WO2019231111A1

WO2019231111A1 - 성체 줄기세포 배양액 및 그 제조방법

Info

Publication number: WO2019231111A1
Application number: PCT/KR2019/004906
Authority: WO
Inventors: 박재우
Original assignee: 주식회사 지스테믹스
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2019-12-05
Also published as: KR20190009695A; MX2020012696A; KR102115360B1

Abstract

과제: 중간엽 줄기세포 배양액을 경제적이고 손쉬운 방법으로 제조하는 것 해결방법: 본 발명은 마이크로캐리어를 부착 지지체로 이용하여 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 3차원 배양하여 고함량 사이토카인 및 세포 성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액을 장기간 동안 수득할 수 있다.

Description

성체 줄기세포 배양액 및 그 제조방법

본 발명은 마이크로캐리어를 이용하여 성체 줄기세포를 3차원으로 장기간 배양하는 방법 및 이 방법으로 제조된 성체 줄기세포 배양액, 그리고 이 배양액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

성체 줄기세포는 미분화 상태로 자가 증식하고 다른 조직의 세포로 다중 분화될 수 있는 세포로 우리 몸의 많은 조직에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 그 중 가장 먼저 알려진 것은 골수에서 유래한 성체 줄기세포이다. 이후 성체 줄기세포는 탯줄 혈액뿐만 아니라 말초혈액에서도 분리되며 또한 태반, 피부, 신경조직 등 우리 몸 어느 곳에서나 존재함이 밝혀졌다. 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC)는 많은 연구를 통해 간엽 줄기세포로 확인되어 왔으나 채취시 동통이 있고, 많은 양의 줄기세포 획득이 불가한 단점이 있으며, 탯줄 혈액 등은 적기에 얻기 힘들며 자가 조직으로 사용하기에는 장기간 보관 등의 문제점을 갖고 있다. 최근 지방조직에서도 줄기세포가 존재한다는 사실의 기원은 1992년 인체 지방조직에서 분리한 SVF (stromal vascular fraction) 층에서 vWF (von Willebrand factor), a-민무늬 근육세포 액틴 (a-smooth muscle cell actin)과 사이토케라틴 (cytokeratin)에 염색된 세포인 미세혈관 내피세포를 발견한 이후 [Young C, Jarrell BE, Hoying JB, Williams SK. Cell Transplant 1992;1:293-298.], 최근 연구에서 줄기세포와 유사한 형태의 세포가 이들 조직 내에 존재하며 이들 세포가 다중 분화능을 가지는 줄기세포임을 확인하였다 [Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH. Mol Biol Cell 2002;13:4279-4295].

지방조직 유래 줄기세포는 분화능을 가지며, 다양한 사이토카인과 세포 성장인자를 분비함으로써 혈관생성, 면역조절, 항염증 작용, 세포 사멸 방지, 세포 유인 등의 기능을 통하여 상처 치료와 조직 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

지방조직 유래 줄기세포가 분비하는 분비물에는 연구자에 따라 적게는 30여 가지 많게는 470여 가지의 단백질이 존재하는 것으로 알려져 있으며 (S. Zvonic, et al., Molecular & Cellular Proteomics 6 (2007) 18-28., J. Kim, et al., Proteomics 10 (2010) 394-405., J. Zhong, et al., Journal of Proteome Research 9 (2010) 5228-5238. D.M. Mutch, et al., International Journal of Obesity (London) 33 (2009) 354-363. A. Rosenow, et al., Journal of Proteome Research 9 (2010) 5389-5401), 줄기세포의 배양기간과 조건에 따라 그 조성이 다양하게 변화되는 것으로 보고되고 있다.

최근 들어 여러 연구자에 의해 중배엽 줄기세포의 배양을 통하여 고농도의 배양 상층액을 수득하는 방법이 보고된 바 있다. 국내 특허공개 제10-2009-0001163호 (2009. 01. 08)와 국제공개 WO 2007/086637호 (2007. 08. 02)에서는 중간엽 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍, 또는 기계적 마찰과 같은 물리적 자극을 가하고, 비타민 A, B, C, 또는 D를 배양액에 첨가하여 몇몇 세포 성장인자를 고농도로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 그런데, 이러한 방법에서는 줄기세포를 단순히 2차원 배양한 후, VEGF (Vascular endothelial growth factor) 등의 함량을 높이기 위해 특정 시기에만 저산소 조건에서 2차원 배양을 실시하고 있다. 즉, 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양 상층액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있으며, 배양 상층액을 1회밖에 얻을 수 없다는 등의 문제가 있다.

