管新生等の機能を有する。本発明においては細胞の未分化維持に寄与する作用を有している。本発明で使用するｂＦＧＦとしては、天然由来のｂＦＧＦ、化学合成したｂＦＧＦ、または遺伝子組換えｂＦＧＦの何れでもよい。例えば、ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９９７．５およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００６．４として登録されている。ｂＦＧＦは、各種の市販品を使用することもできる。
　なお、本発明において使用する培地については後記するが、市販の培地にｂＦＧＦが既に含まれている場合には、そのような市販の培地をそのまま使用すればよい。
　本発明においては、塩基性線維芽細胞成長因子としては、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含むことが好ましい。温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子とは、温度安定性、即ち耐熱性を有する塩基性線維芽細胞成長因子である。天然ｂＦＧＦは３７℃の培養環境下では速やかに分解するが、アミノ酸配列の一部に変異を導入することによって温度安定性を付与した塩基性線維芽細胞成長因子を作製できることが知られている。例えば特許文献４には、ｂＦＧＦの特定のアミノ酸を置換（Ｑ６５Ｌ、Ｑ６５Ｉ、Ｑ６５Ｖ、Ｎ１１１Ａ、Ｎ１１１Ｇ、Ｃ９６Ｓ、およびＣ９６Ｔ）した変異体を作成することで、温度安定性を付与することができることが開示されている。
　「塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む」とは、培養期間中において、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、常に３５ｎｇ／ｍＬ以上に保たれていることを意味し、塩基性線維芽細胞成長因子が消費、または分解されることにより３５ｎｇ／ｍＬ未満になる状態が存在しないことを意味する。本発明においては、培地中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が常時３５ｎｇ／ｍＬ以上であることにより、即ち、培地中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が３５ｎｇ／ｍＬ未満になる状態を生じさせないことにより、多能性幹細胞が良好な増殖性を示すことができるようになる。
　塩基性線維芽細胞成長因子を常時、好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において多能性幹細胞の培養を行う。なお、培地中の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、３００ｎｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であり。より好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
　培地中の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度は、多能性幹細胞の培養液を一部サンプリングし、Ｈｕｍａｎ　ｂＦＧＦ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）などを用いて定量することができる。
　本発明においては、培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されていることが好ましく、５０％以上に維持されていることがより好ましく、６０％以上に維持されていることがさらに好ましく、７０％以上に維持されていることが特に好ましく、８０％以上に維持されていることが最も好ましい。
＜培地、または特定の培地成分の交換または追添＞
　本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上実施しないことが好ましく、３日間以上実施しなくてもよく、４日間以上実施しなくてもよい。本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を、好ましくは２日間以上、より好ましくは３日間以上、さらに好ましくは４日間以上の間隔で行うことができる。特定の培地成分としては、特に限定されないが、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子を挙げることができる。
＜細胞濃度および細胞数＞
　本発明においては、多能性幹細胞を１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する。多能性幹細胞は、好ましくは１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、より好ましくは１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養することができる。
　多能性幹細胞の細胞濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
　本発明においては、必要とする多能性幹細胞の細胞数に応じて、培養量は適宜選択することができる。
　三次元培養の培養開始時における細胞濃度は、好ましくは１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
　細胞濃度および細胞数は以下の方法で測定することができる。培養容器内の細胞塊を一部回収し、Ｄ－ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ；ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を示す）で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）を添加して３７℃、５分処理して細胞をシングルセルに分離し、常法にて細胞濃度を計測する。培養ボリュームからフラスコ内の細胞数を求めることができる。
＜増殖率＞
　本発明においては、培養開始時（Ｄａｙ０）における細胞数に対して、培養開始から４日後（Ｄａｙ４）における細胞数が５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることが好ましく、１３倍以上であることがより好ましく、１４倍以上であることがさらに好ましく、２０倍以上であることがさらに好ましく、２３倍以上であることがさらに好ましい。
　本発明においては、培養開始時（Ｄａｙ０）における細胞数に対して、培養開始から８日後（Ｄａｙ８）における細胞数が５倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることが好ましく、２００倍以上であることがより好ましく、３００倍以上であることがさらに好ましく、４００倍以上であることがさらに好ましく、５００倍以上であることがさらに好ましい。
＜培地＞
　本発明で用いる培地としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）などの市販の培地を使用することができる。但し、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子が含まれているという点から、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）を使用することが好ましい。
　あるいは、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商品名）Ｄ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを使用してもよい。上記した基礎培地を使用する場合には、代替血清（ＫＳＲ；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商品名）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）等の添加成分を任意に組み合わせて上記の基礎培地に添加し、さらに塩基性線維芽細胞成長因子（好ましくは、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子）を添加した培地を使用することができる。温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子は、例えばＦＧＦ-Ｂａｓｉｃ－ＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ；ＨｕｍａｎＺｙｍｅ）を使用できるが、これに限定されない。
　本発明で用いる培地の条件としては、好ましくは、無血清培地であり、かつ無フィーダー細胞培地である。
