WO2011126177A1 - 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 - Google Patents

인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 Download PDF

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WO2011126177A1
WO2011126177A1 PCT/KR2010/003625 KR2010003625W WO2011126177A1 WO 2011126177 A1 WO2011126177 A1 WO 2011126177A1 KR 2010003625 W KR2010003625 W KR 2010003625W WO 2011126177 A1 WO2011126177 A1 WO 2011126177A1
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cell
cells
human
cadherin
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김효수
강현재
이은주
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서울대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells, high active stem cells induced by the method, and a cell therapeutic agent comprising the stem cells.
  • Stem cells are cells capable of differentiating into the various cells constituting biological tissues, which collectively refer to the undifferentiated cells obtained from each tissue of the embryo, fetus and adult. Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimulation (environment), and unlike the cells in which cell division is stopped due to differentiation, proliferation is possible due to cell division (self-renewal). It can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus, which is characterized by having plasticity in differentiation.
  • Stem cells can be divided into pluripotency, multipotency and unipotency stem cells according to their differentiation ability.
  • Pluripotent stem cells are embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS) that are pluripotency cells with the potential to differentiate into all cells. ) And the like.
  • Multipotent and / or unipotent stem cells include adult stem cells.
  • Embryonic stem cells are formed from the inner cell mass of the blastocytes, which are the early stages of embryonic development, and have the potential to differentiate into all cells, which can differentiate into any tissue cell, and in the undifferentiated state without being killed. Unlike adult stem cells, germ cells can be produced, and thus they can be inherited (Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al.). , Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
  • Human embryonic stem cells are prepared by separating and culturing only inner cell mass when forming human embryos. Currently, human embryonic stem cells made worldwide are obtained from frozen embryos remaining after infertility. Various attempts have been made to use human embryonic stem cells, which are capable of differentiating into all cells, as cell therapy, but have not yet fully controlled the risk of cancer and the high wall of immune rejection.
  • IPS which is included in the concept of pluripotent stem cells, is a cell which has redifferentiated differentiated adult cells in various ways and returned to embryonic stem cells, which are the early stages of differentiation.
  • iPS has been reported to have almost the same characteristics as embryonic stem cells, pluripotent stem cells, in gene expression and differentiation ability.
  • autologous cells can be used to exclude the risk of immune rejection, but the risk of cancer still remains to be solved.
  • mesenchymal stem cells have been proposed, along with immunomodulatory functions, without the risk of cancer.
  • Mesoderm stem cells are pluripotent cells capable of differentiation into adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons, cardiomyocytes, etc. and are known to have a function of regulating immune responses.
  • Mesoderm stem cells can be isolated and cultured in various tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue, but it is not easy to clearly define mesenchymal stem cells because the cell surface markers of each origin are slightly different. However, they can differentiate into osteocytes, chondrocytes, and muscle cells, have a swirling shape, and express the basic cell surface markers CD73 (+), CD105 (+), CD34 (-), and CD45 (-). It is generally defined as mesodermal stem cells. In this regard, for mesodermal stem cells having different genetic origins and / or backgrounds, there is usually no significant difference from each other with respect to the criteria for defining the existing mesodermal stem cells mentioned above, but usually their respective in vivo activity. In terms of the difference. In addition, when mesodermal stem cells are used as a cell-derived cell therapy, the available pool is limited, so even if the in vivo activity of the mesodermal stem cells is low, there is no choice and replacement is impossible.
  • mesenchymal stem cells are generally required to meet the minimum number of cells required for regenerative medicine and / or cell therapy (approximately 1 ⁇ 10 9 ) in order to be used as cell therapy. If so, the number of cells needed is increased. Therefore, in order to supply this amount from existing mesoderm stem cells of various origins, at least 10 passages are required in vitro (in vitro). In this case, the cells are aged and deformed, and thus no longer serve as cell therapeutics. The problem arises that is not suitable to achieve.