한편, 국내 특허공개 제 10-2012-0126284에서는 피브리노겐을 원료로 하는 스캐폴드를 만들어 바틀이나 배양가방 (culture bag) 내에서 중간엽 줄기세포를 3차원 배양하여 EGF (Epidermal growth factor), VEGF (Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), TGF (Transforming growth factor)-b1의 함량이 2차원 배양보다 월등히 높아짐을 보고하고 있다. 또한, 국내 특허공개 10-2013-0127329에서는 콜라겐을 이용한 스캐폴드를 만들어 3D 배양을 하여 IGF (insulin-like growth factor)-1, BMP2 (Bone morphogenetic protein 2), CXCL2 (C-X-C Motif Chemokine Ligand 2), IL-8 (Interleukin-8), VEGF (Vascular endothelial growth factor) 등의 농도가 2D 배양보다 월등히 높았고, 농축 배양 상층액은 골 형성에 효과가 있음을 보고한 바 있다. 방석호 등(Molecular Therapy, vol.22 no.4 apr.2014)은 스피너 플라스크에 사람 지방조직 유래 줄기세포 (human adipose-derived stem cells; hADSC)를 3D 부유배양 (spheroid culture)한 결과, VEGF, FGF-2 (fibroblast growth factor), HGF, CXCL2의 농도가 2D 배양보다 월등히 높았으며, 3D 배양 상층액이 혈관생성에 효과적이라고 보고하였다.

상기 보고들을 종합해 보면 고농도의 세포 성장인자를 함유한 배양 상층액을 얻기에는 2D 배양법보다 3D 배양법이 효과적이라는 사실을 알 수 있다.

국내 특허공개 제10-2012-0126284에서는 스캐폴드를 이용한 3D 배양법을 이용하여 3일째, 6일째, 9일째 배양액의 EGF, VEGF, HGF, TGF-b1의 함량의 변화를 개시하고 있는데, HGF를 제외한 다른 성분들은 시간이 지날수록 그 함량이 줄어드는 경향을 보였다. 따라서 한정된 줄기세포 자원을 이용하여 좀 더 많은 고농도의 배양액을 장기간 수득하기 위해서는 배양법의 개선이 필요하다.

상기 연구자들이 사용했던 배양법들은 사람 지방조직 유래 줄기세포 (hADSC)의 일반적 3D 배양법으로 이용되기에는 몇 가지 해결해야 할 문제점들이 있다.

즉, 스캐폴드를 이용한 3D 배양법들은 스캐폴드를 임의로 만들었기 때문에 그 크기와 개수 등 물리적 조건이 표준화되어있지 않아 줄기세포의 배양시 동일한 조건을 반복적으로 만들기가 어려우며, 방석호 등에 의한 3D 부유 배양법은 hADSC를 부착 지지체에 부착시키지 않고 줄기세포의 구형 콜로니를 형성시켜 스피너 플라스크 내에서 교반하면서 부유 배양하는 방법인데, 이는 hADSC가 부착 생장하는 세포라는 사실을 고려할 때 콜로니를 형성하지 못한 단일세포 (single cell)들의 손실이 예상되고, 배양 상층액과 세포를 분리하는 방법이 모호하여 배양액의 교체나 배양 상층액의 수득 과정에 어려움이 있을 것으로 예상된다.

본 발명은 마이크로캐리어를 부착 지지체로 이용하여 무혈청 배지에서 3차원 배양하여 고함량 사이토카인 및 세포 성장인자를 포함하는 인체 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 장기간 수득하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 대한민국 특허공개공보 10-2012-0126284에 보고된 스캐폴드를 이용한 3차원 배양법이나 방석호 등 (Molecular Therapy, vol.22 no.4 apr.2014)의 스피너 플라스크를 이용한 3D 부유배양 (spheroid culture)을 개선하여 표준화함으로써 용이하고 안정되게 장기간 줄기세포를 배양하여 고농도의 배양액을 좀 더 간편하게 대량생산할 수 있는 방법을 제시한다.

구체적으로 본 발명의 마이크로캐리어를 이용한 지방조직 유래 줄기세포의 3차원 배양은 적은 양의 마이크로캐리어로 세포를 부착할 수 있는 넓은 표면적을 확보할 수 있고 (360㎠/g), 세포 배양시 배양액의 교반을 통해서 배양환경을 균질화하여 모든 세포가 접하는 환경을 일정하게 유지할 수 있어서 세포의 증식에 대한 반복적 예측이 가능하며, 트립신 등의 단백질 분해효소를 사용하지 않고도 지속적인 증식이 가능하여 세포의 노화를 지연시켜 장기적인 세포 배양이 가능하다.

또한, 본 발명의 방법은 배양법이 단순하여 배지의 교환과 마이크로캐리어의 첨가만으로 줄기세포를 증식시킬 수 있어서 원가와 노동력을 절감할 수 있으며 대량 배양을 위한 스케일 업이 가능하다.

이뿐만 아니라, 본 발명의 방법으로 얻어지는 배양액에는 세포활성물질이 고농도로 함유되어 있어서 세포활성물질의 농도를 높이기 위해 별도의 조작이 필요하지 않다.

본 발명의 3차원 배양법을 따르면 제한된 줄기세포를 이용하여 고농도의 배양액을 좀 더 많이, 안정적으로 수득할 수 있다.

본 발명의 방법을 순서대로 자세히 살펴본다.