＜培養条件＞
　本発明における多能性幹細胞の培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２条件下などが好ましいが、特に限定されない。また、培養は、攪拌培養が好ましく、回転数は特に限定されないが、好ましくは１０ｒｐｍ～１００ｒｐｍであり、より好ましくは２０ｒｐｍ～６０ｒｐｍであり、さらに好ましくは３０ｒｐｍ～５０ｒｐｍである。
　多能性幹細胞を三次元培養するために使用される培養容器は、特に限定されず、任意の組織培養容器を使用することができるが、培養容器の中で培養される多能性幹細胞が内部表面に接着または付着できないように設計された内部表面を有する容器を使用してもよい。
　多能性幹細胞の三次元培養は、温度、撹拌速度、ｐＨ、およびＣＯ２濃度などの培養パラメータが制御された培養系において行うことができる。好ましくは、上記培養パラメータの制御は、好適なデバイスを使用して自動的に実行することができる。培養容器としては、特に限定されないが、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターまたは１００ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）等を使用することができる。
＜本発明の具体例＞
　多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞）を、増殖用培地であるｍＴｅＳＲ１（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養する。培地は播種翌日を除き、毎日新しい培地に交換する。なお、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレートの代わりに、フィーダー細胞をコートしたプレートを使用してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胎児繊維芽細胞（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。
　上記の方法で培養した多能性幹細胞を、プロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）など）で処理することにより、細胞をシングルセルまで分離する。細胞数を測定した後、ｂＦＧＦ（好ましくは、温度安定性ｂＦＧＦ）を含む培地（特に好ましくは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）中に０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、例えば、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように細胞を調整する。得られた細胞懸濁液を、培養容器に添加し、攪拌培養する。回転数は１０～１００ｒｐｍに設定し、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養する。
　上記のようにして撹拌培養を開始した後、培地の交換は適当なスケジュールで行うことができる。但し、上記した通り、本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上実施しないことが好ましく、３日間以上実施しなくてもよく、４日間以上実施しなくてもよい。
　培地交換する場合には、所定の細胞数（一例としては、１．５×１０６ｃｅｌｌｓ分）の細胞塊を回収し、遠心分離にて培地を除去する。多能性幹細胞塊を酵素的に消化するための酵素（例えば、Ｇｅｎｔｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｓｏｓｉａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加して処理した後、処理液を濾過器（例えば、３７μｍ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））に所定のスピードで投入し、物理的に細胞塊を細分化することができる。遠心分離にて上清を分離した後、新しい培地を添加して再懸濁し、適当な細胞濃度（０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、例えば、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）になるように細胞を調整する。上記により得られた培養液を再度、培養容器内に添加して培養することができる。
＜多能性の維持＞
　本発明によれば、多能性幹細胞を、多能性を維持した状態で（即ち、未分化状態で）増殖することができる。
  本発明においては、多能性幹細胞をモニタリングして、多能性を評価してもよい。
　多能性（または分化状態）の評価は、例えば、形態学的評価、および／または多能性（未分化）マーカーの発現解析（ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析、フローサイトメトリー、免疫組織化学など）などの手法により行うことができる。
　例えば、培養中の細胞を一部サンプリングすることにより得た細胞からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現量を評価することができる。
　多能性（未分化）マーカー（多能性関連遺伝子）の具体例としては、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＤＮＭＴ３ＢおよびＬＩＮ２８などを挙げることができるが、特に限定されない。
　マーカー名は以下を示す。
Ｓｏｘ：ＳＲＹ－ｂｏｘｅｓ
ＰＯＵ５Ｆ１：ＰＯＵ　ｄｏｍａｉｎ，　ｃｌａｓｓ　５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１
ＤＮＭＴ３Ｂ：ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５－）－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　３　ｂｅｔａ
　本発明の方法で培養された多能性幹細胞における上記した多能性（未分化）マーカーの発現量は、未分化対照と数倍程度の変動にとどまり、発現レベルはほとんど変動していないことが、後記する実施例において確認された。
＜多能性幹細胞の分化＞
　本発明の方法により培養された多能性幹細胞は、その培養後に、多能性幹細胞の胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ：ＥＢ）への分化に適した培養条件下に置くことができる。
　本発明の方法により培養された多能性幹細胞は、その培養物から取り出され、血清または血清代替物を含有しかつ分化阻害因子を含有しない培地の存在下で浮遊培養することにより、ＥＢを形成させることができる。
  ＥＢの形成のモニタリングは、常法により、形態学的評価（例えば組織学的染色）および分化特異的マーカーの発現の判定により、実施できる。分化特異的マーカーの発現の判定は、免疫学的測定またはＲＮＡ発現分析（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイ）により行うことができる。
  ＥＢの細胞はさらに、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くことにより、系統特異的細胞を得ることができる。「系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件」は、培養系（例えば、フィーダー細胞層、無フィーダーマトリックスまたは浮遊培養の何れか）と、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培地との組み合わせにより構築することができる。なお、系統特異的細胞とは、外胚葉、内胚葉または中胚葉の何れかの細胞種である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）ｉＰＳ細胞の培養１
　ヒトｉＰＳ細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社より分譲）は、増殖用培地であるｍＴｅＳＲ１（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新しい培地に交換した。培養４日後に継代を行った。継代操作は、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）で７～８分程度処理して細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。継代操作後、さらに４日間培養を行った。