  • mesoderm stem cells which are expected to be the most desirable materials for cell therapy, to be used efficiently for the purpose of cell therapy, they induce high activity of mesoderm stem cells to produce a small number of highly active stem cells. Finding a way to maximize the treatment efficiency will be a task that the art needs to address in order to accelerate the practical use of cell therapies.
  • the present invention has been made in accordance with the above requirements, by providing a method for inducing high activity of senescent mesenchymal stem cells aging or relatively low in vivo, and furthermore, by enabling the mass production of highly active mesodermal stem cells, mesoderm It aims to maximize the practicality and therapeutic efficiency of stem cells as a cell therapy.
  • the present invention provides a method for increasing the activity of human mesoderm stem cells having a variety of genetic background and / or origin.
  • the present invention provides a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells, comprising the step of inducing and maintaining the formation of globular cell mass of human mesoderm stem cells and being controlled by E-cadherin.
  • the present invention also provides a highly active stem cell induced by the method, a cell therapy comprising the stem cell and the like.
  • the present invention also provides a system of high activity human mesoderm stem cell culture system regulated by E-cadherin, which comprises the following steps: 20 in human embryonic stem cell culture medium containing no basic fibroblast growth factor (bFGF). Suspension culture of human mesoderm stem cells using medium added with% serum replacement; And separating the spherical cell mass produced in the suspension culture and the cells not included in the spherical cell mass by using a strainer.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the present invention also provides a method for mass production of highly active human mesoderm stem cells controlled by E-cadherin using a bioreactor.
  • the present invention provides a system for mass-producing highly active human mesoderm stem cells controlled by E-cadherin using a bioreactor.
  • the present invention it is possible to maximize the practicality and treatment efficiency of the mesoderm stem cells as a cell therapeutic agent by increasing the bioactivity of the mesenchymal stem cells aging or relatively low in vivo activity.
  • the high activity induction method of the present invention is a standardized method that can be applied to various human mesoderm stem cells having different genetic backgrounds and / or origins, and thus can be very useful for developing and selecting a taga-derived cell therapy. will be.
  • the present invention will maximize the efficiency of human mesodermal stem cells to enable the derivation of appropriate high-performance human mesodermal stem cell numbers required for cell therapy and regenerative medicine.
  • the present invention also enables the mass production of highly active human mesoderm stem cells.
  • the present invention is expected to contribute to accelerate the practical use of cell therapy by increasing the efficiency of human mesoderm stem cells as a cell therapy, and furthermore, it is expected to contribute greatly to the development of treatments for intractable diseases such as cardiovascular diseases and neurological diseases. do.
  • Figure 1 shows that the suspension state is induced as a result of culturing human mesoderm stem cells using a medium from which bFGF (basic fibroblast growth factor) was removed from human embryonic stem cell media (ESM).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Figure 2 shows the results of inducing spheroid formation by floating culture of human mesoderm stem cells in a low adhesion dish (dish).
  • Figure 3 shows the result of inducing spheroid formation by floating culture of mesoderm stem cells against gravity in a culture dish lid.
  • Figure 4 shows the improvement of ischemic heart disease by quantifying the left ventricular end-diastolic dimension (LVE DD) and the left ventricular end- systolic dimension (LVESD).
  • LVE DD left ventricular end-diastolic dimension
  • LESD left ventricular end- systolic dimension
  • Figure 5 shows the improvement of ischemic heart disease by quantifying the left ventricular end-Ejection Fraction (LVEF) and Left ventricular end-Fractional Shortening (LVFS).
  • LVEF left ventricular end-Ejection Fraction
  • LVFS Left ventricular end-Fractional Shortening
  • Figure 6 shows the improvement of ischemic heart disease by quantifying the infarcted wall thickness and the infarct area, respectively.
  • FIG. 7 is a diagram showing that there is a large number of cells remaining near the ischemic heart in the case of the spheroid group injected with the globular cell mass compared to the group injected with the mesoderm stem cells which did not induce the formation of the globular cell mass.