(1) 인체 지방조직 유래 줄기세포의 단리

인체 지방조직으로부터 줄기세포의 단리는 통상적인 방법을 따른다. 즉, 분리된 지방 흡입물을 세척하여 지방 조직만을 얻은 후 콜라게나아제를 처리한 다음 원심분리하여 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 이렇게 얻은 세포 펠렛 형태의 스트로마성 혈관 분획을 세척한 다음 세포 여과기를 통과시켜 세포 이외의 조직을 제거한 후 플라스크에 하루 동안 배양하였다. 이후 비접착성 세포들을 제거하였다. 플라스크에는 부착 단백질을 코팅하였고, 무혈청 배지를 사용하여 줄기세포를 배양한다.

(2) 줄기세포의 배양

상기 단리된 부착형 줄기세포들을 3일 간격으로 배지를 교환해주면서 플라스크 내 세포가 70~80% 가득 찰 때까지 유지한 후 계대 배양을 하였다. 초기 배양에서는 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라즈마의 성장을 예방하는 시약을 첨가하는 것이 바람직하다. 초기 배양의 일반적인 조건은 온도 37℃, 5% CO₂로 하였다.

(3) 계대 배양

세포가 플라스크 바닥의 70~80%를 채우면 증식 배지를 제거하고 트립신을 처리하여 세포를 플라스크에서 떼어내었다. 계대 배양을 위해서 부착 단백질이 코팅된 새로운 플라스크에 10,000개/㎠의 세포를 분주하였다. 계대 후 배양 조건은 온도 37℃, 5% CO₂, 5~10% O₂로 하였다.

(4) 마이크로캐리어를 이용한 3차원 배양

배양된 세포를 떼어내어 마이크로캐리어와 함께 스피너 플라스크(spinner flask)에 소량의 무혈청 배지와 함께 분주한 후 하루 동안 정체하여 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착할 수 있도록 하였다. 이후 배지를 첨가하고 마그네틱 교반기를 이용하여 스피너 플라스크 내의 회전봉을 회전시키면서 마이크로캐리어가 부유할 수 있도록 하여 지속적으로 배양하였다. 마이크로캐리어에 부착된 세포의 밀도가 높아지면 마이크로캐리어와 배지를 첨가해주면서 세포를 배양하였다. 배양 조건은 온도 37℃, 5% CO₂, 5~10% O₂로 하였다.

(5) 배양액의 수득

무혈청 배지 내 세포 성장에 필요한 영양분은 공급 후 3~4일이면 거의 고갈되므로 안정되고 지속적인 세포배양을 위해서는 일정량의 배지를 교환해 주어야 한다. 본 발명에서는 배양액의 50~75%를 새로운 배지로 교환하는 것이 바람직하다.

본 발명은 고농도의 줄기세포 배양액을 간편한 방법으로 장기간 생산하는 것을 목적으로 제안하고 있다. 기존의 3차원 배양법들과 비교할 때 고농도의 줄기세포 배양액을 얻을 수 있다는 공통점이 있으나 본 발명의 방법은 장기간 동안 편차가 적은 고농도의 배양액을 수득할 수 있고, 마이크로캐리어의 첨가만으로 손쉽게 배양액을 대량생산할 수 있으며, 한정된 세포를 장기간 안정되게 배양함으로써 세포의 교체를 위한 비용을 줄일 수 있고, 더욱 많은 고농도 배양액을 생산할 수 있으며 배양액 생산의 표준화가 용이하다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면 배양액 중의 유효성분을 화장품 조성물 또는 약학 조성물로 제조하여 상업화에 적용할 때 배양액 대량생산의 필요에 적합한 방법이라 할 수 있다.

도 1a와 도 1b는 각가 본 발명의 3차원 배양 1일째와 7일째에 마이크로캐리어에 부착 증식하는 줄기세포의 모습을 보여주고 있다.

도 2는 본 발명의 3차원 배양으로 32일째의 응집된 마이크로캐리어 덩어리를 2차원 배양용기에 접종하였을 때 증식되는 줄기세포의 모습을 나타낸 것이다.

도 3은 102가지 사이토카인 어레이 킷트((Proteome Profiler Array; Human XL Cytokine Array Kit; R&D system)를 사용하여 본 발명의 3차원 배양액 내에서 검출된 사이토카인들을 나타내는 그림이다.

도 4는 본 발명의 방법으로 3차원 배양 시작 후 새로운 마이크로캐리어의 첨가 없이 배양액의 50%를 새로운 배지로 교체(3일, 7일, 10일, 14일, 28일, 22일, 26일)하면서 얻어진 배양액 내의 날짜별 VEGF의 상대적 함량변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 방법으로 3차원 배양 시작 후 7일째, 17일째, 27일째에 마이크로캐리어를 첨가하고 배지의 부피도 17일째에는 초기의 1.5배로 27일째에는 2배로 각각 늘리면서 50일 동안 얻어진 배양 내의 VEGF의 상대적 함량변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 저산소 조건과 21% 산소 배양조건에서 얻어진 본 발명의 3차원 배양액 내의 VEGF 함량을 비교한 그래프이다.

