KR20110091768A - 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로-캐리어 상에서의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법에 관한 것이다.

Description

마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양{PLURIPOTENT STEM CELL CULTURE ON MICRO-CARRIERS}
본 발명은 출원 번호 제61/116,447호(출원일: 2008년 11월 20일)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 마이크로-캐리어 상에서의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법에 관한 것이다.
만능 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포는 모든 성체 세포 유형으로 분화하는 능력이 있다. 이와 같이, 배아 줄기 세포는 질환, 감염, 또는 선천적 이상의 결과로서 손상된 기관을 위한 대체 세포 및 조직의 공급원일 수 있다. 배아 줄기 세포가 대체 세포 공급원으로 사용될 가능성은 세포의 만능성을 유지하면서 시험관 내에서 세포를 증식시키는 것의 어려움에 의해 방해받는다.
미분화 배아 줄기 세포를 배양하는 현행의 방법은 복잡한 배양 조건, 이를 테면 배아 줄기 세포를 영양세포층(feeder cell layer)의 존재 하에서 배양하는 것을 필요로 한다. 대안적으로, 영양세포 배양으로의 노출에 의해 수득되는 배지를 사용하여 배아 줄기 세포를 배양할 수 있다. 이들 방법을 이용하는 배양 시스템에서는 흔히 배양되고 있는 줄기 세포의 종과는 다른 종으로부터 얻어지는 세포(이종(xenogeneic) 세포)가 사용된다. 또한, 이들 배양 시스템에는 동물 혈청이 보충될 수 있다.
배아 줄기 세포는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 잠재적인 자원을 제공한다. 현재, 인간 배아 줄기 세포주의 대규모 배양은 문제가 있으며, 상당한 난제를 제공한다. 만능 줄기 세포를 증식시키는 현행의 시험관 내 방법은 조직 플라스크 내에서 세포외 매트릭스(ECM) 단백질 또는 영양세포가 사전-코팅된 평탄한 표면 상에 수행된다. 또한, 평면의 배양은 만능 줄기 세포의 장기간 성장을 지지할 수 없는 이들의 제한된 표면 면적 때문에, 종종 계대배양(subculturing)을 필요로 한다. 만능 줄기 세포 배양의 마이크로-캐리어-기반의 방법이 해결책을 제공할 수 있다. 마이크로-캐리어는 높은 표면-면적-대-부피 비를 가지며, 이에 따라, 평탄한 표면 상에서의 만능 줄기 세포 성장의 표면 면적 제한을 없앤다.
예를 들어, 포크(Fok) 등은 미분화 ESC-마이크로-캐리어 및 응집 배양물의 증식을 위한 교반-현탁액 배양 시스템을 개시하였다(문헌[Stem Cells 2005;23:1333-1342])
다른 예에서, 아브란치스(Abranches) 등은 스피너 플라스크(spinner flask)에서 마우스 S25 ES 세포주의 증식을 지지하는 이의 능력을 위해 표면에 콜라겐 층을 갖는, 덱스트란 매트릭스로 제조되는 미공성 마이크로-캐리어인 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)의 시험을 개시하였다(문헌[Biotechnol. Bioeng. 96 (2007), pp. 1211-1221]).
다른 예에서, 제US20070264713호는 미분화 줄기 세포를 현탁 배양하는 과정 및 특히 용기에서 마이크로-캐리어 상에 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였다.
다른 예에서, 제WO2006137787호는 마이크로-캐리어 상에서의 세포의 배양을 위하여 미량역가판과 같은 충실형(solid) 지지체에 부착되는 특정 물질 또는 마이크로-캐리어, 이를 테면 비드를 포함하는 스크리닝 도구가 사용됨을 개시하였다.
다른 예에서, 제WO2008004990호는 배양 중인 줄기 세포의 부착, 생존 및/또는 증식을 증진시키는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 줄기 세포를 양으로 하전된 지지체 표면 상에서 배양하는 것을 포함한다.
다른 예에서, 제WO2007012144호는 지지체 표면; 및 배아 줄기 세포 또는 다능성 세포에 대한 높은 결합 친화도를 특징으로 하는 지지체 표면에 결합된 합성 부착 폴리펩티드를 포함하는 생물반응기(bioreactor)를 개시하였다.
발명의 요약
본 발명은 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 증식시키는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 제1부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 제1부피의 마이크로-캐리어 상에서 배양하는 단계,
c. 만능 줄기 세포를 제1부피의 마이크로-캐리어로부터 제거하는 단계, 및
d. 만능 줄기 세포의 집단을 제2부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 단계.
<도 1>
도 1: Rho-키나아제 저해제가 마이크로-캐리어에 대한 인간 배아 줄기 세포의 부착 및 성장을 증진시킨다. 힐렉스(HILLEX)®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에서 2일 동안 정적 배양으로 성장한 H9 세포의 이미지. 세포를 10μM의 Rho 키나아제 저해제인 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)와 함께, 또는 이것 없이(각각 A 및 B), 인간 배아 섬유아세포 조절 배지(MEF-CM)에서 배양하였다.
<도 2>
도 2: 마이크로-캐리어 상에서 성장한 H9 세포. H9 세포가 다양한 마이크로-캐리어에 부착되게 하고, 37℃에서 락킹 플랫폼(rocking platform)에 두었다. 플라스틱(Plastic) 마이크로-캐리어, 프로넥틴(ProNectin)F 마이크로-캐리어, 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 및 플라스틱 플러스(Plastic Plus) 마이크로-캐리어를 사용하였다(각각 A, B, C, D). 3일 후의 성장에서, 힐렉스®II(Solohill, MI) 상의 세포가 마이크로-캐리어에 대한 최적의 세포 부착을 갖는 것으로 나타났다. 화살표는 마이크로-캐리어에 대한 부착 없이 응집체를 형성하는 세포를 나타낸다.
<도 3>
도 3: 마이크로-캐리어 상에서의 H9 세포 증식. H9 세포를 힐렉스®II 마이크로-캐리어, 프로넥틴F 마이크로-캐리어, 플라스틱 플러스 마이크로-캐리어 및 플라스틱 마이크로-캐리어(Solohill, MI)에 부착시키고, 37℃에서, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 및 MEF-CM의 존재 하에서 락킹 플랫폼 상의 6 웰 디쉬에 두었다. 초기 세포 씨딩 밀도는 0일의 값이다. 3일 및 5일의 세포수를 나타내었다.
<도 4>
도 4: 마이크로-캐리어에 대한 부착 후의 H1 세포 이미지. 3일, 5일 및 7일에, 프로넥틴F 마이크로-캐리어, 플라스틱 플러스 마이크로-캐리어 및 플라스틱 마이크로-캐리어에 부착된 세포의 이미지를 나타내었다. 세포를 37℃에서, 락킹 플랫폼 상의 12 웰 디쉬에서, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)와 함께, MEF-CM에서 성장시켰다. 세포는 플라스틱 플러스 및 플라스틱 마이크로-캐리어에 대한 결합과 독립적으로 응집체를 형성하였다(G, H에서 화살표).
<도 5>
도 5: 마이크로-캐리어에 대한 부착 후의 H1 세포 이미지. 3일, 5일 및 7일에, 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어, 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)에 부착된 세포의 이미지를 나타내었다. 세포를 37℃에서, 락킹 플랫폼 상의 12 웰 디쉬에서, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)와 함께, MEF-CM에서 성장시켰다.
<도 6>
도 6: 마이크로-캐리어 상에서의 H1 세포 증식. H1 세포가 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI), 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ), 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ), 프로넥틴F 마이크로-캐리어(Solohill, MI), 플라스틱 플러스 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 및 플라스틱 마이크로-캐리어(Solohill, MI)에 부착되게 하고, 37℃에서, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 및 MEF-CM의 존재 하에서 락킹 플랫폼 상의 12 웰 디쉬에 두었다. 초기 세포 씨딩 밀도는 0일의 값이다. 3일, 5일 및 7일의 세포수를 나타내었다. 초기 씨딩 밀도는 선으로 나타낸 바와 같이, 13,333개 세포/㎠였다.
<도 7>
도 7: 다양한 농도의 Rho 키나아제 저해제 중에서의 마이크로-캐리어 상의 H9 세포 증식. 세포를 락킹 플랫폼 상의 12 웰 플레이트에서 성장시키고, 4일 및 7일에 카운팅하여, 부착 및 증식 속도를 결정하였다. A. H9 세포를 1, 2.5, 5, 또는 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)와 함께 MEF-CM에서 성장시켰다. B. H9 세포를 0.5, 1, 2.5, 또는 5μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)와 함께 MEF-CM에서 성장시켰다.
<도 8>
도 8: H1 세포를 감소하는 농도의 Rho 키나아제 저해제에서 성장시켰다. H1p38 세포를 0.25 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO), 또는 감소하는 농도(10 μM /5 μM, 2.5 μM /0.5 μM 또는 1.0 μM /0.5 μM)의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 또는 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)의 존재 하에서 2일 동안 지속적으로 성장시켰다. 세포가 힐렉스®II(Solohill, MI), 사이토덱스 1® 또는 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)에 부착되게 하였다(각각 A, B, C). 세포를 씨딩 후 3일, 5일 및 7일에 카운팅하였다.
<도 9>
도 9: 스피너 플라스크에서 상이한 씨딩 밀도에서의 마이크로-캐리어에 대한 세포 부착의 결정. H1 세포를 왼쪽에 기재된 밀도로 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다; 저밀도(0.4 x 104개 세포/㎠), 중간 밀도(1.2 x 104개 세포/㎠) 또는 고밀도(3 x 104개 세포/㎠). 3일, 5일 및 7일에, 세포를 이미지화하고, 세포가 부착된 마이크로-캐리어의 백분율을 결정하였다(이미지 내에 포함).
<도 10>
도 10: 스피너 플라스크에서 마이크로-캐리어 상의 세포 성장은 초기 씨딩 밀도에 의해 영향을 받는다. H1 세포를 왼쪽에 기재된 밀도로 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다; 저밀도(0.4 x 104개 세포/㎠), 중간 밀도(1.2 x 104개 세포/㎠) 또는 고밀도(3 x 104개 세포/㎠). 3일, 5일 및 7일에, 세포를 마이크로-캐리어로부터 해리시키고, 카운팅하였다.
<도 11>
도 11: 스피너 플라스크에서 상이한 씨딩 밀도에서의 마이크로-캐리어 상의 세포 성장 속도의 결정. H1 세포를 상이한 밀도(0일)로 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다; 저밀도(0.4 x 104개 세포/㎠), 중간 밀도(1.2 x 104개 세포/㎠) 또는 고밀도(3 x 104개 세포/㎠). 3일, 5일 및 7일에, 세포를 마이크로-캐리어로부터 해리시키고, 카운팅하였다. 세포 수의 배수 증가를 초기 씨딩 밀도와 비교하여 나타내었다.
<도 12>
도 12: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 성장한 H1 세포를 배양에서 7일 후에 이미지화하였다. 세포에, 3일 이후에 Rho 키나아제 저해제 없이 MEF-CM을 제공하였다. 세포는 마이크로-캐리어에 계속 부착되었다.
<도 13>
도 13: 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에서의 H9 세포 성장 및 H9 세포의 해리. A, B 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에서 6일 동안 성장한 H9 세포의 10x 및 20x 이미지. C, 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 10분 동안 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)로부터 해리시킨 세포의 20x 이미지. D, TrypLE™ 익스프레스를 사용하여 10분 동안 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)로부터 해리시킨 세포의 20x 이미지.
<도 14>
도 14: 마이크로-캐리어로부터의 H9 세포의 해리. 락킹 플랫폼에서 힐렉스®II(Solohill, MI) 상에 성장한 H9 세포를 TrypLE™ 익스프레스 또는 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 해리시켰다. 세포수 및 이들의 생존력을 각각 A 및 B에 나타내었다.
<도 15>
도 15: 마이크로-캐리어로부터의 H1 세포의 해리. 스피너 플라스크에서 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장한 H1 세포를 TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA), 아큐타제(Accutase)™ 또는 콜라게나아제(10mg/ml)를 사용하여 해리시켰다. 세포수 및 이들의 생존력을 각각 A 및 B에 나타내었다.
<도 16>
도 16: 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어 상에서 성장한 H9 세포는 마이크로-캐리어 간에 이동하지 않는다.
<도 17>
도 17: 계대 43의 H9를 5회 계대 동안 스피너 플라스크에서 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다. 세포를 2일 내지 3일마다 카운팅하고, 세포가 1-2 x 105개 세포/㎠에 도달할 때 계대하였다.
<도 18>
도 18: 계대 43의 H9 세포를 5회 계대 동안 스피너 플라스크에서 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장시켰다. 세포를 2일 내지 3일마다 카운팅하고, 세포가 1-2 x 105개 세포/㎠에 도달할 때 계대하였다.
<도 19>
도 19: 형광-활성화된 세포 분류(FACS)는 스피너 플라스크에서 성장한 H9 세포의 만능성을 보여준다. A, 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어 상에 성장한 대부분의 H9 p43 세포는 만능성 단백질을 발현한다. 계대 1 및 3 세포를 TRA-1-81에 대해서 평가하지 않았다. B, 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상에서 성장한 대부분의 H9 p43 세포는 만능성 단백질을 발현한다. 계대 1 세포를 TRA-1-81에 대해서 평가하지 않았다.
<도 20>
도 20: H1 p49 세포를 5회 계대 동안 스피너 플라스크에서 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장시켰다. 세포를 2 내지 3일마다 카운팅하고, 세포가 4-8 x 104개 세포/㎠에 도달할 때 계대하였다.
<도 21>
도 21: 계대 49의 H1 세포를 5회 계대 동안 스피너 플라스크에서 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장시켰다. 세포를 2 내지 3일마다 카운팅하고, 세포가 1-2 x 105개 세포/㎠에 도달할 때 계대하였다.
<도 22>
도 22: 형광 활성화된 세포 분류(FACS)는 스피너 플라스크에서 성장한 H1 세포의 만능성을 보여준다.
<도 23>
도 23: 마이크로-캐리어 상의 H1 및 H9 세포의 집단 배가. 집단 배가 시간을 3일부터 계대 당일(5일, 6일 또는 7일)까지 계산하였다.