  • Figure 8 is a picture confirming the expression of sacomeric actinin (Fig. 8a) and connexin 43 (Fig. 8b) in the sphere cell mass injection group.
  • Figure 9 shows the expression of the vascular specific marker isolecyin B4 in order to examine the effect on angiogenesis and quantified the results.
  • FIG. 12 shows the results of Western blot changes in the process of formation of Ca +2 dependent cell adhesion factors, N-cadherin and E-cadherin.
  • Figure 13 shows the effect on the formation of mesoderm stem cells when the function of E-cadherin is inhibited.
  • E-cadherin adenoviral vector overexpressing E-cadherin
  • Figure 15 shows the change in activity of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and V-akt murine thymoma viral oncogene homolog (AKT) according to the embodiment.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • AKT V-akt murine thymoma viral oncogene homolog
  • Figure 16 shows the effect of E-cadherin on the activity of ERK and AKT.
  • Figure 17 shows the results of the changes in activity of ERK and AKT using an adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector) overexpressing E-cadherin.
  • Figure 18 shows the effect of E-cadherin on cell growth of mesoderm stem cells.
  • Figure 19 shows the effect of E-cadherin on cell death of mesoderm stem cells.
  • Figure 20 shows the effect of E-cadherin on the secretory capacity of VEGF (Vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor) of mesoderm stem cells.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor
  • the present invention provides a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells. Specifically , the present invention includes the step of inducing and maintaining the formation of globular cell mass of human mesoderm stem cells, characterized in that it is controlled by E-cadherin.
  • the induction of globular cell mass may be performed by culturing mesoderm stem cells against gravity in a culture dish lid.
  • the culturing of the stem cells may be carried out using a serum exclusion medium containing 20% SR (serum replacement).
  • the serum exclusion medium may be a human embryonic stem cell culture medium that does not contain a basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the induction of globular cell mass may be performed using a serum exclusion medium containing 20% SR (serum replacement) in a low adherent culture dish.
  • SR serum replacement
  • the present invention also provides a system for culturing highly active human mesoderm stem cells .
  • the system includes the step of floating culture of human mesoderm stem cells to form a globular cell mass, the system is a step of separating the spherical cell mass and cells not included in the spherical cell mass using a strainer (strainer) It may further include.
  • a strainer strainer
  • the present invention also provides a highly active human mesoderm stem cell mass produced by the high activity induction method.
  • the present invention provides a cell therapy comprising the high activity human mesoderm stem cell mass.
  • the cell therapy agent may be used to form adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, or cardiomyocytes.
  • the cell therapy agent can be used for the treatment of cardiovascular disease.
  • Human mesoderm stem cells used in the present invention are not limited in their genetic background and / or origin.
  • human cord blood-derived mesoderm stem cells can be used.
  • the present invention also provides a method for mass-producing highly active human mesoderm stem cells using a bioreactor in order to overcome the limitations of plate culture in which existing cells are attached to and grown in a culture dish.
  • Bioreactors are bioreactors or systems or equipment that maintain and support a biologically active environment.
  • An example of the bioreactor is an apparatus for performing a chemical process for the production of an organism or a substrate made from a particular organism. Typically such devices are long cylindrical and can be manufactured in various sizes, from bench to mass production.
  • Another example of the bioreactor is a device or system for producing cells or tissues in cell culture. Such devices are commonly used and developed for histological use.
  • the bioreactor can induce spherical cell mass of human mesoderm stem cells, and further, if the formed spherical cell mass continues to be cultured in the bioreactor, it will be able to mass-produce highly active human mesodermal stem cells capable of growth without contact inhibition.
  • serum formation medium can be used to induce the formation of spheres by centrifugal force using a stir in a bioreactor. Subsequent cultures using the same medium will allow mass amplification of spherical highly active human mesodermal stem cells. will be.