도 7a, 7b, 7c 및 7d는 각각 지방조직 유래 줄기세포의 2차원 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 배양 중 수득된 배양액 내의 VEGF, HGF, 제1형 프로콜라겐 및 TGFb-1의 함량을 나타낸 그래프이다.

도 8은 지방조직 유래 줄기세포의 배양배지에 본 발명의 방법으로 얻은 3차원 배양액과 종래 2차원 배양법으로 얻은 배양액을 50% 첨가하여 48시간 후 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은

(a) 지방 조직에서 성체 줄기세포를 분리하는 단계;

(b) 분리된 지방 조직 유래 성체 줄기세포를 계대배양하는 단계;

(c) 2계대 이상의 줄기세포를 무혈청 배지 및 마이크로캐리어가 들어있는 배양 용기에 가하여 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착되도록 방치하는 단계;

(d) 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착된 후 배양 용기에 배지를 가하고 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계; 및

(e) 상기 배양 용기에 마이크로캐리어 또는 배지 중 1종 이상을 부가하여 줄기세포의 배양을 2주 이상 유지하면서 배양액을 계속 수득하는 단계;를 포함하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (d)의 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계가 10분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 10분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 경우 배양 효율이 높아졌다.

또한, 본 발명은 (d)의 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계가 20~80rpm으로 20분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 것을 특징으로 한다. 20~80rpm의 저속으로 20분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 경우 배양 효율이 높아졌다.

또한, 본 발명은 상기 (c) 단계를 5~10%의 저산소 조건으로 배양함을 특징으로 한다. 5~10%의 저산소 조건으로 상기 (c) 단계를 수행하는 경우 일반 산소 농도를 유지하는 경우보다 배양 효율이 높아졌다.

또한, 본 발명에서 상기 (e) 단계는 3~5일 간격으로 배양액을 수득하고 배지를 가하는 것을 특징으로 한다. 3~5일 간격으로 배양액을 수득하고 배지를 가하는 경우 배양 효율이 높아졌다.

또한, 본 발명에서 상기 (e) 단계는 6주 이상 배양하며 배양액을 수득하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, VEGF 8ng/ml 이상, HGF 7ng/ml 이상, 프로콜라겐 타입 1 펩타이드 9mg/ml 이상 및 TGFb-1 7ng/ml 이상이 함유된 성체 줄기세포 배양액을 제공한다 (도 7a 내지 도 7d).

또한, 본 발명은 성체 줄기세포 2차원 배양액에 비해 VEGF는 5~7배, HGF는 15~20배 함유하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포 배양액을 제공한다.

이뿐만 아니라, 본 발명은 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

이뿐만 아니라, 본 발명은 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 외용제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 피부 외용제의 구체적인 제형을 예시하면, 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형 등과 같다.

본 발명에 사용된 무혈청 배지는 상업적으로 시판되고 있는 중간엽 줄기세포용 무혈청 배지를 의미하며, 본 발명의 "마이크로캐리어"는 폴리스티렌 재질의 직경 100~200㎛의 구형 세포 부착 지지체로서 비동물성 단백질이나 전하를 띤 물질이 코팅되어 있는 것을 의미한다.

줄기세포의 3차원 배양은 3차원 배양의 시작일로부터 줄기세포의 증식시기에 따라 마이크로캐리어를 첨가하며 3~5일 간격으로 배지를 교환하면서 배양액을 수득하는 것이 바람직하다.

상기 수득한 줄기세포 배양액은 2차원 배양과 비교하여 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)는 약 7배, HGF (Hepatocyte Growth Factor)는 약 20배 정도 농도가 높은 특징을 가지고 있으며 화장료 조성물 등에 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로캐리어를 이용하는 3차원 배양법은 2차원 배양법과 비교하여 다음과 같은 장점이 있다.

첫째, 적은 양의 마이크로캐리어로 줄기세포가 부착할 수 있는 많은 표면적을 확보할 수 있다. 예컨대, 3mg/ml의 Cytodex1은 1.32×10⁴㎠/ℓ의 표면적으로서 75㎠의 플라스크 176개에 해당한다.

둘째, 세포 배양시 배양액의 교반을 통해서 배양환경을 균질화할 수 있어서 장기간 배양 가능하다.

셋째, 줄기세포의 대량 배양을 위한 스케일 업이 가능하다.

넷째, 트립신과 같은 단백질 분해 효소를 사용하지 않고 줄기세포의 지속적인 증식이 가능하고, 따라서, 줄기세포의 노화가 방지된다.

다섯째, 배양 상층액 내 성장인자의 농도가 종래 배양방법에 비해 10~20배 이상 높다.

여섯째, 배양방법이 단순하여 원가와 노동력을 절감할 수 있다.

또한, 본 발명의 3차원 배양법은 기존 2차원 배양법이나 3차원 배양법과는 다음과 같은 차별점이 있다.

첫째, 배양 상층액 내의 주 세포 성장인자의 농도가 2차원 배양의 것보다 최대 13~20배 높다.