<도 24>
도 24: 규정된 배지 내에서 마이크로-캐리어 상에서 배양한 H9 세포. 세포를 힐렉스®II(HII, (Solohill, MI)) 또는 사이토덱스 3®(C3, (GE Healthcare Life Sciences, NJ)) 상에서 배양하였다. 세포를 mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada), 스템프로(StemPro) 또는 MEF-CM 배지 중 하나에서 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. 10 μM의 Y27632(Y, (Sigma-Aldrich, MO)) 또는 2.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(H, (Tocris, MO))를 배지에 첨가하였다. 씨딩 후 3일, 5일 및 7일에 성장 속도를 결정하였다.
<도 25>
도 25: 계대 38의 H1 세포를 규정된 배지에서 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. 세포를 힐렉스®II(HII, (Solohill, MI)) 또는 사이토덱스 3®(C3, (GE Healthcare Life Sciences, NJ)) 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. 세포를 mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada), 스템프로(StemPro) 및 MEF-CM 배지 중 하나에서 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. 10 μM의 Y27632(Y, (Sigma-Aldrich, MO)) 또는 2.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(H, (Tocris, MO))를 배지에 첨가하였다. 씨딩 후 3일, 5일 및 7일에 성장 속도를 결정하였다.
<도 26>
도 26: 계대 50의 H1 세포를 스피너 플라스크에서 규정된 배지와 함께, 힐렉스®II(Solohill, MI)) 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. A, 스피너 플라스크에서 MEF-CM에서 성장한 H1 p50 세포의 3일, 7일 또는 9일 후의 이미지. B, mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에서 성장한 H1 p50 세포의 3일, 7일 또는 9일 후의 이미지. 화살표는 마이크로-캐리어에 부착되지 않은 세포 클러스터를 나타낸다.
<도 27>
도 27: 스피너 플라스크에서 5회 계대한 인간 배아 줄기 세포의 분화. A, 계대 43의 H9 세포를 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 5회 계대하였다. B, 계대 49의 H1 세포를 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 5회 계대하였다. 두 세포 유형 모두를 마이크로-캐리어로부터 방출시키고, 매트리젤(MATRIGEL)(BD Biosciences, CA) 코팅된 플레이트 상으로 씨딩하였다. 80-90% 컨플루언시(confluency)에서, 세포를 배아 줄기 세포를 완성 내배엽으로 분화시킬 수 있는 프로토콜에 노출시켰다. 그 다음, 세포를 완성 내배엽 마커인 CXCR4를 발현하는 세포의 백분율에 대해 FACS로 분석하였다. CXCR4 양성 세포의 백분율은 플롯(plot)의 상측 오른쪽 모서리에 있다.
<도 28>
도 28: 마이크로-캐리어 상의 H1 세포의 완성 내배엽으로의 분화. 여기에서, FACS 플롯은 완성 내배엽 마커인 CXCR4를 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 양성의 백분율은 상측 오른쪽 모서리에 있다. 세포를 모두 처리 전에, 스피너 플라스크에서 마이크로-캐리어 상에 증식시켰다. A, 계대 40의 H1 세포를 분화 전에, 5회 계대 후 6일 동안 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장시켰다. B, 계대 40의 H1 세포를 분화 전에, 1회 계대 후 8일 동안 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에 성장시켰다. C, 계대 50의 H1 세포를 분화 전에, 1회 계대 후 6일 동안 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에 성장시켰다.
<도 29>
도 29: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서의 H1 세포의 완성 내배엽으로의 분화. A, 계대 40의 H1 세포를 8일 동안 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다. B, 계대 40의 H1 세포를 11일 동안 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다. 그 다음, 두 세포 집단 모두를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에서 완성 내배엽으로 분화시켰다. 여기에서, FACS 플롯은 완성 내배엽 마커 CXCR4를 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 양성의 백분율은 상측 오른쪽 모서리에 있다.
<도 30>
도 30: 마이크로-캐리어 상에서 배양한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 완성 내배엽으로의 분화. 양성 CXCR4 세포 백분율에 대한 FACS 결과를 Y-축에 나타내었다. H1 세포를 분화 전에 그리고 분화 중에, 힐렉스®II, 사이토덱스 1® 또는 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다.
<도 31>
도 31: 마이크로-캐리어 상에 배양한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 췌장 내배엽 세포로의 분화. 췌장 내배엽 마커인 Ngn3, Nkx6.1 및 Pdx1에 대한 CT 값을 Y-축에 나타내었다. H1 세포를 DMEM-고 글루코오스(HG) 또는 DMEM-F12(F12) 배지 중 어느 하나에서 힐렉스®II (HII), 사이토덱스 1®(C1) 또는 사이토덱스 3®(C3) 마이크로-캐리어 상에서 분화시켰다. 분화 프로토콜을 13일 지속하였다.
<도 32>
도 32: 마이크로-캐리어 상에 배양한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 호르몬 생성 췌장 세포로의 분화. 췌장 호르몬 세포 마커인 시냅토피신(Synaptophysin), 글루카곤 및 인슐린에 대하여 Y-축에 나타낸 양성 세포 백분율을 FACS로 결정하였다. H1 세포를 2가지 상이한 농도, 10x105(10) 또는 20x105(20)으로 사이토덱스 3®(C-3) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 세포를 4일에서 9일 중에 DMEM-고 글루코오스(HG)에서 분화시키고, 10일에서 24일에 HG 또는 DMEM-F12(F12) 배지 중 어느 하나에서 추가로 분화시켰다.
<도 33>
도 33: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상의 H1 세포의 내분비 세포로의 분화. H1 세포를 췌장 내배엽(14일)을 통해 췌장 내분비 세포로 분화시키고, 췌장 내분비 세포(21일)를 인슐린 발현 세포(28일)로 분화시켰다. Pdx1, 글루카곤 및 인슐린의 유전자 발현 수준을 측정하였다(각각 A, B, C) 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)(C3) 상에서 성장하고 분화한 H1 세포를 매트리젤(BD Biosciences, CA) 코팅된 6 웰 디쉬(평면) 상에서 성장하고 분화한 세포와 비교하였다. 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 성장한 세포에 대한 유전자 발현 값을 3벌로 수행하였다.
<도 34>
도 34: H9 세포를 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다. CXCR4 발현의 FACS 플롯. 완성 내배엽 마커 CXCR4 양성 세포의 백분율을 상측 오른쪽 모서리에 명시한다. A, 계대 39의 H9 세포를 매트리젤(BD Biosciences, CA) 코팅된 6 웰 디쉬 상에서 성장시키고, DE로 분화시켰다. B, C 스피너로부터의 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상의 H9 세포의 2벌의 샘플을 12 웰 디쉬에 두고, 락킹 플랫폼 상에서 인큐베이션하였다.
<도 35>
도 35: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상의 H9 세포의 인슐린 발현 세포로의 분화. H9 세포를 췌장 내배엽(14일)을 통해 췌장 내분비 세포로 분화시키고, 내분비 세포(22일)를 인슐린 발현 세포(29일)로 분화시켰다. Pdx1, 글루카곤 및 인슐린의 유전자 발현 수준을 측정하였다(각각 A, B, C) 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)(C3) 상에서 성장하고 분화한 H9 세포를 매트리젤(BD Biosciences, CA) 코팅된 6 웰 디쉬(평면) 상에서 성장하고 분화한 세포와 비교하였다.
<도 36>
도 36: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 5회 계대 동안 배양한 다음, 지시된 평면 기재 상으로 옮겨 배양하고, Rho 키나아제 저해제의 존재 하에서 배양한 인간 배아 줄기 세포 내의 만능성 유지. 패널 A는 유세포 분석으로 검출된 바와 같은 만능성 마커인 CD9, SSEA3, SSEA4, Tra-160 및 Tra-181의 발현을 도시한 것이다. 패널 B는 리얼-타임(real-time) PCR에 의해 검출된 바와 같은 만능성 마커인 나노그(Nanog), Pou5F1, SOX2 및 ZFP42, 및 분화 마커인 FOXA2, FOXD3, GATA2, GATA4 및 브라키어리(Brachyury)의 발현을 도시한 것이다.
<도 37>
도 37: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 5회 계대 동안 배양한 다음, 지시된 평면 기재 상으로 옮겨 배양하고, Rho 키나아제 저해제의 존재 하에서 배양한 인간 배아 줄기 세포에 의한 완성 내배엽의 형성. 패널 A는 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 CXCR4의 발현을 도시한 것이다. 패널 B는 리얼-타임 PCR에 의해 검출된 바와 같은 지시된 마커의 발현을 도시한 것이다.
<도 38>
도 38: 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 5회 계대 동안 배양한 다음, 프리마리아(PRIMARIA)™ 평면 기재 상으로 옮겨 배양한 인간 배아 줄기 세포에 의한 완성 내배엽의 형성. 지시된 유전자의 발현을 유세포 분석으로 결정하였다.
<도 39>
도 39: 평면 기재 상에서 배양한 인간 배아 줄기 세포는 만능성을 유지한다. TrypLE ™, 아큐타제™, 또는 콜라게나아제로 계대한 H1 인간 ES 세포로부터의 mRNA 샘플을 수집하고, mRNA 만능성 유전자 발현에 대하여 분석하였다. 세포를 MEF 조절 배지에서 매트리젤 상의 배양에서 4일 동안 1회 계대(A), 또는 Rock 저해제가 보충된 MEF 조절 배지에서 프리마리아™ 상의 1회 계대(B), 또는 Rock 저해제가 보충된 MEF 조절 배지에서 프리마리아™ 상의 2 계대(C) 동안 배양하였다.
<도 40>
도 40: Rho 키나아제 저해제인 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에 프리마리아 상에 1:4, 1:8, 또는 1:16의 분리비로, 아큐타제™ 또는 TrypLE™을 사용하여 계대한 프리마리아(p45 초과) 상에서 7회 초과의 계대 동안 성장시킨 H1 인간 배아 줄기 세포를 만능성(A) 및 완성 내배엽으로의 분화능(B)에 대하여 시험하였다. 대조군은 콜라게나아제를 사용하여 계대한 1:30의 매트리젤 상에 성장시킨 H1p48 인간 배아 줄기 세포이다. 10mA= 아큐타제™에 대한 10분 노출로 계대. 10mT= TrypLE™에 대한 10분 노출로 계대. 1:4, 1:8, 또는 1:16은 계대비를 나타낸 것이다. P(X)는 MEF 영양세포로부터 프리마리아™ 플라스틱으로 이동한 이후의 계대수를 나타낸다.
<도 41>
도 41: Rho 키나아제 저해제인 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에 프리마리아 상에 1:4의 비로 아큐타제™ 또는 TrypLE™를 사용하여 계대한 프리마리아(p45 초과) 상에 7회 초과의 계대 동안 성장시킨 H1 인간 배아 줄기 세포를 만능성 마커 및 분화 마커의 mRNA 발현에 대하여 시험하였다. 대조군은 계대 37의 출발 세포 집단이다. 10분 아큐타제™= 아큐타제™에 대한 10분 노출로 계대. P(X)는 MEF 영양세포로부터 프리마리아™ 플라스틱으로 이동한 이후의 계대수를 나타낸다.
<도 42>
도 42: Rho 키나아제 저해제인 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에 프리마리아 상에 1:8의 비로, 아큐타제™ 또는 TrypLE™를 사용하여 계대한 프리마리아™(p45 초과) 상에서 7회 초과의 계대 동안 성장시킨 H1 인간 배아 줄기 세포를 만능성 마커 및 분화 마커의 mRNA 발현에 대하여 시험하였다. 대조군은 계대 37의 출발 세포 집단이다. 10분 아큐타제™ 아큐타제™에 대한 10분 노출로 계대. P(X)는 MEF 영양세포로부터 프리마리아™ 플라스틱으로 이동한 이후의 계대수를 나타낸다.
<도 43>
도 43: Rho 키나아제 저해제인 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에 프리마리아 상에 1:16의 비로, 아큐타제™ 또는 TrypLE™을 사용하여 계대한 프리마리아™(p45 초과) 상에서 7회 초과의 계대 동안 성장시킨 H1 인간 배아 줄기 세포를 만능성 마커 및 분화 마커의 mRNA 발현에 대하여 시험하였다. 대조군은 계대 37의 출발 세포 집단이다. 10분 아큐타제™= 아큐타제™에 대한 10분 노출로 계대. P(X)는 MEF 영양세포로부터 프리마리아™ 플라스틱으로 이동한 이후의 계대수를 나타낸다.
<도 44>
도 44: 프리마리아™ 평면 기재(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에서 성장시킨 다음, 씨딩 3일 후에, 마이크로-캐리어로 전달한 H1 세포의 이미지. A-C H1 세포를 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. D-F 세포를 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상으로 씨딩하였다. A,D H1 세포를 마이크로-캐리어 상으로 전달하기 전에, TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA)로 10분 처리하여, 프리마리아™ 평면 기재(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 플레이트 상에 계대하였다. A,E H1 세포를 마이크로-캐리어 상으로 전달하기 전에, 아큐타제™로 10분 처리하여, 프리마리아™ 평면 기재(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 플레이트 상에 계대하였다. C,F 계대 46의 H1 세포를 마이크로-캐리어 상으로 전달하기 전에, 콜라게나아제(1mg/ml)를 사용하여 매트리젤(BD Biosciences, CA) 코팅된 플레이트 상으로 계대하였다.
<도 45>
도 45: 프리마리아™ 평면 기재(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에서 배양한 다음, 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II 마이크로-캐리어로 전달한 H1 세포의 만능성. FACS 분석은 만능 세포-표면 단백질의 발현을 나타낸다. 세포를 프리마리아™ (카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에서의 계대 중에 3분 내지 10분 동안 아큐타제™ 또는 TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA)로 처리하였다.
<도 46>
도 46: 프리마리아™ (카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에서 증식시킨 다음, 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)로 전달한 H1 세포의 분화. 완성 내배엽 마커인 CXCR4의 세포 표면 발현의 FACS 분석. 세포를 프리마리아™ (카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에서의 계대 중에 3분 내지 10분 동안 아큐타제™ 또는 TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA)로 처리하였다.
<도 47>
도 47: 마이크로-캐리어 상에서의 배양 전에 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성된 평면 기재 상에서 배양한 인간 배아 줄기 세포의 FACS 분석.