（２）ｉＰＳ細胞の培養２
　上記の方法で培養したｉＰＳ細胞に対し、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を添加して３７℃、５分処理し、細胞をシングルセルまで分離した。常法にて細胞数を測定した後、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２（和光純薬工業社）を含むｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地、もしくはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）中に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように細胞を調整した。なお、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中に含まれるｂＦＧＦは天然型ｂＦＧＦの配列を模倣したリコンビナントタンパク質であり、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中に含まれるｂＦＧＦは温度安定性を付与する改変を加えたリコンビナントタンパク質である。これらの細胞懸濁液を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）内に１５ｍＬ添加し、専用の６チャンネルマグネチックスターラーで撹拌培養した。回転数は４０ｒｐｍに設定し、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養した。
（３）ｉＰＳ細胞の培養３
　撹拌培養開始以降、表１に記載のスケジュールで培地を全量交換した。培養開始４日後、フラスコ内の細胞塊を一部回収し、下記に示す方法で細胞数を計測した。まずＤ－ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ；ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を示す）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）を添加して３７℃、５分処理して細胞をシングルセルに分離した。常法にて細胞濃度を計測した後、培養ボリュームからフラスコ内の細胞数を計算した。得られた細胞濃度の情報から１．５×１０６ｃｅｌｌｓ分の細胞塊を回収し、遠心分離にて培地を除去した。Ｇｅｎｔｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｓｏｓｉａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加して室温で７分処理した後、処理液を３７μｍ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に１ｍＬ／分のスピードで投入し、物理的に細胞塊を細分化した。遠心分離にて上清を分離した後、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１培地、もしくはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地を１５ｍＬ添加して再懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度になるように細胞を調整した。同培養液を再び３０ｍｌシングルユースバイオリアクター内に３０ｍＬ添加し、上記の「（２）ｉＰＳ細胞の培養２」と同様に培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　培養８日後、上記の「（３）ｉＰＳ細胞の培養３」と同様の方法で細胞濃度、および細胞数を計測し、培養５日後（Ｄａｙ４）の細胞数の結果とあわせて増殖曲線を作成した。培養開始時点での細胞数を１とした時の相対細胞数を増殖率として計算した結果を図１に、培養過程の細胞濃度と細胞数の推移の結果を表２に示す。また一部サンプリングした細胞に対してＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを回収し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）、および表３に記載のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてｑＰＣＲにより遺伝子発現量を評価した。表３のAssay IDに示すものは、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙにて、ある遺伝子のＰＣＲを行うためのＰｒｏｂｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔのコード名である。比較は△△ＣＴ法（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＣＴ法）にて行い、撹拌培養開始前のｉＰＳ細胞をリファレンスとして定量した（未分化対照）。また未分化を逸脱した対照群として、ｉＰＳ細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ６（商品名）培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）で２週間培養し、自発的分化を促した細胞を使用した（分化対照）。結果を表４に示す。表４における数値は、未分化対照における遺伝子発現量を１．０００とした場合の相対発現量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図１および表２の結果から、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中で培養したｉＰＳ細胞は培地交換の頻度を下げることで増殖性が減少していく傾向にあるのに対し、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地中で培養したｉＰＳ細胞はいずれも良好な増殖性を示し、培地交換を実施しなかった実施例３は、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）で毎日培地交換した比較例１と比較して、より増殖性が高いことが明らかとなった。またＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中で培養した細胞塊は最終的に最大３．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬという非常に高い細胞濃度の細胞培養液が得られることがわかった。
　また表４の結果から、これらの条件で培養したｉＰＳ細胞の細胞塊の多能性関連遺伝子（ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＬＩＮ２８）の発現量は未分化対照と数倍程度の変動にとどまり、発現レベルはほとんど変動していないことが確認された。
　以上から、温度安定性を付与したｂＦＧＦを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地でｉＰＳ細胞を浮遊培養することによって、培地交換の頻度を減少させても良好な増殖性を示し、かつｉＰＳ細胞としての性質を維持したまま高い細胞濃度の細胞培養液が得られることがわかった。
＜実施例２＞培地中のｂＦＧＦの定量
　上記の「（２）ｉＰＳ細胞の培養２」および「（３）ｉＰＳ細胞の培養３」の方法で培養したｉＰＳ細胞の培養液を一部サンプリングし、Ｈｕｍａｎ　ｂＦＧＦ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて培地中のｂＦＧＦ量を定量した。結果を図２に示す。
　図２の結果から、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）中のｂＦＧＦは培養１日で２０ｎｇ／ｍＬ以下に低下してしまうことがわかる。これは天然型ｂＦＧＦの培地中での安定性が低いことが要因であり、フラスコ内のｉＰＳ細胞はｂＦＧＦによる増殖刺激を常時受けられていないと考えられる。一方、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中のｂＦＧＦはいずれの条件においても常時３５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を維持しており、フラスコ内のｉＰＳ細胞が持続的にｂＦＧＦによる増殖刺激を受け続けていると考えられる。以上から、ｂＦＧＦを培養中常時３５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度に維持することが、ｉＰＳ細胞の増殖改善に有効であることがわかる。