둘째, 한 번 배양된 세포로부터 40일 이상 일정한 고농도의 세포 성장인자를 함유한 배양 상층액을 수득할 수 있어 한정된 세포로부터 많은 양의 배양 상층액을 생산할 수 있다.

셋째, 세포의 탈부착이 필요 없으므로 배양과정이 쉽고 소비재의 사용이 거의 없으므로 노동력과 생산 원가가 절감된다.

넷째, 배양과정이 단순하므로 배양 상층액 내의 세포성장인자 농도를 세포 배양 전 기간 동안 비교적 균일하게 유지할 수 있어 제품의 표준화가 가능하다.

다섯째, 생산시설의 확충만으로 대량생산이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 단, 아래의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 지방 줄기세포의 단리

지방조직 공여자의 동의를 얻고, 지방 흡입방법을 통하여 지방조직을 수거하였다. 얻은 지방조직을 2% AbAm(Antibiotics-Antimycotics)을 포함한 PBS로 3회 세척한 후 순수 지방조직(fat tissue)을 얻었다. 순수 지방조직에 0.1% 콜라게네이즈를 처리한 다음 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 스트로마성 혈관 분획 펠렛을 얻었다. 얻은 펠렛을 PBS로 세척하고 100㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 0.05% 젠타마이신을 포함한 무혈청 배지(StemPro® MSC SFM CTS™; Gibco)로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 기질 배지와 함께 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리하였다.

실시예 2: 줄기세포의 배양

실시예 1에서 단리된 부착형 줄기세포들을 3일 간격으로 증식 배지를 교환해주면서 플라스크 내 세포가 70~80% 가득 찰(confluent) 때까지 증식한 후 증식 배지를 제거하고 트립신을 처리하여 플라스크에서 세포를 떼어내었다. 계대 배양을 위해서 부착 단백질이 코팅된 새로운 플라스크에 10,000개/㎠의 세포를 분주한 후 70~80% 가득 찰 때까지 증식시켜 2차원 또는 3차원 배양에 이용하였다. 계대후 배양 조건은 온도 37℃, 5% CO₂, 5%~10% O₂로 하였다.

실시예 3: 마이크로캐리어를 이용한 줄기세포 3차원 배양

실시예 2에서 얻은 2계대 이상의 줄기세포를 떼어내어 마이크로캐리어와 함께 스피너 플라스크에 소량의 무혈청 증식 배지와 함께 분주하였다(5×10⁴ ~ 1×10⁵ cells/㎖). 이후 24시간 동안 줄기세포를 배양기 안에 정체시켜 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착할 수 있도록 하였다. 24시간 후 배지를 첨가하고 스피너 플라스크 내의 임펠러를 마그네틱 자동조절장치를 이용하여 임펠러의 회전(rpm 35~50으로 40분)과 쉼(10분)을 반복적으로 설정하여 마이크로캐리어가 부유와 정체를 반복적으로 할 수 있도록 하였다. 마이크로캐리어에 부착된 줄기세포의 밀도가 높아지면 마이크로캐리어와 배지를 첨가해주면서 세포를 배양하였다.

도 1a와 같이 3차원 배양 시작 후 24시간이 지나면 줄기세포들이 마이크로캐리어 표면에 안정하게 부착되고, 부착된 줄기세포들이 분비하는 부착 단백질에 의해 주위의 마이크로캐리어들이 응집하기 시작한다. 도 1b와 같이, 배양 후 7일이 지나면 대부분의 마이크로캐리어의 표면에 줄기세포가 분포하여 분열과 증식을 시작하고 마이크로캐리어들은 더 크게 응집하게 된다. 이 시기에 마이크로캐리어를 보충하여 분열된 줄기세포들이 부착할 수 있는 표면적을 넓혀준다.

일정 시간이 지나면 단일 마이크로캐리어의 수가 줄어들고 응집체의 수와 크기가 커지는 현상이 반복되고 이 시기에 마이크로캐리어와 배지를 첨가하여 지속적으로 배양하였다.

이와 같이 2차원 배양에서처럼 트립신을 이용하여 세포를 떼어내는 과정 없이 마이크로캐리어의 첨가만으로 줄기세포를 증식할 수 있기 때문에 세포의 노화나 변형을 줄일 수 있어서 장기간 동안 안정되게 세포배양이 가능하리라 판단하였다. 도 2는 3차원 배양 30일 후에 일부 응집체를 2차원 배양용 플라스크에 접종하여 3일 후 다량의 줄기세포가 응집체로부터 증식되어 나오는 것을 보여준다. 보통 장기간의 2차원 배양을 거치게 되면 세포의 형태가 심한 변형을 가져오나 30일 후의 응집체에서 증식된 줄기세포들은 배양 초기세포의 형태를 그대로 나타내었다. 이로써 본 발명의 방법으로 장기간의 줄기세포 3차원 배양이 가능하고 이 과정에서 지속적으로 고농도의 배양액을 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 1: 배양액 내 사이토카인 정성분석을 통한 지표 물질 선정

줄기세포를 장기간 3차원 배양을 하기 위해서는 증식을 위한 마이크로캐리어의 첨가와 새로운 배지의 교체 또는 첨가가 필요하다. 부착 성장을 하는 줄기세포는 부착할 수 있는 여유 공간이 없으면 더 이상 증식하지 않고 휴지기 상태에 접어들게 된다. 휴지기 상태에서는 활발한 증식활동이 일어나지 않으므로 그들이 분비하는 사이토카인이나 세포성장인자의 농도는 더 이상 높아지지 않는다. 따라서 활발한 증식을 유도하기 위해서는 적절한 시기에 부착 지지체인 마이크로캐리어를 첨가하고 배지를 공급해 주어야 한다.