<도 48>
도 48: 마이크로-캐리어 상에서의 배양 및 분화 전에 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성된 평면 기재 상에서 배양한 인간 배아 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커 발현의 FACS 분석.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉜다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가-재생하고 분화하여 자가-재생 조상세포(progenitor), 비-재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
다양한 용어가 배양 중인 세포를 설명하기 위하여 사용된다. "유지"는 일반적으로 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어질 수도 있고 이어지지 않을 수도 있다. "계대"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 세포를 하나의 배양 용기로부터 꺼내어 이 세포를 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.
세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양, 즉 조직으로부터 세포를 분리한 후 첫번째 배양을 P0으로 명명한다. 첫번째 계대배양 후에, 세포를 2차 배양으로 기재한다(P1 또는 계대 1). 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대들 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기재, 배지, 성장 조건, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 좌우된다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 또는 Pax6. β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키어리, 믹스-유사(Mix-like) 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽"은 낭배형성 동안에 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며, 위장관을 형성하는 세포 및 이의 파생 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커를 발현한다: CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 또는 SPARC.
본 명세서에 사용되는 "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소더민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, 또는 GATA-6.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기의 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.
마이크로-캐리어
"마이크로-캐리어"는 배양 중인 고정(anchorage) 의존성 세포의 부착 및 성장에 유용한 입자, 비드 또는 펠렛을 말한다. 마이크로-캐리어는 하기의 특성을 갖는다: (a) 이들은 이들이 현탁 배양(마이크로-캐리어 또는 세포에 대한 상당한 전단 손상을 야기하지 않는 교반 속도를 사용)에 사용되게 하기에 충분히 작음; (b) 이들은 충실형이거나, 표면 상에 다공성 코팅이 있는 충실형 코어(core)를 가짐; 및 (c) 이들의 표면(다공성 캐리어의 경우에 외표면 및 내표면)은 양으로 또는 음으로 하전될 수 있음. 일 면에서, 마이크로-캐리어의 전체 입경은 약 150 내지 350 ㎛이며, 양전하 밀도는 약 0.8 내지 2.0 meq/g이다. 유용한 마이크로-캐리어에는 사이토덱스 1®, 사이토덱스 2®, 또는 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
다른 면에서, 마이크로-캐리어는 충실형 캐리어이다. 충실형 캐리어는 부착 세포, 예를 들어, 고정-의존성 세포에 특히 적합하다. 또한, 캐리어 입자는 다공성 마이크로-캐리어일 수 있다.
"다공성 마이크로-캐리어"는 배양 중인 고정 의존성 세포의 부착 및 성장에 유용한 입자를 말한다. 다공성 마이크로-캐리어는 하기의 특성을 갖는다: (a) 이들은 이들이 현탁 배양(마이크로-캐리어 또는 세포에 대한 상당한 전단 손상을 야기하지 않는 교반 속도를 사용)에 사용되게 하기에 충분히 작음; (b) 이들은 세포가 입자의 내부 공간으로 이동하도록 하기에 충분한 크기의 기공 및 내부 공간을 가짐; 및 (c) 이들의 표면(외부 및 내부)은 양으로 또는 음으로 하전될 수 있음. 일련의 일 실시형태에서, 캐리어는 (a) 전체 입경이 약 150 내지 350 ㎛이고; (b) 평균 기공 입구(pore opening) 직경이 약 15 내지 약 40 ㎛인 기공을 가지며; (c) 양전하 밀도가 약 0.8 내지 2.0 meq/g이다. 일부 실시형태에서, 양전하는 DEAE(N,N,-다이에틸아미노에틸)기에 의해 제공된다. 유용한 다공성 마이크로-캐리어에는 사이토포어(Cytopore) 1® 및 사이토포어 2®(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway N.J.)가 포함된다. 마이크로-캐리어는 임의의 형상일 수 있으나, 전형적으로는 대략 구형 형상이며, 거대다공성(macroporous) 또는 미공성이거나 충실형일 수 있다.
다공성 및 충실형 유형의 마이크로-미립자 캐리어 둘 모두는 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 마이크로-캐리어의 예에는 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)이 포함되며, 이들 둘 모두는 지이 헬쓰케어 라이프 사이언스즈(GE Healthcare Life Sciences)로부터의 덱스트란-기제의 마이크로-캐리어이다. 시판 중인 다공성 마이크로-캐리어에는 또한 지이 헬쓰케어 라이프 사이언스즈로부터의 사이토라인(Cytoline)뿐 아니라 사이토포어 제품이 포함된다. 바이오실론(Biosilon)(NUNC) 및 컬티스퍼(Cultispher)(Percell Biolytica)도 또한 상업적으로 입수가능하다. 추가의 면에서, 마이크로-캐리어는 폴리카보네이트 또는 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성되거나, 이로 코팅될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 마이크로-캐리어는 천연 또는 합성-유래의 재료로 구성될 수 있다. 예에는 콜라겐-기제의 마이크로-캐리어, 덱스트란-기제의 마이크로-캐리어, 또는 셀룰로오스-기제의 마이크로-캐리어, 뿐 아니라 유리, 세라믹, 폴리머 또는 금속이 포함된다. 마이크로-캐리어에는 단백질이 없거나, 단백질, 예를 들어 콜라겐으로 코팅될 수 있다. 추가의 면에서, 마이크로-캐리어는 마이크로-캐리어에 대한 세포의 결합을 증진시키고, 마이크로-캐리어로부터의 세포의 방출을 증진시키는 폴리(모노스테아로일글리세리드 코-숙신산), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜리드, 히알루론산나트륨, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 라이신, n-아이소프로필 아크릴아미드, 비트로넥틴을 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물로 구성되거나, 이로 코팅될 수 있다.
세포 배양을 위한 마이크로-캐리어
마이크로-캐리어 배양은 고정 의존성 세포, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포의 실행적인 고수율 배양을 가능하게 만드는 기술이다. 수 밀리리터 내지 1000 리터 초과 범위의 배양 부피로의 인간 배아 줄기 세포와 같은 세포의 배양을 위해 마이크로-캐리어를 특별히 개발하였다. 마이크로-캐리어는 생물학적으로 불활성이며, 교반되는 마이크로-캐리어 배양을 위해 강하나 비-강성인 기재를 제공한다. 마이크로-캐리어는 투명이어서, 부착된 세포의 현미경 검사를 가능하게 할 수 있다. 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)은 가교결합된 덱스트란의 매트릭스에 화학적으로 결합된 변성 콜라겐의 박층으로 구성된다. 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상의 변성 콜라겐 층은 트립신 및 콜라게나아제를 비롯한 다양한 프로테아제(protease)에 의해 분해되기 쉬우며, 최대의 세포 생존력, 기능 및 무결성을 유지하면서 마이크로-캐리어로부터 세포를 제거하는 능력을 제공한다.
단백질이 없는 마이크로-캐리어는 인간 배아 줄기 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제품명 힐렉스®(SoloHill Engineering, Inc., MI.)로 판매되는 제조 및 실험실에서 사용하거나 연구 용도의 마이크로-캐리어는 마이크로-캐리어에 양으로 하전된 표면을 제공하기 위하여 표면에 부착된 양이온성 트라이메틸 암모늄을 갖는 변형된 폴리스티렌 비드이다. 비드 직경은 약 90 내지 약 200 미크론 직경 범위이다.
마이크로-캐리어-기반의 세포 배양 방법은 많은 응용에서 다운스트림 처리의 용이함을 비롯한 많은 이점을 제공한다. 마이크로-캐리어는 전형적으로는 대략 구형 형상이며, 다공성 또는 충실형일 수 있다. 세포 부착을 위한 마이크로-캐리어의 이용은 고정 의존성 세포의 성장을 위한 교반 탱크 및 관련 반응기의 이용을 용이하게 한다. 세포는 용이하게 현탁화되는 마이크로-캐리어에 부착한다. 현탁성(suspendability)에 대한 요건은 마이크로-캐리어의 물리적 파라미터를 제한한다. 따라서, 마이크로-캐리어는 통상적으로 평균 직경이 50-2000 미크론의 범위이다. 일부 응용에서, 충실형 마이크로-캐리어는 약 100 내지 약 250 미크론 범위인 반면, 다공형 마이크로-캐리어는 약 250 내지 약 2500 미크론 범위이다. 이들 크기 범위는 교반되는 반응기에 사용하기에 적절한 특성을 갖는, 현탁액을 형성하기에 충분히 작으면서 많은 고정 의존성 세포를 수용하기에 충분히 큰 마이크로-캐리어의 선택을 가능하게 한다.
마이크로 캐리어 등을 사용하는데 고려되는 인자 중 하나는 부착 효율, 면역원성, 생체적합성, 생분해능, 컨플루언스(confluence)에 도달하는 시간, 단위 표면 면적당 도달가능한 최대 밀도를 포함한 부착된 세포의 성장 파라미터, 필요에 따라 탈리(detachment) 기술 및 탈리 효율, 배양 조건의 확장성뿐 아니라 확대된 조건 하에서 배양의 균질성, 성공적인 탈리 절차의 확대능 및 마이크로-캐리어가 이식에 사용될 것인지의 여부이다. 이들 고려사항은 마이크로-캐리어의 표면 특성뿐 아니라, 마이크로-캐리어의 공극률, 직경, 밀도 및 취급 특성에 의해 영향을 받을 수 있다.
예를 들어, 마이크로-캐리어의 밀도가 고려사항이다. 과도한 밀도는 마이크로-캐리어가 현탁액으로부터 가라앉게 야기할 수 있거나, 완전히 배양 용기의 바닥에 남아 있는 경향이 있어, 반응기에서 세포, 배양 배지 및 기체 상의 불량한 대량의 혼합을 야기할 수 있다. 반면, 너무 낮은 밀도는 마이크로-캐리어의 과도한 부유를 야기할 수 있다. 1.02 내지 1.15 g/㎤의 밀도가 많은 마이크로-캐리어에 전형적이다.
반응기에 첨가될 수 있는 작은 직경의 마이크로-캐리어 및 소정의 부피의 입자는 마이크로-캐리어가 롤러 병(roller bottle)에서, 또는 고정 의존성 세포를 성장시키는 다른 방법, 예를 들어, 플레이트 상에서 관찰되는 것에 비해 굉장히 과도한 실질 표면 면적에 기여하게 한다. 다공성 마이크로-캐리어는 심지어 더 큰 단위 부피 또는 중량당 표면 면적을 제공한다. 이들 다공성 마이크로-캐리어는 고정 의존성 세포의 성장에 이용가능한 큰 공동(cavity)을 갖는다. 이들 공동은 표면 면적을 크게 증가시키고, 전단 응력과 같은 유해한 기계적 영향, 예를 들어 혼합 또는 기체 스파징(sparging)으로부터 세포를 보호할 수 있다.
마이크로-캐리어 표면을 텍스쳐화(textured)하여, 세포 부착 및 증식을 증진시킬 수 있다. 마이크로-캐리어 표면 텍스쳐는 몰딩(molding), 주조(casting), 리칭(leeching) 및 에칭(etching)을 포함하나 이에 한정되지 않는 기술에 의해 달성된다. 텍스쳐화 표면의 형상(feature)의 해상도는 나노스케일일 수 있다. 텍스쳐화 표면을 사용하여, 마이크로-캐리어 표면 상의 특정 세포 정렬을 유도할 수 있다. 또한, 다공성 마이크로-캐리어 내의 기공의 표면을 텍스쳐화하여, 세포 부착 및 증식을 증진시킬 수 있다. 기공 표면 텍스쳐는 몰딩, 주조, 리칭 및 에칭을 포함하나 이에 한정되지 않는 기술에 의해 달성된다.
마이크로-캐리어 표면은 플라스마-코팅되어, 마이크로-캐리어 표면에 특정 전하를 부여할수 있다. 이들 전하는 세포 부착 및 증식을 증진시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 마이크로-캐리어는 온도감응성 폴리머, 이를 테면 폴리-N-아이소프로필아크릴아미드로 구성되거나, 이로 코팅되거나, 또는 전자기계적 특성을 갖는다.
다공형 및 충실형의 마이크로미립자 캐리어 둘 모두는 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 충실형 마이크로-캐리어의 예에는 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ)이 포함되며, 이들 둘 모두는 지이 헬쓰케어 라이프 사이언스즈로부터의 덱스트란-기제의 마이크로-캐리어이다. 시판 중인 다공성 마이크로-캐리어에는 또한 지이 헬쓰케어 라이프 사이언스즈로부터의 사이토라인뿐 아니라 사이토포어 제품이 포함된다. 바이오실론(NUNC) 및 컬티스퍼(Percell Biolytica)도 또한 상업적으로 입수가능하다.
또한, 마이크로-캐리어는 생활성제(bioactive agent)를 함유할 수 있다. 또한, 마이크로-캐리어는 세포 또는 조직 주위(milieu)의 성장 또는 기능을 조절할 수 있는 생활성제를 함유할 수 있고, 이들 인자는 섬유아세포 성장 인자, 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), 혈관 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 골 형성 단백질, 전환 성장 인자, 종양 괴사 인자, 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 완전한 인자, 이의 모방체 또는 활성 단편이 사용될 수 있다.
마이크로-캐리어에 제2의 세포 유형을 접종하고 만능 줄기 세포와 함께 공동-배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 2개 (또는 그 이상)의 세포 유형이 동등한 또는 비-동등한 비율로 개별 마이크로-캐리어에 부착될 수 있다. 둘 이상의 세포 유형을 동시에 마이크로-캐리어 상으로 접종할 수 있거나, 이들을 상이한 시간에 접종할 수 있다. 특정 세포 유형을 마이크로-캐리어의 특정 영역 상으로 우선적으로 부착시키는 방식으로, 마이크로-캐리어를 처리할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 단일 또는 다중의 세포 유형이 부착된 마이크로-캐리어를 현탁 배양한 제2의 세포 유형과 함께 배양 용기에 공동-배양할 수 있다.
제2의 세포 유형에는 예를 들어, 상피 세포(예를 들어, 구강 점막, 위장관, 비강 상피, 기도 상피, 질 상피, 각막 상피), 골수 세포, 지방 세포, 줄기 세포, 각질세포, 멜라닌세포, 피부 섬유아세포, 각질세포, 혈관 내피 세포(예를 들어, 대동맥 내피 세포, 심장 동맥 내피 세포, 폐 동맥 내피 세포, 장골 동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 배꼽 동맥 내피 세포, 배꼽 정맥 내피 세포 및 내피 조상세포(예를 들어, CD34+, CD34+/CD117+ 세포)), 근육모세포, 근육세포, 간세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 기질 세포 및 다른 연조직 세포 또는 조상 세포, 연골세포, 골모세포, 섬세포, 뉴런, 별아교세포, 슈반 세포, 장 아교 세포, 희소돌기아교세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 신경 세포가 포함될 수 있다.