Claims (7)

  1. 多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、
    多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法。
  2. 前記塩基性線維芽細胞成長因子が温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上の間隔で行う、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 三次元培養の培養開始時における細胞濃度が、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 培養開始時における細胞数に対して、培養開始から４日後における細胞数が５倍以上である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 多能性幹細胞が、多能性を維持した状態で増殖される、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
PCT/JP2019/011644 2018-03-20 2019-03-20 多能性幹細胞を三次元培養する方法 WO2019181999A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980020257.4A CN111886334A (zh) 2018-03-20 2019-03-20 三维培养多能干细胞的方法
JP2020507866A JPWO2019181999A1 (ja) 2018-03-20 2019-03-20 多能性幹細胞を三次元培養する方法
EP19770977.7A EP3770249A4 (en) 2018-03-20 2019-03-20 METHOD OF THREE-DIMENSIONAL CULTIVATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS
US17/025,821 US20210002605A1 (en) 2018-03-20 2020-09-18 Method for three-dimensionally culturing pluripotent stem cell

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-052656 2018-03-20
JP2018052656 2018-03-20

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/025,821 Continuation US20210002605A1 (en) 2018-03-20 2020-09-18 Method for three-dimensionally culturing pluripotent stem cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019181999A1 true WO2019181999A1 (ja) 2019-09-26

Family

ID=67987814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/011644 WO2019181999A1 (ja) 2018-03-20 2019-03-20 多能性幹細胞を三次元培養する方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210002605A1 (ja)
EP (1) EP3770249A4 (ja)
JP (1) JPWO2019181999A1 (ja)
CN (1) CN111886334A (ja)
WO (1) WO2019181999A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4092046A4 (en) * 2020-01-14 2024-03-13 Ajinomoto Kk COMPOSITION OF CELL CULTURE MEDIUM