그 시기들을 결정하기 위해서 장기간의 배양과정 중 세포의 증식과 관련된 여러 가지 사이토카인 또는 세포성장인자의 변화를 살펴보기로 하였다.

배양액 내의 많은 사이토카인 또는 세포성장인자의 존재를 확인하고 적절한 지표물질을 결정하기 위하여 3차원 배양 7일째에 얻어진 배양액을 웨스턴 블롯 검사(Human XL Cytokine Array Kit ( R&D system))를 이용하여 정성분석 하였다(도3).

102가지 사인토카인 또는 세포 성장인자의 정성분석은 다음과 같은 과정을 따랐다. 제공된 제품의 모든 시약, 대조군시료 및 배양액시료를 실온에서 미리 준비한 후 미리 고안된 96웰 플레트의 각 웰에 Array 완충액 6과 막을 넣고 실온에서 rocking platform shaker에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 반응시킨 용액은 버리고 대조군 시료와 배양액 시료를 Array 완충액 6과 함께 최종 부피가 1.5ml가 되도록 넣어주었다. (배양액 시료 양은 200-500㎕ 이상으로 하였다.) 이후 rocking platform shaker에서 2~8℃를 유지하며 12시간 이상 반응시키고 세척액으로 10분씩 3회 세척하였다. 제공된 8㎖의 Array 완충액 6에 4㎖의 Array 완충액 4를 혼합한 용액 6ml에 Detection Antibody Cocktail을 120㎕ 넣은 후 각 웰에 1.5ml씩 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 이후 세척액으로 10분씩 3번 세척하고 Streptavidin-HRP를 각 웰에 넣고 30분 반응시켰다. 이후 세척액으로 10분씩 3번 세척하고, Chemi Reagent Mix 용액을 넣고 1분간 반응시킨 후 사진 촬영(Chemi-doc)을 하였다.

도 3은 관측된 스폿들을 분석하여 각 사이토카인의 상대적 함량을 나타낸 그림이다. 102가지 중 총 43가지의 사이토카인 또는 세포 성장인자가 검측되었고 세포 성장인자 중 HGF와 VEGF가 높은 함량을 나타내었다. 그 중 VEGF는 혈관형성과 관련되는 줄기세포가 분비하는 대표적인 세포 성장인자로 알려져 있다. 따라서, 줄기세포의 증식과 관련된 분석에 지표물질로서 VEGF를 이용하기로 하였다.

실험예 2: 주기적인 배지의 교체에 따른 배양액 내 VEGF의 함량 변화 측정

본 발명에 사용된 배지는 중배엽성 줄기세포의 배양용으로 상업화된 무혈청배지이다. 일반적으로 무혈청배지에는 세포의 성장과 증식에 필요한 성분들이 제한적으로 포함되어 있으므로 일정한 시간이 지나면 원활한 세포배양을 위해서 새로운 배지로 교체해 주어야 한다. 적절한 배지의 교체 주기는 세포를 안정되게 배양한 중요한 요소이다.

2차원 배양에서는 통상 3~4일 간격으로 배지를 교체하므로 본 발명의 3차원 배양에서도 3~4일의 교체주기를 이용하여 장기간의 배양 가능성을 살펴보았다. 부착 지지체인 마이크로캐리어의 알려진 표면적을 통하여 배지의 양을 결정하고 3~4일 간격으로 50~75%를 새로운 배지로 교체하면서 초기의 마이크로캐리어 양을 유지하면서 30일동안 배양하고, 날짜별로 VEGF의 농도 변화를 측정하였다.

도 4는 3일, 7일, 11일, 15일, 18일, 22일, 26일째에 새로운 배지로 교체하면서 날짜별로 VEGF의 농도를 측정한 그래프이다. 초기 3일 이후 7일까지는 지속적으로 농도가 증가하였는데 이는 배양 초기에 마이크로캐리어가 제공하는 부착 가능한 표면이 많아 세포가 지속적으로 증식하였기 때문이라 판단된다. 7일 이후에는 대체로 배지의 교체 직후에는 농도가 감소하다가 3~4일 이후에는 다시 교체 이전의 농도 수준을 회복하였으나 큰 폭의 농도변화는 나타나지 않았다. 이는 배양 초기와는 다르게 마이크로캐리어가 첨가되지 않아 부착면이 부족하여 세포의 증식이 이루어지지 않고 배양기간 동안 세포의 수가 증가하지 않았기 때문이라 판단된다.