만능 줄기 세포
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈)가 설명한 바와 같이 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다. 비-만능 세포, 예를 들어, 성인 체세포로부터 유래된 만능 줄기 세포도 또한 적합하다.
본 발명에 사용하기에 적합한 마이크로- 캐리어에 대한 만능 줄기 세포의 부착
만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어에 부착시키기 전에, 해당 분야의 임의의 방법에 의해 평면 기재 상에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 세포외 매트릭스 단백질(예를 들어, 매트리젤)로 처리한 평면 기재 상에서 만능 줄기 세포를 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포를 영양세포층을 씨딩한 평면 기재 상에서 배양할 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 대안적인 실시형태에서, 배아 줄기 세포는 인간이다.
본 발명의 일 면에서, 세포를 평면 기재로부터 방출시킬 프로테아제로 만능 줄기 세포를 처리함으로써 만능 줄기 세포를 평면 기재로부터 방출시킨다. 프로테아제는 예를 들어, 콜라게나아제, TrypLE™ 익스프레스, 아큐타제™, 트립신 등일 수 있다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 5분 내지 약 10분 동안 아큐타제™로 처리함으로써, 만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어 기재로부터 방출시킨다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 5분 내지 약 20분 동안 0.05%의 트립신/EDTA로 처리함으로써, 만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어 기재로부터 방출시킨다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 5분 내지 약 20분 동안 TrypLE™ 익스프레스로 처리함으로써, 만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어 기재로부터 방출시킨다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 5분 내지 약 10분 동안 10 mg/ml의 콜라게나아제로 처리함으로써, 만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어 기재로부터 방출시킨다.
방출된 만능 세포를 마이크로-캐리어를 함유하는 배지에 특정 밀도로 첨가한다. 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 마이크로-캐리어 ㎠ 당 약 4,000 내지 약 30,000개 세포로 씨딩한다.
방출된 만능 세포를 마이크로-캐리어를 함유하는 배지에 첨가한다. 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 Rho 키나아제 저해제로 처리함으로써 만능 줄기 세포의 부착이 증진된다. Rho 키나아제 저해제는 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)일 수 있다. 대안적으로, Rho 키나아제 저해제는 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드이다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 1 μM 내지 약 10 μM 농도의 Y27632로 처리한다. 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 10 μM 농도의 Y27632로 처리한다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 0.25 μM 내지 약 5 μM 농도의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드로 처리한다. 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 약 2.5 μM 농도의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드로 처리한다.
마이크로-캐리어를 함유하는 배지를 진탕(agitate)시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 진탕은 배양 배지의 움직임일 수 있다. 이러한 진탕은 수동으로, 또는 대안적으로 예를 들어 락킹 플랫폼, 스피너 플라스크 등과 같은 장치의 사용에 의해 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 마이크로-캐리어를 함유하는 배지를 수동의 움직임의 사용으로 진탕시킨다. 마이크로-캐리어 및 세포를 함유하는 디쉬를 30초 미만 동안 앞뒤로 움직이게 한다.
마이크로-캐리어를 함유하는 배지를 진탕시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 마이크로-캐리어를 함유하는 배지를 스피너 플라스크의 사용으로 진탕시킨다. 스피너 플라스크(Corning, Lowell, MA)를 비드 유형에 따라 30-70 RPM에서 교반 플레이트 상에 둔다.
대안적인 실시형태에서, 마이크로-캐리어를 함유하는 배지를 락킹 플랫폼(Vari-mix, Barnstead, Dubuque, Iowa)의 사용으로 진탕시킨다. 락킹 플랫폼 속도는 2초에 약 1회전이다.
마이크로-캐리어 상에서의 만능 줄기 세포의 분화
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서 증식된 다음, 평탄한 표면 상에서 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서 증식된 다음, 평탄한 표면 상에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 마이크로-캐리어 상에서 증식된 다음, 평탄한 표면 상에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 신경 세포, 심장 세포, 간세포 등으로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2007030870호에 개시된 방법에 따라 신경 전구체 및 심근세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 개시된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의하여 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004 )]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF-3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리되는 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포를 혈청의 부재 하에 액티빈 A를 함유하는 배지에서 배양한 다음, 세포를 액티빈 A 및 혈청과 함께 배양하고, 이어서 세포를 액티빈 A 및 상이한 농도의 혈청과 함께 배양함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리되는 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포를 혈청의 부재 하에 액티빈 A를 함유하는 배지에서 배양한 다음, 세포를 액티빈 및 다른 농도의 혈청과 함께 배양함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리되는 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포를 혈청의 부재 하에 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 배양한 다음, Wnt 리간드를 제거하고, 세포를 액티빈 A 및 혈청과 함께 배양함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리되는 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드(LifeScan, Inc.)에게 허여된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에게 허여된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 저해제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산(Sigma-Aldrich, MO) 및 엑센딘(exendin) 4로 처리한 다음, DAPT(Sigma-Aldrich, MO) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 이어서 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에 세포를 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 배양한 다음, 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 이어서 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 DAPT(Sigma-Aldrich, MO) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 노치 시그널링 경로를 저해하는 인자로 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 노치 시그널링 경로를 저해하는 인자로 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 노치 시그널링 경로를 저해하는 인자로 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 노치 시그널링 경로를 저해하는 인자로 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 면에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 베타, MAFA, PAX4, 또는 PAX6. 본 발명의 일 면에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 마이크로-캐리어 상의 인간 배아 줄기 세포의 부착 및 증식
인간 배아 줄기 세포가 마이크로-캐리어 상에 부착되고 증식될 수 있는지를 결정하기 위하여, TrypLE™ 익스프레스를 사용하여, 매트리젤™(BD Biosciences, CA)으로 코팅된 플레이트로부터 계대 52 H9 세포를 방출시켰다. 그 다음, 이들을 마이크로-캐리어 및 MEF-CM과 함께 인큐베이션하였다. 프로넥틴F(PN), 플라스틱(P), 플라스틱플러스(PP), 힐렉스®II(H), 콜라겐(Col) 및 FACT III(SoloHill, MI) 마이크로-캐리어의 현탁액을 제조처의 지시에 따라 제조하였다. 표 1은 37℃에서 2일 후에, 매일의 이미지를 기준으로 마이크로-캐리어 상의 H9 세포의 부착 및 성장을 기재한 것이다. 시험한 대부분의 마이크로-캐리어 상에 세포가 거의 부착 및/또는 증식하지 않았다. H9 세포는 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에 부착되고 증식하였으나, 이미지에서는 정적 배양에서 2일 후에, 보다 적은 세포-비드 응집체가 나타났다(도 1B).
인간 배아 줄기 세포의 마이크로-캐리어 상에서의 부착 및 증식을 개선시키기 위하여, Rho-관련 코일드 코일(coiled coil) 형성 단백질 세린/트레오닌 키나아제의 소분자 저해제인 Rho 키나아제 저해제를 배지에 첨가하였다. 자세히는, Y27632, Y(Sigma-Aldrich, MO)를 사용하였다. MEF-CM + 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)를 매일 교환하였다. 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)의 존재 하에, H9 세포는 시험한 모든 마이크로-캐리어와 부착하고, 응집체를 형성하였다(표 2). 이미지의 분석으로, 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에서 성장한 인간 배아 줄기 세포는 시험한 다른 마이크로-캐리어 상에서의 인간 배아 줄기 세포보다 더 잘 부착되고 증식하는 것으로 나타났다. 또한, H9 세포는 Rho 키나아제 저해제의 존재 하에서 힐렉스®II(Solohill, MI)에 더 잘 부착되었다(도 1A를 도 1B와 비교).
세포 치료법 응용을 위하여 인간 배아 줄기 세포의 증식은 제품 요구를 만족시킬 필요가 있다. 현행의 증식에 대한 최적의 기술에는 스피너 플라스크 및 생물반응기가 포함된다. 이들 기술 둘 모두는 현탁액 내의 마이크로-캐리어의 물리적 움직임을 필요로 한다. 인간 배아 줄기 세포의 마이크로-캐리어 상에서의 성장에 대한 움직임의 효과를 결정하기 위하여, 6 또는 12 웰 디쉬를 37℃ 인큐베이터 내의 락킹 플랫폼 상에 두었다. 3일 동안의 성장 후에, 세포 응집체가 마이크로-캐리어의 일부로부터 방출하기 시작했다. 도 2 A, B, D는 세포 응집체가 플라스틱 플러스, 플라스틱 또는 프로넥틴 마이크로-캐리어로부터 해리되는 것을 나타낸다. 반면, 세포는 힐렉스® II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)에 계속 부착하고 증식하였다(도 2C). 실시예 4는 비아카운트 플렉스(Viacount Flex)(Guava Technologies, Hayward, CA)를 사용한, 구아바(Guava) PCA-96의 세포 카운팅 전에 사용한 해리 방법을 기재한 것이다. 마이크로-캐리어 상에서의 세포의 성장 속도의 측정으로, 씨딩 시의 출발 숫자에 비하여, 3일의 세포수 하락이 드러났다. 이는 아마도 세포의 마이크로-캐리어에 대한 열악한 초기 부착에 이은 실험을 5일에 종료시킬 때까지의 이후의 증식 때문일 것이다. 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상의 H9 세포는 아마도 세포의 힐렉스® II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)에 대한 더 나은 부착 때문에, 다른 비드 유형에 비해 가장 높은 증식 속도를 갖는다(도 2, 3). 이는 힐렉스® II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)가 현탁액 내의 H9 세포의 성장을 지지할 수 있음을 보여준다. 이를 반복 계대 후에 추가로 입증하였다(실시예 5 참고).
또한, H1 인간 배아 세포주를 대규모 증식을 위한 마이크로-캐리어 상의 성장에 대하여 시험하였다. Rho 키나아제 저해제인 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)가 H9 세포주의 부착에 필요하기 때문에, H1 세포에 대해서도 필요한 것으로 추정된다. 사이토덱스 1®, 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ), 힐렉스®II, 플라스틱, 프로넥틴F, 플라스틱 플러스 마이크로-캐리어(SoloHill Ann Arbor, MI)를 제조처의 지시에 따라 제조하였다. 계대 47의 H1 인간 배아 줄기 세포를 MEF-CM + 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에서 마이크로-캐리어 ㎠당 약 13,333개 세포로 씨딩하였다. 세포 및 마이크로-캐리어를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 12웰 당 15㎠의 12 웰 비-조직 배양 처리된 디쉬(non-tissue culture treated dish)에 두어, 마이크로-캐리어와 배지의 움직임을 허용하였다. 3일, 5일 및 7일 후에, 하나의 웰을 이미지화하고, 수집하고, 카운팅하였다. 세포의 부착능은 비드 유형에 좌우된다. H9 세포주에서와 같이 H1 세포주에서 유사한 결과가 관찰되었다. 자세히는, 플라스틱, 플라스틱 플러스 또는 프로넥틴F 마이크로-캐리어 상으로 씨딩한 세포는 잘 부착 및/또는 증식하지 않았다(도 4). 힐렉스®II(Solohill, MI), 사이토덱스 1®, 또는 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩한 세포는 잘 부착되고 증식하였다(도 5). 세포를 실시예 4에 따라 탈리하고, 수율을 위해 카운팅하였다. 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 성장한 세포는 배양 중에 7일 후에, 가장 높은 세포수를 나타내었다(도 6).
실시예 2: 세포 부착 및 성장을 위한 Y27632 및 다른 Rho 키나아제 저해제의 최적의 농도
인간 배아 줄기 세포의 마이크로-캐리어 상에서의 부착 및 성장을 최적으로 지지하는 Rho 키나아제 저해제의 농도를 결정하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
계대 44의 13,333개 세포/㎠의 H9 세포의 출발 분취물을 12 웰 비-조직 배양 처리된 플레이트의 단일의 웰에 15㎠의 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 세포를 두기 전에 적어도 60분 동안 37℃에 세포를 두었다. 세포를 첨가하기 전에, 힐렉스®II(Solohill, MI) 및 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어를 제조처가 지시한 대로 제조하였다. 세포를 MEF-CM + 소정의 범위의 Rho 키나아제 저해제의 농도, 10, 5, 2.5 또는 1 μM의 Y27632 또는 5, 2.5, 1 또는 0.5 μM의 (S)-(+)-4-글리실-2-메틸-1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀 다이하이드로클로라이드 (글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(H), Tocris, MO)에서 성장시켰다. 배지를 매일 교환하고, 수율 및 생존력을 위하여 한 웰의 세포를 씨딩 후 4일 및 7일에 카운팅하였다(도 7A 및 B). 전체적으로, 2.5 및 1.0 μM이 최적의 부착을 갖는 것으로 나타났으나(4일), 10 또는 5 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)는 최적의 세포 증식을 나타내었다(7일). 5 μM이 최적의 부착을 갖는 것으로 나타났으나(4일), 1 및 0.5 μM 농도의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)은 최적의 세포 증식을 나타내었다(7일).
다음으로, Rho 키나아제 저해제가 아폽토시스를 조장하는 것으로 특징지어져 있기 때문에, Rho 키나아제 저해제의 용량 적정을 시도하였다. 계대 48의 H1 세포를 TrypLE™ 익스프레스를 사용하여 매트리젤™(BD Biosciences, CA) 코팅된 플레이트로부터 해리시켰다. 그 다음, 세포를 12 웰 비-조직 배양 처리된 플레이트의 단일 웰 내로 15㎠ 의 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 힐렉스®II (Solohill, MI), 사이토덱스 1®, 또는 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어를 감소하는 양의 Rho 키나아제 저해제와 함께 시험하였다: 10 μM의 Y27632 (Sigma-Aldrich, MO)를 1일에 사용하고, 이어서 2일에 0.5 μM을 사용(Y10/5 μM); 2.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)를 1일에 사용하고, 이어서 2일에 0.5 μM을 사용(H2.5/0.5 μM); 1 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)를 1일에 사용하고, 이어서 2일에 0.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)를 사용(H1/0.5 μM); 또는 0.25 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드 (Tocris, MO)의 연속 첨가를 MEF-CM에 매일 적용(H0.25 μM). H1 세포 및 마이크로-캐리어를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 두기 전에, 37℃에서 3시간 동안 45분마다 진탕시켰다. 세포를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에서 3일, 5일 및 7일 후에 계수하였다(도 8). 전반적으로 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)의 최적의 농도는 1일에 1-2.5 μM 및 2일에 0.5 μM에 이은 화합물의 투여 중지였다. 세포는 시험한 모든 마이크로-캐리어에 대하여, 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에 비해 이들 농도의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)에서 유사한 성장 속도를 나타냈다. 세포를 0.25 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)에 유지하는 것은 불량한 세포 수율로 이어졌다. 또한, 소량의 Rho-키나아제 저해제를 사용하는 것은 공정에 대한 비용을 줄이는 데 도움이 되며, 세포 증식에 유익할 수 있다. 또한, 이들 데이터는 인간 배아 줄기 세포가 마이크로-캐리어에 계속 부착되고, 증식하기 위하여 Rho 키나아제 저해제를 필요로 하지 않는 것을 나타낸다.