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013510567A (ja) 2009-11-12 2013-03-28 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
JP2013536696A (ja) * 2010-09-07 2013-09-26 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地
JP2014507951A (ja) 2011-03-01 2014-04-03 ヒューマンザイム インコーポレーテッド 線維芽細胞増殖因子の熱安定性変異体
JP2015530104A (ja) 2012-09-25 2015-10-15 ユー ピー エム キュンメネ コーポレーション 三次元細胞培養

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2441488C (en) * 2005-06-22 2011-10-05 Geron Corp Suspension culture of human embryonic stem cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013510567A (ja) 2009-11-12 2013-03-28 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
JP2017225456A (ja) 2009-11-12 2017-12-28 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
JP2013536696A (ja) * 2010-09-07 2013-09-26 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地
JP2014507951A (ja) 2011-03-01 2014-04-03 ヒューマンザイム インコーポレーテッド 線維芽細胞増殖因子の熱安定性変異体
JP2015530104A (ja) 2012-09-25 2015-10-15 ユー ピー エム キュンメネ コーポレーション 三次元細胞培養

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. NM_002006.4
BIOTECHNOLOGY, vol. 92, no. 9, 2014, pages 483 - 486
LEVENSTEIN, M. E. ET AL.: "Basic Fibroblast Growth Factor Support of Human Embryonic Stem Cell Self- Renewal", STEM CELLS, vol. 24, 2006, pages 568 - 574, XP009133580, doi:10.1634/stemcells.2005-0247 *
See also references of EP3770249A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4092046A4 (en) * 2020-01-14 2024-03-13 Ajinomoto Kk COMPOSITION OF CELL CULTURE MEDIUM

Also Published As

Publication number Publication date
US20210002605A1 (en) 2021-01-07
CN111886334A (zh) 2020-11-03
EP3770249A4 (en) 2021-04-21
EP3770249A1 (en) 2021-01-27
JPWO2019181999A1 (ja) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7053551B2 (ja) 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
JP2022058686A (ja) 多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地
US7790456B2 (en) Scalable process for cultivating undifferentiated stem cells in suspension
Yirme et al. Establishing a dynamic process for the formation, propagation, and differentiation of human embryoid bodies
CN110713973B (zh) 一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法
JP6860539B2 (ja) 幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単離するための、接着シグネチャーベースの方法
JP2007228815A (ja) 胚性幹細胞の維持方法
JP2014082956A (ja) 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法
Son et al. Physical passaging of embryoid bodies generated from human pluripotent stem cells
Burrell et al. Stirred suspension bioreactor culture of porcine induced pluripotent stem cells
US8501474B2 (en) Methods of generating embryoid bodies and uses of same
KR101330327B1 (ko) 줄기세포로부터 생성된 배아체를 대량 증식 및 유지하는 방법
JP6139054B2 (ja) 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法
US20210002605A1 (en) Method for three-dimensionally culturing pluripotent stem cell
Kunova et al. Development of humanized culture medium with plant-derived serum replacement for human pluripotent stem cells
CN112996906A (zh) 脑类器官的制造方法
Bieberich et al. Molecular mechanisms underlying pluripotency
Zhou et al. Species origin of exogenous transcription factors affects the activation of endogenous pluripotency markers and signaling pathways of porcine induced pluripotent stem cells
Bhatia et al. Maintenance of feeder free anchorage independent cultures of ES and iPS cells by retinol/vitamin A
Xie et al. Proliferative feeder cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells
Zhang et al. Feeder layer-and serum-free culture of rhesus monkey embryonic stem cells
Zhu et al. Accelerated three-dimensional neuroepithelium formation from human embryonic stem cells and its use for quantitative differentiation to human retinal pigment epithelium
EP4130238A1 (en) Hepes-containing medium
Burrell Stirred Suspension Bioreactor Culture for the Expansion of Porcine Induced Pluripotent Stem Cells
JP2020115792A (ja) 幹細胞の製造方法、及び癌細胞化のリスク低減方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19770977

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020507866

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019770977

Country of ref document: EP

Effective date: 20201020