본 실험 결과 3~4일 간격으로 배양액의 50~75%를 수득하면서 새로운 배지로 교체하는 방법으로 일정수의 줄기세포를 장기간 배양할 수 있음을 알 수 있었다.

더불어 배양기간 동안 마이크로캐리어를 첨가해주면 세포의 증식을 유도할 수 있고 그에 따라 세포수가 증가하여 VEGF를 비롯한 세포성장인자의 농도를 높일 수 있을 것으로 판단되었다.

실험예 3: 배지의 교체와 마이크로캐리어의 첨가에 따른 배양액 내 VEGF 함량 변화 측정

실험예 2에서 판단된 내용을 좀 더 알아보기 위하여 배양 후 7일째, 17일째, 27일째에 마이크로캐리어를 첨가하면서 50일간 3차원 배양을 진행하고, 3~4일 간격으로 배지를 교체하면서 수득된 배양액 내의 VEGF 함량을 측정해 보았다. 증식된 세포에 충분한 영양분을 공급하기 위하여 7일째와 17일째에는 배지의 양을 각각 초기의 1.5배, 2배로 하였고 27일째에는 배지의 양을 초기의 2배로 유지하였다. 배양조건은 온도 37℃, 5% CO₂, 21% O₂로 하였다. 7일째 이후 17일째까지 VEGF의 농도는 완만하게 감소하여 17일째는 7일째의 80% 수준까지 내려갔다. 이는 7일째에 배지의 양을 1.5배로 늘렸기 때문에 세포 수는 증가하였으나 농도는 희석되었기 때문으로 판단된다. 17일째 이후에는 배지의 양을 초기의 2배로 늘렸음에도 불구하고 그 농도가 일시적으로 증가하였다가 27일째까지 완만하게 감소하여 7일째의 76% 수준까지 감소하였다. 이는 17일째에 첨가된 마이크로캐리어에 의해 세포의 증식이 일어났기 때문으로 판단된다. 반면에 마이크로캐리어만 첨가된 27일 이후에는 큰 폭으로 VEGF의 농도가 증가하여 31일째와 50일째에는 각각 7일째의 128%, 190%까지 증가하였다. 이는 배지의 양이 증가하지 않고 세포의 증식이 일어나 희석효과가 나타나지 않았기 때문으로 판단된다.

결과적으로 마이크로캐리어의 첨가는 줄기세포의 증식을 유도하여 배양액 내의 사이토카인이나 세포성장인자의 농도를 높이는 효과가 있다고 판단되었다.

실험예 4: 저산소 조건과 21% 산소 조건에서 얻어진 배양액 내의 VEGF 함량 비교

2차원 배양에서는 상처치료에 작용하는 세포성장인자의 농도가 21% 산소 조건보다는 저산소 조건에서 더 높다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 3차원 배양에서도 그러한 현상이 나타나는지 알아보기 위하여 저산소조건(5~10% O₂)과 21% 산소 조건으로 배양한 후 배양액 내 VEGF 농도를 측정하였다. 배양 시작후 7일째에 마이크로캐리어를 첨가하였고 배지는 1.5배로 하여 21일 동안 배양하면서 3~4일 간격으로 50~75%의 배양액을 수득하고(7일, 10일, 14일, 17일, 21일) 새로운 배지로 교체하였다.

도 6은 5회에 걸처 수득된 배양액 내 VEGF 농도의 평균값을 나타내는 그래프이다. 저산소 조건이 21% 조건보다 VEGF 농도가 8.5% 높게 나타나 고농도의 배양액을 얻기 위해서는 저산소 조건이 좀 더 효율적인 것으로 판단되었다.

실시예 4: 배양액의 수득

실험예 3, 실험예 4의 결과를 종합하여 고농도의 배양액을 수득하기 위해서 저산소 조건을 이용하여 3~5일 간격으로 배양액의 50~75%를 수득하고 동량의 새로운 배지를 공급하였다. 줄기세포의 증식을 유도하기 위해 마이크로캐리어를 첨가해주었고 이때 첨가되는 배지의 양 또한 증가시켰다. 배양시간이 길어질수록 1회에 수득하는 배양액의 양 또한 증가하였다. 수득한 배양액 중 일부는 0.25~0.45㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 -80℃에 보관하였다.

실시예 5: 세포성장인자의 함량 측정

실시예 3에서 얻은 줄기세포(제2계대)에 대하여 2차원 배양과 3차원 배양을 동시에 진행하여 2차원 배양액은 3일 후에 수득하였고 3차원 배양은 실시예 4에서 수득한 배양액을 이용하였다.