실시예 3: 마이크로-캐리어 상의 부착 및 성장에서의 세포 밀도의 효과
씨딩 밀도를 개선하는 것은 필요한 총 세포수를 줄이기 위한 방법이다. 적절한 씨딩 밀도를 결정하기 위하여, 4x 대물 필드(objective field)당 마이크로-캐리어의 수를 카운팅하였다. H1 세포를 0.4x104개 세포/㎠ (저), 1.2 x104 개 세포/㎠(중간) 또는 3 x104개 세포/㎠(고) 밀도로, MEF-CM + 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에서 사이토덱스 3 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)와 함께 10 cm 플레이트 내로 씨딩하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 45분 마다 진탕시켰다. 세포 및 마이크로-캐리어를 50ml MEF-CM + 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에서 37℃에서 30 rpm에서의 스피너 플라스크(실시예 5에 기재)로 옮겼다. 24시간 후에, 25ml의 MEF-CM를 5 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)와 함께 첨가하였다. 24시간 후에, 회전 속도를 40 rpm으로 증가시켰다. 배양 3일 및 5일에, 75ml 중 50ml을 제거하고, MEF-CM으로 교체하였다. 6시간, 3일, 5일 및 7일에 스피너 플라스크로부터 분취액의 이미지를 취하였다. 세포가 부착된 마이크로-캐리어의 백분율을 도 9 이미지 내의 하측 오른쪽 모서리에 명시하였다. 씨딩 후 3일에, 세포로 코팅된 마이크로-캐리어의 수는 원래의 씨딩 밀도에 상응하였으나, 5일 및 7일에, 세포로 코팅된 마이크로-캐리어의 수는 더 낮은 밀도로 씨딩한 세포에 대해서는 증가하지 않았다. 이는 0.4 x104개 세포/㎠ 가 응집체 내로의 마이크로-캐리어의 도입을 가능하게 하기에 충분한 세포수가 아님을 시사한다. 5일 및 7일에 3 x104개 세포/㎠에서, 세포가 부착된 마이크로-캐리어의 수는 1.2 x104개 세포/㎠로 씨딩한 것과 유사하였다(도 9). 세포수에 주목하는 경우, 더 많은 세포가 높은 밀도의 세포 씨딩으로부터 마이크로-캐리어에 부착되는 것이 명백하다(도 10). 출발 씨딩 세포수에 비한 배수 변화의 분석으로, 높은 밀도로 씨딩한 배양에서 3일 및 5일에 더 많은 수의 세포가 부착되는 것으로 드러났다(도 11). 7일에, 대조군 및 고밀도로 씨딩한 배양은 이들의 출발 씨딩 밀도로부터의 유사한 세포수의 배수 변화를 가졌다. 이들 데이터로부터, 본 발명자들은 1.2 x104개 세포/㎠가 마이크로-캐리어 상의 H1 세포의 효과적인 부착 및 성장을 위한 최소의 세포수인 것으로 단정지었다. 더 높은 씨딩 밀도로 이동하는 것은 세포 증식에 필요한 날수를 줄이는 데 도움이 될 수 있다.
실시예 4: 마이크로-캐리어로부터의 세포의 해리
성장 속도를 결정하기 위하여, 마이크로-캐리어로부터 세포를 해리시키는 것이 필요하였다. Rho 키나아제 저해제인 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)의 제거로, 마이크로-캐리어로부터의 H1 세포의 해리가 야기되지 않았다(실시예 2, 도 12). 마이크로-캐리어로부터의 세포의 해리 전에, 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상의 H9 세포를 10x 및 20x 확대로 이미지화하였다(각각 도 13 A, B). 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상의 H9 세포의 효소 처리로, 생존가능한 세포가 탈리되게 하였다(도 13 C, D 및 도 14). H9 세포를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에, 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)와 함께, 6 웰 디쉬에서 6일 동안 성장시켰다. 마이크로-캐리어에 부착된 세포를 15ml 코니칼(conical) 튜브에 두고, 마이크로-캐리어가 가라앉게 한 후에, 배지를 흡인하였다. 마이크로-캐리어가 중력 침강에 의해 가라앉게 하면서, 가라앉은 마이크로-캐리어를 4 ml의 PBS(마그네슘 및 칼슘 이온 없이)로 3회 세정하였다. PBS를 흡인하고, 1ml의 PBS를 첨가하였다. 세포가 있는 마이크로-캐리어를 12 웰 비-조직 배양 처리된 플레이트의 단일 웰 내로 옮겼다. 플레이트를 소정의 각으로 정지되게 하여, 마이크로-캐리어가 가라앉게 하였다. PBS를 흡입하고, 1 ml의 TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA) 또는 0.05%의 트립신/EDTA를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 10 또는 20분 동안 락킹 플랫폼 상에 두었다. 플레이트를 제거하고, 3ml의 DMEM/F12 또는 MEF-CM을 웰에 첨가하였다. 배지를 격렬하게 피펫팅(pipetted)하여, 세포를 방출시켰다(도 13 C, D). 현미경 하에서의 마이크로-캐리어의 관찰로, 마이크로-캐리어로부터의 세포의 탈리를 결정하였다. 그 다음, 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 흡인하고, 펠렛을 1ml의 DMEM/F12 또는 MEF-CM 배지에 재현탁화하였다. 그 다음, 세포를 비아카운트(Viacount) 염료를 사용하여 구아바 PCA-96(Guava Technologies, Hayward, CA) 상에서 카운팅하였다. 자세하게, 적절한 희석도의 배지에서 200 ㎕ 부피의 세포를 2 ㎕의 비아카운트와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 생존력 및 세포수를 결정하였다(도 14). TrypLE™ 익스프레스 및 트립신/EDTA 둘 모두는 마이크로-캐리어로부터 세포를 효과적으로 해리시켰다.
TrypLE™ 익스프레스가 마이크로-캐리어로부터 세포를 방출시키고, GMP 제품으로서 입수가능하기 때문에, 이를 다른 가능한 해리 제제, 특히, 콜라게나아제 및 아큐타제™(Sigma-Aldrich, MO)에 대하여 시험하였다. H1 p48 세포를 스피너 플라스크(실시예 5)에서 10일 동안 성장시켰다. 그 다음, 마이크로-캐리어를 수집하고, 50ml의 코니컬 튜브로 옮겼다. 세포를 상기와 같이 PBS로 세정하고, 12 웰 플레이트로 옮겼다. PBS를 흡인하고, 1ml의 TrypLE™ 익스프레스, 아큐타제™ 또는 콜라게나아제(10mg/ml)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 5분 또는 10분 동안 두었다. 세포/마이크로-캐리어를 DMEM/F12 중에 격렬히 재현탁화시킨 다음, 해리된 세포 및 마이크로-캐리어를 50ml 코니컬 튜브 위에서 40μM의 세포 스트레이너(strainer)를 통과시켰다. 추가의 2 ml의 배지로 세정하고, 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리하기 전에, 또 스트레이너에 첨가하였다. 그 다음, 세포를 상기와 같이 1ml의 DMEM/F12에 재현탁화시키고, 세포 카운팅을 위해 희석하였다. 세포 생존력은 모든 시험한 효소와 유사하였다. 아큐타제™ 및 TrypLE™ 익스프레스는 5분 및 10분의 인큐베이션에 걸쳐, 유사한 수의 세포를 방출하였다(도 15). 이는 마이크로-캐리어 상의 인간 배아 줄기 세포에 대한 세포 해리 시약으로서의 아큐타제™ 및 TrypLE™ 익스프레스의 적합성을 나타낸다.
실시예 5: 마이크로- 캐리어 상의 미분화 만능 줄기 세포의 증식
마이크로-캐리어 상에서 세포를 증식시키기 위하여, 세포는 마이크로-캐리어로부터 탈리되거나 효소에 의해 해리되고, 새로운 마이크로-캐리어에 재부착될 수 있어야 한다. 마이크로-캐리어 상에서의 전형적인 세포 증식 방법은 세포의 탈리 및 재부착 특성에 의존한다. 하기의 실험으로, 이것이 인간 배아 줄기 세포의 특징이 아님이 나타났다. 자세하게, H9 p43 세포를 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상으로 씨딩하고, 125ml의 스피너 플라스크에서 인큐베이션하였다(하기 참조). 페놀 레드(phenol red)를 배지에 제시하였고, 이를 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)가 취하였다. 8일의 성장 후에, 마이크로-캐리어 상의 세포의 10ml의 분취물을 페놀 레드가 없는 MEF-CM, 440mg의 힐렉스®II 마이크로-캐리어 및 5μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)를 함유하는 새로운 스피너 플라스크에 두었다. 37℃, 30rpm의 회전에서 5일의 배양 후에, 마이크로-캐리어를 제거하고, 이미지를 얻었다(도 16). 나타낸 어두운 마이크로-캐리어는 페놀 레드를 함유하는 배지에서 성장시킨 H9 세포로 덮인 마이크로-캐리어이다. 밝은 마이크로-캐리어는 새로 첨가한 마이크로-캐리어이다. H9 세포가 새로운 마이크로-캐리어와 응집체를 형성하는 것 대신에, H9 세포가 탈리되고 새로운 마이크로-캐리어에 재부착될 것으로 예상하였다. 밝은 마이크로-캐리어는 부착된 세포를 가지지 않았으며, 또한 어두운 마이크로-캐리어와의 응집체도 가지지 않았고, 이는 세포가 탈리되고 마이크로-캐리어에 재부착될 수 없음을 시사한다. 마이크로-캐리어 상에서 성장한 세포를 증식시키기 위하여, 세포를 마이크로-캐리어로부터 효소적으로 해리시켜야 한다(실시예 4 참고).
인간 배아 줄기 세포를 마이크로-캐리어 상으로 증식시킬 수 있는 방법을 이제 확립하였기 때문에, 인간 배아 줄기 세포를 대규모 스피너 플라스크에서 증식시키는 방법을 결정하는 것이 필요하다. 스피너 플라스크는 고밀도 시스템으로 세포가 증식되게 한다. 이는 공간 절약적이며, 생물반응기에서 세포를 증식시키는 첫번째 단계라고 여겨진다. 스피너 플라스크에서 증식하는 인간 배아 줄기 세포의 능력을 시험하기 위하여, H9 계대 43 세포를 125ml의 스피너 플라스크 내로 씨딩하였다. 스피너 플라스크로 옮기기 전에, 세포를 먼저 10cm 플레이트 내에서 마이크로-캐리어에 부착시켰다. 자세하게는, H9 세포를 37℃에서 TrypLE™ 익스프레스와 5분 인큐베이션시켜 2개의 6-웰 디쉬로부터 방출시켰다. TrypLE™ 익스프레스를 사용하여 계대하기 전에, 세포를 콜라게나아제(1mg/ml)를 사용하여 계대하고, 1:30 성장 인자 감소형 매트리젤(Growth Factor Reduced MATRIGEL)™(BD Biosciences, CA)이 코팅된 프레이트 상으로 씨딩하였다. 세포를 DMEM/F12에 재현탁화시키고, 비아카운트를 사용하여 구아바 기기 상에서 카운팅하였다. 원심분리 후에, 3x106개 세포를 MEF-CM + 제조처의 지시에 따라 제조한 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 및 250 ㎠ 의 힐렉스® II 마이크로-캐리어(Solohill, MI)를 함유하는 10cm 플레이트 내로 씨딩하였다. 디쉬를 37℃에 두고, 천천히 회전시키고, 4.5 시간 동안 45분 마다 1회 진탕시켰다. 그 다음, 세포, 마이크로-캐리어 및 배지를 125ml의 스피너 플라스크로 옮겼다. 그 다음, 스피너 플라스크를 MEF-CM + 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)를 사용하여 50 ml로 채우고, 37℃, 40rpm에서 교반 플레이트 상에 두었다. 다음날, 배지를 교환하고, MEF-CM + 5μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)를 사용하여 75ml로 채웠다. 교반 속도를 70rpm으로 증가시켰다. 배지를 Y27632 화합물(Sigma-Aldrich, MO)의 첨가 없이, 격일로 교환하였다. 세포를 실시예 4에 개시된 방법에 따라 계대하고, 3x106개 세포를 250㎠의 새로운 마이크로-캐리어 상으로 다시 씨딩하였다. 배양물이 1-2x105개 세포/㎠의 컨플루언시에 도달했을 때 배양물을 계대하였다. 이를 5회 계대 동안 수행하였다(도 17). 각 계대에서, 만능 마커 발현을 평가하여, 80-95%의 세포가 만능 마커 CD9, SSEA4, SSEA3, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 발현하는 것으로 나타났다(도 19A). 유사한 실험을 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상의 H9 p43 세포로 행하였다(도 18, 19B). 전체적으로, 세포는 힐렉스®II(Solohill, MI) 및 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 마이크로-캐리어 둘 모두에서 잘 증식하였으며, 만능성을 유지하였다. 핵형 분석을 스피너 플라스크에서 5 계대 후에 행하였으며, 1.5%의 세포 내의 염색체 12에서 비정상 3염색체가 나타났다. 이들 세포가 실험의 마지막에 계대 50에 가까웠기 때문에, 이러한 이상의 관찰은 통상적으로 발생하는 것일 수 있다. 더 낮은 세포 계대수로 시작하는 것은 이러한 전제조건을 시험하게 할 수 있다.
유사한 실험을 p48 및 p49의 H1 세포주를 사용하여 행하였다. 회전 속도 및 씨딩 밀도를 제외하고, 모든 파라미터를 동일하게 유지하였다. 스피너 플라스크에 대한 회전 속도는 1일에는 밤새 30 rpm이었고, 모든 추가의 날들에 대하여 40 rpm으로 증가시켰다. 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)에 대한 씨딩 밀도는 약 11,000개 세포/㎠이었으며, 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ)에 대한 씨딩 밀도는 약 7,000개 세포/ ㎠이었다. 씨딩한 세포수를 스피너 플라스크당 3x106개 세포로 일정하게 유지시켰다. 마이크로-캐리어의 중량을 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3®에 대하여 100mg으로 일정하게 고정시켰다. 힐렉스®II 마이크로-캐리어에 대한 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3®의 이점은 이들의 더 큰 표면 면적에 있다. 도 20 및 21는 각각 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3® 상에서의 H1 세포의 증식을 나타낸 것이다. 세포는 5 계대에 걸쳐 만능성을 유지하였다(도 22). 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서의 H1 세포의 핵형 분석으로, 시험한 세포 중 10%에서, Y 염색체의 중복이 드러났다. 이들 H1 세포를 p48에서 마이크로-캐리어 상으로 계대하고, 5 계대 이후에 분석하였다. 평탄한 표면 상에 매트리젤™(BD Biosciences, CA)에서 성장시킨 H1p55 세포는 정상의 핵형을 가졌다. 3일 내지 계대 당일(5일, 6일 또는 7일) 사이의 이들 세포의 배가 속도의 분석으로, 배가 시간의 전체적인 변화가 없는 것으로 나타났다(도 23). 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어 상에서 성장시킨 H1 세포 및 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에서 성장시킨 H9세포가 가장 일관된 배가 시간을 나타내었다(표 3).
실시예 6: 규정된 배지에서 마이크로-캐리어 상의 인간 배아 줄기 세포의 증식
치료 제품을 제조하기 위하여, 인간 배아 줄기 세포 배양 배지로부터 임의의 동물 성분을 제거하는 것이 바람직하다. 현재 인간 배아 줄기 세포를 마우스 배아 섬유아세포(MEF-CM)를 사용하여 조절된 배지에서 매트리젤™(BD Biosciences, CA) 상에 유지시킨다. 매트리젤™(BD Biosciences, CA) 및 MEF-CM 둘 모두는 마우스 세포로부터 유래된다. 또한, MEF-CM은 고가이며, 생성하는 데 시간이 소요되는 배지이다. 인간 배아 줄기 세포를 규정된 배지와 함께 마이크로-캐리어 상에 유지될 수 있는지를 결정하기 위하여, H9 세포를 스템 프로(Stem Pro)(Invitrogen, CA), mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada) 또는 MEF-CM에서 Rho 키나아제 저해제, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 또는 2.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)의 존재 하에, 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 세포를 37℃에서 락킹 플랫폼 상의 12 웰 디쉬에 두었다. 세포를 3일, 5일 및 7일에 카운팅하였다. MEF-CM에서 둘 모두의 비드 유형 상에 성장한 H9 p39 세포는 전형적인 증식 특징을 보였다(도 24). mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에서 성장한 유사한 세포가 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)의 존재 하에 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 잘 증식하였으나, 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에서는 느린 성장 속도를 나타냈다. 20 계대에 걸쳐 스템프로 배지에 순응시킨 계대 64 (H9p64) 세포의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포는 10 μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)의 존재 하에서 힐렉스®II 및 사이토덱스 3® 둘 모두에서 잘 증식하였다. 놀랍게도, 이들 세포는 2.5 μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)의 존재 하에서는 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 잘 증식하지 못했다. 따라서, 마이크로-캐리어 유형, Rho 키나아제 저해제 및 배지가 모두 인간 배아 줄기 세포의 증식능을 결정하는데 역할을 수행한다.
계대 38의 H1 인간 배아 줄기 세포를 12 웰 디쉬에서, mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada) 또는 MEF-CM 내에, Rho 키나아제 저해제, 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO) 또는 2.5μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에서, 사이토덱스 3® 또는 힐렉스®II 마이크로-캐리어 중 하나 상에 씨딩하였다. 세포를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 두었다. 세포를 3일, 5일 및 7일에 카운팅하였다. 마이크로-캐리어 두 유형 모두에서, MEF-CM에서 성장한 세포는 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)의 존재 하에서는 전형적인 증식 특징을 나타내었으나, 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드(Tocris, MO)에서는 사이토덱스 3® 상에서 불량한 성장을 나타내었다(도 25). mTESR 배지(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)는 H1 세포가 Rho 키나아제 저해제 둘 모두의 존재 하에서 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에 증식되게 하였으나, 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서는 낮은 성장 속도를 나타냈다.
H1 p50 세포가 mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에서 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에 잘 증식한다면, 3x106개 세포를 250 ㎠의 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 세포를 37℃에서 10 ㎠의 디쉬에 45분 마다 수동으로 진탕시키면서, 5시간 동안 인큐베이션하였다. mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada) + 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)를 격일로 교환하였다. 이를 MEF-CM에서 성장하는 세포(실시예 5)와 병행하여 행하였다. MEF-CM에서 성장하는 세포와 달리, mTESR 배지(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에서 성장하는 세포는 7일 후에 힐렉스®II 마이크로-캐리어로부터 탈리되기 시작하였다(도 26A를 도 26B와 비교). 이는 인간 배아 줄기 세포가 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상에 계속 부착 및 증식하기 위하여, 추가의 보충물이 mTESR(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에 추가될 필요가 있음을 나타낸다.
실시예 7: 마이크로-캐리어 상의 인간 배아 줄기 세포의 분화
인간 배아 줄기 세포가 마이크로-캐리어 상에서 증식될 수 있기 때문에, 이들 세포의 분화능을 결정해야 한다. 계대 43의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포를 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 5회 계대하였다. 계대 5에서, 세포를 TrypLE™ 익스프레스(실시예 4 참고)를 사용하여 마이크로-캐리어로부터 해리시키기 전에, 마이크로-캐리어 상에서 6일 동안 성장시켰다. 그 다음, 세포를 1:30의 매트리젤™:DMEM/ F12 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포가 플레이트 상에서 80 내지 90%의 컨플루언트가 되면, 이들을 분화제(differentiating agent)에 노출시켰다. 인간 배아 줄기 세포를 RPMI + 100ng/ml의 액티빈 A(PeproTech, NJ), 20ng/ml의 Wnt3a(R&D Biosciences, MN) 및 8ng/ml의 bFGF(PeproTech, NJ)에서, 2%의 알부민 보바인 프랙션 브이 패티 애시드 프리(Albumin Bovine Fraction V Fatty Acid Free)(FAF BSA, MP Biomedicals, Ohio)로 2일 동안 처리하여, 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화를 행하였다. 세포를 RPMI + 100ng/ml의 액티빈 A(PeproTech, NJ) 및 8ng/ml의 bFGF(PeproTech, NJ)에서, 2%의 FAF BSA로 추가 2일 동안 처리하였다. 배지를 매일 교환하였다. 완성 내배엽 세포 표면 마커인 CXCR4에 대하여 FACS 분석을 행하였으며, 세포의 87%가 단백질을 발현하는 것으로 나타났다(도 27A). 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 5회 계대 동안 성장한 계대 49의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 가지고 유사한 실험을 행하였으며, 이로서, 마이크로-캐리어 상에서 분화된 91%의 세포가 CXCR4를 발현하는 것으로 드러났다(도 27B). 이는 마이크로-캐리어 상에서 성장한 세포가 인슐린 생성 세포로의 첫번째 단계인 완성 내배엽으로 분화될 수 있음을 보여준다.
사이토덱스 1®, 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II(Solohill, MI)의 3가지 유형의 마이크로-캐리어는 H1 세포의 부착 및 성장을 허용한다. 이들 3가지 마이크로-캐리어 상에서 H1 세포의 분화를 행하였다. 세포를 다양한 계대수(1 내지 5) 동안 스피너 플라스크(실시예 5) 내에서 이들 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다. 마지막 계대 이후 6일 내지 8일에, 현탁액 중의 마이크로-캐리어 + 세포 분취물을 6 또는 12 웰 플레이트로 옮겼다. 12 웰 플레이트의 웰당 총 15㎠ 의 마이크로-캐리어 + 세포, 또는 6 웰 플레이트당 30㎠의 마이크로-캐리어 + 세포를 옮겼다. 그 다음, 분화 배지를 플레이트 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 락킹 플랫폼에 두었다. 인간 배아 줄기 세포를 RPMI + 100ng/ml의 액티빈 A(PeproTech, NJ), 20ng/ml의 Wnt3a(R&D Biosciences, MN) 및 8ng/ml의 bFGF(PeproTech, NJ)에서 2%의 알부민 보바인 프랙션 브이 패티 애시드 프리(MP Biomedicals, Ohio)로 2일 동안 처리하여, 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화를 행하였다. 세포를 RPMI + 100ng/ml의 액티빈 A(PeproTech, NJ) 및 8ng/ml의 bFGF(PeproTech, NJ)에서 2%의 FAF BSA로 추가 2일 동안 처리하였다. 배지를 매일 교환하였다. 완성 내배엽 세포 표면 마커 CXCR4에 대하여 FACS 분석을 행하였다(도 28). 사이토덱스 1® 및 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에 성장한 세포는 각각 완성 내배엽으로의 분화를 지지하였으나(87% 및 92%), 힐렉스®II 마이크로-캐리어는 본 실험에서 시험한 다른 마이크로-캐리어와 동일한 범위로 분화를 지지하지 않았다(42%).
세포 밀도가 마이크로-캐리어 상에서의 세포의 분화에 영향을 미치는지를 결정하기 위하여, 계대 40의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 스피너 플라스크에서 8일 또는 11일 동안 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에 성장시켰다. 그 다음, 약 15 ㎠의 마이크로-캐리어 + 세포의 등가물을 6 웰 디쉬에 두고, 락킹 플랫폼에 두었다. 그 다음, 세포를 상기와 같이 완성 내배엽 분화 배지에서 인큐베이션하였다. 4일 후에, 세포를 CXCR4 발현에 대하여 FACS로 분석하였다. 스피너 플라스크에서 6일 동안 성장한 세포의 87%가 CXCR4를 발현하였으나, 스피너 플라스크에서 11일 동안 성장한 세포의 56%가 CXCR4를 발현하였다(도 29). 이는 분화 전에 세포를 배양하는 일수가 중요하며, 특히 세포 밀도가 너무 높다면, 세포가 효과적으로 분화되도록 허용하지 않을 수 있음을 보여준다.
인간 배아 줄기 세포가 부착 및 성장에 충분한 것으로 결정된 모든 3가지 마이크로-캐리어 유형 상에서 췌장 내배엽 세포로 분화될 수 있는지를 결정하기 위하여, 계대 41의 인간 배아 줄기 세포주 H1(H1p41)의 세포를 사이토덱스 1®, 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II 마이크로-캐리어(Solohill, MI) 상으로 씨딩하였다(실시예 1 참고). 마이크로-캐리어를 제조처의 지시에 따라 제조하였다. 30㎠의 마이크로-캐리어를 저 부착 6 웰 플레이트로 옮겼다. H1 세포를 제조처의 지시에 따라 TrypLE™ 익스프레스를 사용하여 2개의 10㎠ 플레이트로부터 해리시켰다. 세포를 웰당 5x105개 세포로 씨딩하였다. 비드에 대한 세포의 부착을 실시예 3에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 간단하게, 세포 및 마이크로-캐리어를 37℃에서 4시간 동안 매 시간 잠시 진탕시키면서, 10μM의 Y27632와 함께 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 힐렉스®II 및 사이토덱스 1® 마이크로-캐리어 상의 세포를 락킹 플랫폼 상에 두었다. 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상의 세포가 밤새 동요되지 않고 가라앉게 하였다. 배지를 매일 교환하였으며, 더이상 Y27632를 포함시키지 않았다.
본 실험에서의 불량한 부착 때문에, 사이토덱스 1® 플레이트 내의 대부분의 세포는 더이상 마이크로-캐리어에 부착하지 않았다. 그러나, 더 긴 부착 시간 및/또는 더 짧은 락킹 속도가 세포 부착을 향상시킬 수 있다. 7일 후에, RPMI에서 2%의 지방산이 없는(FAF) BSA(Proliant, IA) 및 하기의 성장 인자를 사용하여, 세포를 완성 내배엽으로 분화시켰다: bFGF(8ng/ml (PeproTech, NJ)), 액티빈 A(100ng/ml (PeproTech, NJ)), Wnt3a(20ng/ml (R&D Biosciences, MN)). 분화 2일부터 4일까지 중에, 세포를 Wnt3a가 결여된 동일한 배지로 처리하였다. 4일 후의 2벌 샘플의 FACS 분석으로, 77-83%의 CXCR4 양성 세포 수준이 드러났다. 완성 내배엽 발현은 상이한 마이크로-캐리어 상에서 성장한 세포 간에 동등하였다. 도 30을 참고한다.
그 다음, DMEM/F12 또는 DMEM-HG + 2%의 FAF BSA(Proliant, IA)에서, FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), KAAD-사이클로파민(0.25μM (Calbiochem, NJ))을 사용하여 세포를 추가로 2일 동안 분화시켰다. 이는 1%의 B-27 보충물(Invitrogen, CA)이 있는 DMEM/F12 또는 DMEM-HG에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), 레틴산(2 μM (Sigma-Aldrich, MO)) 및 KAAD-사이클로파민(0.25 μM (Calbiochem, NJ))으로의 4일의 처리로 이어졌다. 그 다음, 세포를 1%의 B-27 보충물(13일, 췌장 내배엽 (Invitrogen, CA))이 있는 DMEM/F12 또는 DMEM-HG에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), DAPT(1 μM (Sigma-Aldrich, MO)), Alk5 저해제 II(1 μM (Axxora, CA))를 사용하여 3일 동안 분화시켰다. 도 31은 췌장 특이적 유전자인 NKX6.1, PDX1 및 NGN3에 대한 Q-PCR에 의한 발현 수준을 나타낸 것이다. CT 값은 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에서 분화된 세포가 필수 베타 세포 전구체 세포 마커를 발현하도록 효과적으로 분화되지 않음을 명백하게 보여준다. 세포가 모든 3가지 마이크로-캐리어 유형에서 완성 내배엽으로 효과적으로 분화되지만, 췌장 전구체로의 추가의 분화는 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에서는 효과적이지 않다.