각 배양액 내 세포 성장인자의 함량 측정은 효소결합면역흡착법(ELISA)을 이용하였다(Quantikine ELISA Kit, R&D system; Procollagen type 1 peptide kit(Takara Bio Inc., Japan)). 즉, 표준물질과 배양액 시료를 96-웰 플레이트의 각 웰에 100~200㎕씩 넣고 제품에서 제공된 1차 반응액을 각 웰당 50㎕ 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 배양액 시료는 필요에 따라 1:10 ~ 1:20으로 희석하여 사용하였다. 반응 후 용액을 제거하고 세척액으로 3~4회 세척하고 각 웰에 컨주게이트(conjugate) 100~200㎕를 넣어준 후 2시간 동안 반응시켰다. 이후 반응액을 제거하고 세척액으로 3~4회 세척 후 기질 용액(substrate solution) 200㎕를 첨가하고 상온에서 15~25분간 반응시켰다. 반응 후 반응정지용액(stop solution) 50~100㎕를 각 웰에 넣어준 후 잘 혼합하여 30분 내에 450~540nm에서 흡광도를 측정하였다.

각 성장인자의 함량은 제공된 표준용액을 단계적으로 희석하여 각 흡광도와 대응된 함량들에 대한 표준곡선(standard curve)의 수식을 얻어내고 그 수식에 시료들의 흡광도를 대입하여 얻었다.

도 7a 내지 도 7d는 각각 실시예 4에서 32일 동안 얻어진 배양액 내의 여러 세포성장인자의 농도를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 3차원 배양법에 의해 얻어진 배양액의 세포성장인자의 함량이 2차원 배양보다 현저히 증가하였다. 또한, 32일간의 배양기간 동안 각 세포성장인자의 함량은 큰 편차 없이 고농도를 유지하였다. VEGF의 경우는 배양 후 7일째 수득한 배양액부터 고농도가 나타나 배양 전기간 동안 그 농도가 유지되었고 2차원 배양액에 비해 약 5~7배 그 농도가 높았다. HGF의 경우도 3차원 배양 전기간 동안 고농도가 유지되었으며 7일 이후 배양액부터는 2차원 배양액보다 약 15~20배 높은 함량을 보였다. 프로콜라겐은 2차원 배양액보다 2~4배 증가하였다. TGFb-1은 3배 이상 증가하였다.

실험예 5: 배양액이 지방 조직 유래 줄기세포 증식에 미치는 영향

줄기세포의 배양액에는 상처치유에 작용하는 사이토카인들과 세포의 증식에 작용하는 여러 성장인자들이 다량 함유되어 있다. 본 발명에서 얻어진 3차원 배양액이 세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 준비된 6웰에 5×10⁴개의 세포를 분주하고(3반복) 대조군으로는 10%의 소 혈청 배지를, 실험군으로는 3차원 배양액 50%가 포함된 배지와 2차원 배양액 50%가 포함된 배지를 각각 사용하였다. 배양조건은 온도 37℃, 5% CO₂, 5~10% O₂로 하였고 48시간 후에 세포를 트립신으로 떼어낸 후 그 수를 측정하였다.

본 발명의 방법으로 제조된 배양액을 첨가한 세포의 수는 대조군보다 1.8배 이상이었으며 2차원 배양액보다 15%가량 높은 수치를 나타내어 고농도의 3차원 배양액이 세포 증식에 효과적임을 알 수 있었다.

본 발명의 방법에 의하여 제조된 줄기세포 배양액은 종래 방법에 의해 얻은 줄기세포 배양액에 비해 성장인자 농도가 현저히 높아 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형 등의 피부 외용제를 비롯한 약학 조성물이나 화장료와 같은 분야에서 응용할 수 있다.

Claims

(a) 지방 조직에서 성체 줄기세포를 분리하는 단계;

(b) 분리된 성체 줄기세포를 계대배양하는 단계;

(c) 2계대 이상의 줄기세포를 무혈청 배지 및 마이크로캐리어가 들어있는 배양 용기에 가하여 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착되도록 방치하는 단계;

(d) 줄기세포가 마이크로캐리어에 부착된 후 배양 용기에 배지를 가하고 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계; 및

(e) 상기 배양 용기에 마이크로캐리어 또는 배지 중 1종 이상을 부가하여 줄기세포의 배양을 2주 이상 유지하면서 배양액을 계속 수득하는 단계;를 포함하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,

(d)의 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계는 10분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,

(d)의 교반과 멈춤을 반복하며 줄기세포를 3차원 부유 배양하는 단계는 20~80rpm으로 20분 내지 1시간 교반, 10분 내지 1시간 쉼을 반복하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,

(c) 단계는 5~10%의 저산소 조건으로 배양하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,

(e) 단계는 3~5일 간격으로 배양액을 수득하고 배지를 가하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,

(e) 단계는 6주 이상 배양하며 배양액을 수득하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 방법으로 제조되며, VEGF 8ng/ml 이상, HGF 7ng/ml 이상, 프로콜라겐 타입 1 펩타이드 9mg/ml 이상, TGFb-1 7ng/ml 이상이 함유된 성체 줄기세포 배양액.
청구항 7에 있어서,

성체 줄기세포 2차원 배양액에 비해 VEGF는 5~7배, HGF는 15~20배 함유하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포 배양액.
청구항 7 또는 청구항 8의 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물.