인간 배아 줄기 세포가 인슐린 생성 세포로 추가로 분화될 수 있는지를 결정하기 위하여, H1 p45 세포를 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 상에서 성장시키고, 상기와 유사하게 분화시켰다. 간단히 말하면, H1 세포를 제조처의 지시에 따라 TrypLE™ 익스프레스를 사용하여 10㎠ 플레이트로부터 해리시켰다. 세포를 6웰 플레이트 웰당 1 또는 2x106개 세포로 씨딩하였다. 비드로의 세포의 부착은 실시예 3에 기재되어 있다. 간단히 말하면, 세포 및 마이크로-캐리어를 37℃에서 4시간 동안 매시간 잠시 진탕시키면서, 10μM의 Y27632와 함께 MEF 조절 배지에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 밤새 동요되지 않게 인큐베이션되게 하였다. 2일에, 배지를 MEF 조절 배지 + 5uM의 Y27632로 교체하고, 플레이트를 락킹 플랫폼 상에 두었다. 배지를 Y27632 없이 격일로 교환하였다. 5일에, 배지를 bFGF(8ng/ml (PeproTech, NJ)), 액티빈 A(100ng/ml (PeproTech, NJ)), Wnt3a(20ng/ml (R&D Biosciences, MN))의 성장 인자와 함께 완성 내배엽 분화 배지인 RPMI 내의 2%의 지방산이 없는(FAF) BSA(Proliant, IA)로 교체하였다. 분화 2일 및 3일 중에, 세포를 Wnt3a가 결여된 동일한 배지로 처리하였다. 3일 후의 2벌 샘플의 FACS 분석으로, 97-98%의 CXCR4 양성 세포 수준이 드러났다. 그 다음, DMEM-고 글루코오스(HG) + 2%의 FAF BSA(Proliant, IA)에서, FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), KAAD-사이클로파민(0.25μM (Calbiochem, NJ))을 사용하여 세포를 추가로 2일 동안 분화시켰다. 이는 1%의 B-27 보충물(Invitrogen, CA)이 있는 DMEM-HG에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), 레틴산(2μM (Sigma-Aldrich, MO)) 및 KAAD-사이클로파민(0.25μM (Calbiochem, NJ))으로의 4일의 처리로 이어졌다. 그 다음, 세포를 1%의 B-27 보충물(Invitrogen, CA)이 있는 DMEMF-HG 또는 DMEM-F12에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), DAPT(1μM (Sigma-Aldrich, MO)), Alk5 저해제 II(1μM (Axxora, CA))를 사용하여 3일 동안 분화시켰다. 이는 DMEM-HG 또는 DMEM-F12에서의 Alk5 저해제 II(1μM (Axxora, CA))를 사용한 7일 동안의 분화로 이어졌다. 최종 분화는 DMEM-HG 또는 DMEM-F12 각각에서 5일 동안이었다. 총 24일의 분화가 췌장 내분비 호르몬의 발현을 야기한다. 도 32는 이러한 마지막 시점의 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다. 가장 높은 씨딩 밀도를 가지고 6일 내지 24일까지 DMEM-HG에서 분화된 세포가 가장 높은 인슐린 발현 수준을 가졌다(도 32).
대안적으로, 인간 배아 줄기 세포가 인슐린 생성 세포로 분화할 수 있었는지를 결정하기 위하여, H1 p44 세포를 스피너 플라스크에서 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에 7일 동안 성장시켰다(실시예 5 참고). 세포 + 마이크로-캐리어를 15㎠/웰로 12 웰 플레이트로 옮기고, 37℃에서 락킹 플랫폼에 두었다. 세포를 상술된 바와 같이 RMPI 대신 DMEM/F12를 사용하여, 완성 내배엽으로 분화시켰다. 4일 후의 FACS 분석으로, 3벌의 분석에서 75 내지 77%의 CXCR4 양성 세포 수준이 드러났다. 그 다음, DMEM/F12 + 2%의 알부민 보바인 프랙션 브이 패티 애시드 프리에서, FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), KAAD-사이클로파민(0.25μM (Calbiochem, NJ))으로의 3일의 처리로, 세포를 추가로 분화시켰다. 이는 1%의 B-27 보충물(Invitrogen, CA)이 있는 DMEM/F12에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), FGF7(50ng/ml (R&D Systems, MN)), 레틴산(2 μM (Sigma-Aldrich, MO)) 및 KAAD-사이클로파민(0.25 μM (Calbiochem, NJ))으로의 4일의 처리로 이어졌다. 그 다음, 세포를 1%의 B-27 보충물(15일, 췌장 내배엽 (Invitrogen, CA))이 있는 DMEM/F12에서, 노긴(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), 네트린4(100ng/ml (R&D Biosciences, MN)), DAPT(1 μM (Sigma-Aldrich, MO)), Alk5 저해제 II(1 μM (Axxora, CA))를 사용하여 3일 동안 분화시켰다. 이는 1%의 B-27 보충물(21일, 췌장 내분비 세포(Invitrogen, CA))이 있는 DMEM/F12에서 Alk5 저해제 II(1 μM (Axxora, CA))로의 6일의 처리로 이어졌다. 7일 동안의 최종의 처리는 1%의 B-27 보충물(28일, 인슐린 발현 세포(Invitrogen, CA))이 있는 DMEM/F12였다. 도 33은 췌장 특이적 유전자인, 인슐린, Pdx1 및 글루카곤에 대한 Q-PCR에 의한 발현 수준을 나타낸 것이다. 마이크로-캐리어에서의 데이터는 매트리젤™(BD Biosciences, CA) 코팅된 평탄한 표면에서 분화한 H1 p42 세포의 이전의 데이터와 비교한다. 마이크로-캐리어 분화된 세포에 대한 이들 췌장 특이적인 유전자의 발현 수준은 평탄한 표면에서 분화한 세포에 비해, 유사하거나 더 나았다.
H9p38 세포를 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상으로 계대하고, 스피너 플라스크에서 증식시켜, 유사한 실험을 행하였다. 15㎠의 마이크로-캐리어 + 세포의 분취물을 12 웰 플레이트에 두고, 분화 배지와 함께 락킹 플랫폼에 두었다. 이를 매트리젤™(BD Biosciences, CA) 코팅된 6 웰 플레이트 상에 플레이팅한 세포와 비교하였다. RPMI 및 보충물에서 완성 내배엽으로의 세포의 분화를 달성하였으며, 평면 기재 상에서 72%의 세포가 CXCR4를 발현하는 것에 비해 평균 83%의 세포가 CXCR4를 발현하였다(2벌의 샘플)(도 34). 췌장 내배엽(15일), 췌장-내분비 세포(22일) 및 인슐린 발현 세포(29일)로의 추가의 분화로, 평면 기재 상에서 성장한 세포와 마이크로-캐리어 상에서 성장한 세포 간에 유사한 인슐린 및 글루카곤 발현 수준이 나타났다(도 35). 배지 성분은 상기 H1 분화 실험에 대해 열거한 것과 동일하였으며, 추가 1일은 내분비 세포 분화 성분에 있었다. 인슐린 발현 단계에서, 세포는 22일에 비해 인슐린 발현의 놀라운 감소를 보여주었다. 감소가 마이크로-캐리어 및 평면 샘플 둘 모두에서 언급되었기 때문에, 아마도 부착 기재 때문은 아닐 것이다. 이는 H9 세포가 또한 마이크로-캐리어 상에서 적어도 췌장 내분비 세포로 성공적으로 분화될 수 있음을 보여준다.
결국, 2가지 상이한 인간 배아 줄기 세포주인, H1 및 H9는 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 췌장 내분비 세포로 분화될 수 있었으며, 이는 대규모 배양 시스템에서 이들 세포를 증식 및 분화시킬 가능성을 보여준다(도 17, 21, 33 및 35). 인간 배아 줄기 세포는 적어도 3가지의 마이크로-캐리어 비드 유형에 부착되고 증식할 수 있었으며, 세포가 적어도 완성 내배엽으로 분화될 수 있었다(도 28). 이들 결과는 치료적 용도를 위해 인간 배아 줄기 세포를 증식시키고 분화시킬 수 있는 방법을 예증한다.
실시예 8: 3D 마이크로-캐리어 기반의 배양에서 단일 세포로 계대한 인간 배아 줄기 세포를 만능성을 유지하면서 ECM이 없는 표면 상의 배양으로 전달할 수 있다
H1 인간 배아 줄기 세포를 실시예 5에 기재된 방법에 따라 마이크로-캐리어 상에 배양하였다. 세포를 마이크로-캐리어로부터 제거하고, 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드가 보충된 MEFCM16과 함께 넝크(Nunc)4, 넝크13, 셀바인드(CELLBIND)™, 또는 프리마리아(PRIMARIA)™ 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 평탄한 표면으로 플레이팅하였다. 세포를 6 웰 플레이트에 100,000개 세포/㎠의 밀도로 씨딩한 다음, 각각의 표면 상에 추가 1회 계대 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 TrypLE를 사용하여 제거하고, 만능성 마커에 대하여 유세포 분석으로 시험하거나, 또는 mRNA 정제 및 qRT-PCR을 위해 RLT를 사용하여 웰에서 용해시키거나, 완성 내배엽으로 분화시켰다. 세포를 2%의 BSA, 100ng/ml의 액티빈 A, 20ng/ml의 Wnt3a, 8ng/ml의 bFGF 및 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드가 보충된 RPMI 배지로 24시간 동안 처리함으로써, 분화를 유도하였다. 그 다음, 매일 배지를 교환하면서, 추가 48 시간 동안 배지를 2%의 BSA, 100ng/ml의 액티빈 A, 8ng/ml의 bFGF 및 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드가 보충된 RPMI 배지로 교환하였다.
만능성 마커에 의해 측정된 바와 같이, 유세포 분석 또는 qRT-PCR을 사용하여, 마이크로-캐리어 상에서 배양하고, 넝크4, 넝크13, 셀바인드 또는 프리마리아 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 평탄한 표면에서의 배양으로 옮긴 세포는 각각의 평탄한 표면 상에서 2 계대 후에 만능성을 유지하였다(도 36). 또한, 세포는 유세포 분석 또는 qRT-PCR 중 어느 하나에 의해 측정된 바와 같이 완성 내배엽 운명으로의 분화능을 유지하였다(도 37). 또한, 사이토덱스 3® 마이크로-캐리어 상에서 계대하고, 완성 내배엽으로 분화시킨 H1 및 H9 인간 배아 줄기 세포의 병행 시험에서 유사한 결과를 수득하였다(도 38).
이들 결과는 인간 배아 줄기 세포가 마이크로-캐리어 상에서 계대된 다음, 이후에 만능성을 유지하면서 다른 표면 상에서 배양될 수 있음을 나타낸다. 또한, 세포를 다른 표면으로 전달하고, 효과적으로 분화되게 유도할 수 있다.
실시예 9: 인간 배아 줄기 세포는 만능성의 소실 없이, 그리고 섬유아세포 영양세포(feeder) 의 수동의 제거 없이, 적어도 10회 계대 동안 유사분열적 불활성화 섬유아세포 영양세포 상의 클러스터/콜로니 스타일 배양으로부터 ECM이 없는 표면 상에 단일 세포로서의 배양으로 직접 전달될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포주는 현재 배반포로부터의 소수의 세포의 클러스터 또는 단일 세포의 콜로니 생성물을 촉진시키는 방법을 사용하여 유래된다. 그 다음, 세포주를 구성하는 세포의 충분한 클러스터/콜로니를 입수할 수 있을 때까지, 이러한 콜로니 생성물을 연속적으로 계대하고 증식시켰다. 일단 세포주가 유래되면, 인간 배아 줄기 세포의 만능성 및 안정된 핵형 특징을 유지하기 위하여, 인간 배아 줄기 세포의 고품질의 재현가능한 배양을 위한 해당 분야의 현행의 표준은 유사분열적 불활성화 섬유아세포의 영양세포층 상에 인간 배아 줄기 세포의 클러스터/콜로니를 유지하고, 수동의 붕괴 또는 콜라게나아제 또는 중성의 프로테아제 또는 이의 배합물을 사용한 온건한 효소적 대량 계대를 사용하여 세포를 계대하는 것이다. 이들 계대 방법은 인간 배아 줄기 세포 클러스터를 유지하고, 인간 배아 줄기 세포의 콜로니 스타일 성장을 촉진한다. 안정한 인간 배아 줄기 세포주가 확립된 후에, 세포를 세포외 매트릭스(ECM) 기재, 이를 테면 매트리젤™로 전이시킨다. 그러나, 세포가 섬유아세포 영양세포 상에서 성장하던지 ECM 기재 상에서 성장하던지 간에, 인간 배아 줄기 세포를 위해 권고된 계대 방법은 기술자에게 특별히 인간 배아 줄기 콜로니를 완전히 해리하지 않도록 지시한다.
포유류 세포의 대규모 배양을 위한 현행의 최적의 실시는 항상성의 균일한 조건을 엄격히 유지하고, 부착 의존적 세포의 지지를 위하여 마이크로-캐리어를 도입할 수 있는 3-차원 배양 용기를 사용하는 것이다. 그러나, 섬유아세포 영양세포 또는 ECM 기재 상의 인간 배아 줄기 세포 배양 - 성장 및 클러스터/콜로니 스타일 배양을 위해 사용되는 현행의 표준 방법은 만능 인간 배아 줄기 세포 배양물을 마이크로-캐리어 상에서 성공적으로 성장하고 유지시키는데 기술상 장애물을 지니는데, 이는 이들 방법이 마이크로-캐리어 상의 대규모 배양으로 쉽게 전달가능하지 않기 때문이다. 인간 배아 줄기 세포를 마이크로-캐리어 상에서 효과적으로 성장시키기 위하여, 인간 배아 줄기 세포 배양물은 현재 해당 분야에서의 표준 방법과 같이, 콜로니 또는 클러스터가 아닌 단일 세포로 계대될 수 있어야 한다. 또한, 인간 배아 줄기 세포는 영양세포층 또는 ECM 기재 없이 성장할 수 있어야 한다.
본 발명자들은 이들 기술적 장애물을 다루는 방법을 하기에 기재한다. 본 발명자들은 유사분열적 불활성화 섬유아세포 영양세포층 상의 클러스터/콜로니로부터 하부의 섬유아세포 영양세포층 또는 매트리젤로 코팅된 표면 또는 기타 세포외 매트릭스 기재를 필요로 하지 않는 단일의 세포 배양 시스템으로 직접적으로 전환시키는 방법을 기재한다. 이 방법은 임의의 수동의 섬유아세포 영양세포의 제거, 또는 전체 세포 집단으로부터의 만능 세포의 선택 없이, 인간 배아 줄기의 대량 계대를 사용하여, 콜로니 스타일, 섬유아세포 영양세포 기반의 배양으로부터 직접적으로 Rho 키나아제(ROCK) 저해제인 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하에서, 프리마리아 상의 영양세포가 없는/매트릭스가 없는 배양으로 전환시킨다. 이 방법은 밀봉된 용기 내에서 이행하여, 규정상 요건을 준수하고, 만능성 및 완성 내배엽으로의 분화능을 보유하며, 섬유아세포 세포 집단을 함유하지 않는 고도의 균질의 인간 배아 줄기 배양물을 생성할 수 있다.
방법: 배지를 흡인하고, PBS로 세정한 다음, 세포를 해리 효소(콜라게나아제, 아큐타제™ 또는 TrypLE)로 처리함으로써 세포를 통상적으로 계대하였다. 콜라게나아제를 1mg/ml의 농도로 사용하고; 아큐타제™ 또는 TrypLE을 1X 스톡(stock) 농도에서 사용하였다. 모든 효소를 실온에 도달한 후에 사용하였다. DMEM/F12 중의 2%의 BSA 용액을 각 웰에 첨가하고, 세포를 효소로 처리한 후에, 세포를 용액 내에 균일하게 현탁화시켰다. 그 다음, 세포를 200g에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛 및 추가의 DMEM/F12 중의 2%의 BSA 용액을 첨가하여, 세포를 재현탁화시키고, 세포 현탁액을 3개의 50ml 멸균 코니컬 튜브로 분배하고, 200g에서 5분 동안 원심분리하였다.
순차적 방법을 사용하여, 본 발명자들은 MEF 기반의 배양을 아큐타제™, TrypLE™ 또는 콜라게나아제로 처리함으로써, 클러스터/콜로니 스타일 인간 배아 줄기 세포를 프리마리아 표면으로 고밀도 계대함으로써 섬유아세포 영양세포를 제거하였다. 첫번째 계대에서, 세포를 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 조절된 배지(CM) 중의 매트리젤™의 1:30 희석액으로 코팅한 T-25 플라스크에 플레이팅하거나, 세포를 MEF-CM + 3uM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드 중의 T-25 프리마리아™ 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 모든 세포를 1 내지 3.5의 분리비로 플레이팅하고, 세포를 효소에 10분간 노출시켰다. TrypLE™ 또는 아큐타제™를 사용하여 제거한 세포에 대한 세포수를 혈구계산기(hemocytometer)를 사용하여 트립판 블루(trypan blue) 염색 세포를 카운팅함으로써 결정하였다. 세포를 플레이팅한 후에, 배지를 매일 교환하고, MEF-CM+ 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드에 플레이팅한 세포에 MEF-CM + 1μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드를 매일 공급하고, 만능성 및 분화의 mRNA 마커의 발현에 대하여 샘플을 분석하였다. 매트릭스가 없는 조건 하에서 단일 세포로서 2회 계대한 hESC는 만능성 유전자의 유전자 발현을 유지하였으며, 분화 유전자의 발현을 저해하였다(도 39).
2차 계대: TrypLE™ 또는 아큐타제™에 대한 10분 노출을 사용하여 세포를 1 내지 4의 비로 계대하였다. 또한, 본 발명자들은 세포를 처리하고, 탈리에 대해 모니터링함으로써 실험적으로 결정한 더 짧은 효소 노출 시간을 도입하였다. 본 발명자들은 TrypLE™에 대한 3분의 노출 및 아큐타제™에 대한 5분의 노출이 세포를 제거하는데 충분한 것을 관찰하였다. 세포를 효소로 처리한 후에, 세포를 상술된 바와 같이 계대하고, 계대 시 qRT-PCR을 위하여 세포 mRNA의 분취물을 취하였다.
3차 계대: 컨플루언스에 도달하면, 세포를 PBS로 세정하고, 3분 또는 10분(TrypLE™), 또는 5분 또는 10 분(아큐타제™) 동안 효소로 붕괴시키고, DMEM/F12 중의 2%의 BSA에 현탁화시키고, 원심분리하고, DMEM/F12 중의 2%의 BSA로 다시 세정하고, 원심분리한 다음, 그들의 각각의 배지에 재현탁화시키고 플레이팅하였다. 이 계대에서, 세포를 1:4 비 및 또한 2가지 추가의 분리비 - 1:8 및 1:16으로 플레이팅하였다. 세포 mRNA의 분취물을 qRT-PCR을 위해 각 계대에서 취하였다.
4차 계대+: 효소에 대한 노출 시간 및 계대 2 및 3에서의 계대비에 대해 채택된 조건을 계대 4 이후에 유지하였다. 배양이 컨플루언스로 성장하는 때마다, 세포를 PBS로 세정하고, 특정 시간 동안 효소로 붕괴시키고, DMEM/F12 중의 2%의 BSA에 현탁화시키고, 원심분리하고, DMEM/F12 중의 2%의 BSA로 다시 세정하고, 원심분리한 다음, 그들의 각각의 배지에 특정 플래이팅 비로 재현탁화시켰다. 프리마리아에 플레이팅되는 세포를 위한 배지에는 플레이팅 시에 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드를 보충하였다. 플레이팅 후에, 배지를 매일 교환하고, MEF-CM + 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드에 플레이팅한 세포에 매일 MEF-CM + 1μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드를 공급하였다. 계대 시에 세포 mRNA의 분취물을 qRT-PCR을 위해 취하였다.
8회 초과의 계대의 완료 시에, 세포를 만능성 표면 마커에 대한 유세포 분석(도 40) 및 만능성 및 분화 마커에 대한 qRT-PCR(도 41, 42 및 43)로 만능성에 대하여 분석하였다. 또한, 세포를 2%의 BSA, 100ng/ml의 액티빈 A, 20ng/ml의 Wnt3a, 8ng/ml의 bFGF 및 3uM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드로 보충된 RPMI 배지로 24시간 처리함으로써, 세포를 완성 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 매일 배지를 교환하면서, 추가 48 시간 동안 배지를 2%의 BSA, 100ng/ml의 액티빈 A, 8ng/ml의 bFGF 및 3μM의 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드가 보충된 RPMI 배지로 교환하였다. 그 다음, 완성 내배엽으로 분화된 샘플을 유세포 분석으로 완성 내배엽 마커 CXCR4의 존재에 대하여 시험하였다(도 40).
이들 결과는 콜로니 스타일, 섬유아세포 영양세포 기반의 배양으로부터의 Rho 키나아제(ROCK) 저해제인, 글리실-H 1152 다이하이드로클로라이드의 존재 하의 프리마리아 상의 영양세포가 없는/매트릭스가 없는 배양으로의 대량 계대가 만능성 및 완성 내배엽으로의 분화능을 계속 유지하며, 섬유아세포 세포 집단을 함유하지 않는 매우 균질한 인간 배아 줄기 세포 배양을 야기하는 것을 나타낸다.
실시예 10: 조직 배양 플라스틱으로부터 마이크로- 캐리어로 전달한 인간 배아 줄기 세포
H1 세포를 프리마리아™ (카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 조직 배양 플레이트에서 배양하고(실시예 9의 방법), TrypLE™ 익스프레스로 3분 내지 5분 동안 처리하여 방출시키고, MEF-CM + 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에서 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 또는 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어와 함께 6 웰 비-조직 배양 처리된 플레이트에 씨딩하였다. 대조군으로서, 매트리젤(BD Biosciences, CA) 코팅된 플레이트에서 성장하고, 콜라게나아제(1mg/ml)로 계대한 H1p46 세포를 방출시키고, 유사한 방식으로 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하고, 45분 마다 손으로 진탕시켰다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 두었다. 배지를 MEF-CM + 10μM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)로 매일 교환하였다. 이미지는 3일에 마이크로-캐리어에 대한 세포의 뛰어난 부착을 나타낸다(도 44). 7일 후에, 세포를 방출시키고(상기 실시예 4에 기재된 바와 같이) 만능성 마커 CD9, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81에 대하여 FACS로 분석하였다(도 45). 만능성 마커의 대부분을 90-100%의 세포에 발현시켰다. 아큐타제™(Millipore, MA) 및 TrypLE™ 익스프레스(Invitrogen, CA)을 사용하여 계대한 세포간에 또는 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 및 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어를 사용한 성장 간에 명백한 차이가 없었다. 종합하면, 세포는 프리마리아™(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 세포 배양 플라스틱으로부터 마이크로-캐리어 상으로 전달되는 경우 만능성을 유지하였다.
다음으로, 마이크로-캐리어 상의 이들 H1 세포를 완성 내배엽으로 분화시켰다. 이 방법은 실시예 7에 기재되어 있다. 분화 4일 후에, H1 세포를 마이크로-캐리어로부터 방출시키고, FACS 분석을 수행하여, 82% 초과의 세포가 CXCR4를 발현하는 것으로 나타났다. 도 46을 참고한다. 세포는 마이크로-캐리어 유형 또는 프리마리아™(카달로그 번호 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서의 계대 효소에 상관 없이, 완성 내배엽으로 효과적으로 분화되었다. 이는 증식 시스템의 융통성을 입증하며, 세포가 플라스틱 상의 매트릭스 및 마이크로-캐리어 없이 성장하게 한다.
실시예 11: 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성된 평면 기재로부터 마이크로- 캐리어로 전달한 인간 배아 줄기 세포
H1 세포를 미국 특허 출원 제61/116,452호에 기재된 방법에 따라, 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성된 평면 기재 상에 12 계대 동안 배양하였다. 세포를 TrypLE™ 익스프레스로 3분 내지 5분 동안 처리하여 평면 기재로부터 방출시키고, MEF-CM + 10mM의 Y27632(Sigma-Aldrich, MO)에서 사이토덱스 3®(GE Healthcare Life Sciences, NJ) 또는 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어와 함께 6 웰 비-조직 배양 처리된 플레이트에 씨딩하였다. 대조군으로서, 매트리젤™ 코팅된 플레이트(BD Biosciences, CA)에서 성장하고, 콜라게나아제(1mg/ml)로 계대한 H1p44 세포를 방출시키고, 유사한 방식으로 마이크로-캐리어 상으로 씨딩하였다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하고, 45분 마다 손으로 진탕시켰다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 락킹 플랫폼 상에 두었다. 배지를 매일 교환하였다. 7일 후에, 세포를 방출시키고(실시예 4에 기재된 바와 같이) 만능성 마커 CD9, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81에 대하여 FACS로 분석하였다(도 47). 대부분의 만능성 마커가 90% 초과의 세포에서 발현하였다. 사이토덱스 3® 및 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상에서 성장한 세포 간에는 명백한 차이가 없었다. H1p44 대조군 세포를 힐렉스®II 마이크로-캐리어 상의 성장 후에 만능성에 대하여 시험하지 않았는데, 이는 만능성이 다른 실험으로 확인되었기 때문이다(실시예 5 참고). 종합적으로, 세포는 혼합 셀룰로오스 에스테르로 구성된 평면 기재로부터 마이크로-캐리어 상으로 전달되는 경우 만능성을 유지하였다.
다음으로, 마이크로-캐리어 상의 H1 세포를 실시예 7에 기재된 방법에 따라 완성 내배엽으로 분화시켰다. 분화 4일 후에, H1 세포를 마이크로-캐리어로부터 방출시키고, FACS 분석을 수행하여, 65% 초과의 세포가 CXCR4를 발현하는 것으로 나타났다(도 48). 마이크로-캐리어 유형과 상관없이, 세포를 완성 내배엽으로 효과적으로 분화시켰다. 더 적은 수의 세포가 힐렉스®II(Solohill, MI) 마이크로-캐리어 상에서 완성 내배엽으로 분화하는 것으로 보였다. 세포의 분화능은 증식 시스템의 융통성을 입증한다. 또한, 동물 성분 매트릭스에 대한 임의의 필요를 없애고, 세포를 막 및 마이크로-캐리어 상에서 직접 성장시키고 분화시킬 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 측면은 실시예 및 바람직한 실시 양태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 청구항에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.

Claims (10)

  1. a. 만능 줄기 세포의 집단을 제1부피의 마이크로-캐리어(micro-carrier)에 부착시키는 단계,
    b. 만능 줄기 세포를 제1부피의 마이크로-캐리어 상에서 배양하는 단계,
    c. 만능 줄기 세포를 제1부피의 마이크로-캐리어로부터 제거하는 단계, 및
    d. 만능 줄기 세포의 집단을 제2부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 단계를 포함하여, 만능 줄기 세포를 증식시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 마이크로-캐리어 상에서의 만능 줄기 세포의 배양, 제거 및 부착 단계를 이후의 부피의 마이크로-캐리어를 사용하여 반복하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1부피의 마이크로-캐리어가 덱스트란 마이크로-캐리어 및 폴리스티렌 마이크로-캐리어로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제2부피의 마이크로-캐리어가 덱스트란 마이크로-캐리어 및 폴리스티렌 마이크로-캐리어로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 Rho 키나아제 저해제를 함유하는 배지 내에서 제1부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 Rho 키나아제 저해제를 함유하는 배지 내에서 제2부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 효소적 처리에 의하여 제1부피의 마이크로-캐리어로부터 제거하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 효소적 처리에 의하여 제2부피의 마이크로-캐리어로부터 제거하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 제2부피의 마이크로-캐리어에 부착시키기 전에, 제1부피의 마이크로-캐리어를 만능 줄기 세포로부터 제거하는 방법.
  10. a. 만능 줄기 세포를 소정의 부피의 마이크로-캐리어에 부착시키는 단계,
    b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
    c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
    d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
    e. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 인슐린-발현 세포로 분화시키는 단계를 포함하여, 마이크로-캐리어 상에서 만능 줄기 세포를 인슐린-발현 세포로 분화시키는 방법.
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