  • SR serum replacement
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the present invention also provides a system for mass-producing highly active human mesoderm stem cells controlled by E-cadherin using a bioreactor.
  • the system may comprise the step of inducing the formation of globular cell mass of human mesoderm stem cells using a serum excrement medium in a bioreactor.
  • the system mass-produces the spherical cell mass using a medium in which 20% SR (serum replacement) is added to a human embryonic stem cell culture medium containing no basic fibroblast growth factor (bFGF). It may further comprise the step.
  • 20% SR serum replacement
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • human umbilical cord blood-derived mesodermal stem cells provided by MEDIPOST Co., Ltd. were used.
  • the cells were selected by performing human mesoderm stem cell identification experiments, and expressed more than 95% of positive cell markers (CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, HLA-ABC) and negative cell markers (CD34, CD45) of mesoderm stem cells.
  • HLA-DR was identified and classified as "human umbilical cord-derived mesoderm stem cells" after confirming uniform expression of less than 5% and confirming the multiple differentiation capacity of mesoderm stem cells.
  • the mesoderm stem cells were cultured by adding SR (serum replacement) to ⁇ -MEM (manufactured by Invitrogen), which is an existing mesoderm stem cell culture medium, but a suspension state was not made (see FIG. 1).
  • SR serum replacement
  • ⁇ -MEM manufactured by Invitrogen
  • the mesoderm stem cells were cultured using a medium in which basic fibroblast growth factor (bFGF) was removed from embryonic stem cell media (ESM).
  • the medium is a medium that does not contain fetal bovine serum.
  • DMEM / F-12 Invitrogen
  • 20% Knock out SR Invitrogen
  • 0.1 mmol / L ⁇ -mercaptoethanol Sigma
  • 1% non-essential amino acid Invitrogen
  • 50 IU / ml penicillin and 50 mg / ml A medium containing streptomycin (Invitrogen) was used.
  • the present inventors induced spheroid formation of human mesoderm stem cells using two methods, and spheres were successfully formed in both of the following methods.
  • human mesoderm stem cells were derived from a low adhesion dish (dish) using the floating state-induced medium of (1) to induce spheroid formation. The results are shown in FIG. 2.
  • Mesoderm globular cell mass induced by the above method was separated from cells which were not included in the spheroid formation by using a strainer.
  • the mesoderm stem cells were cultured (300-3000 cells / medium 20ul) against gravity in the culture dish lid to induce spherical formation and the results are shown in FIG. 3.
  • the method has the advantage of being able to make the size of the spheres formed uniform.
  • the ischemic cardiovascular rat model refers to an animal ischemic cardiovascular disease model made by inducing an ischemic state by ligation of the coronary artery of the heart.
  • the group injected with the spherical cell mass itself induced by the method of Example 1 spheroid
  • the group injected into a single cell after the formation of the spherical cell mass did not induce spherical cell mass formation
  • the cells were divided into groups injected (naive). At least seven rats were used for each of the groups.
  • ECG left ventricular end-diastolic dimension
  • LVESD left ventricular end- systolic dimension
  • LVESD left ventricular fractional shortening
  • Left ventricular end-fractional shortening (LVFS)) and left ventricular end-Ejection Fraction (LVEF) were quantified to analyze the improvement of the disease.
  • Left ventricular fractional shortening (LVFS) is defined as LVEDD-LVESD / LVEDD and left ventricular graft rate (LVEF) is defined as LVEDD 2 -LVESD 2 / LVEDD 2 .
  • Figure 6 shows the numerical representation of the infarcted wall thickness and the infarct area, respectively.
  • DAPI ', 6-diamidino-2-phenylindole
  • DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) is a hydrophobic and lipophilic substance that adheres to the cell's double lipid membrane and marks the cells in red. .
  • the spheroid group injected with the mesoderm stem cells that did not induce the formation of the globular cell mass confirmed that the cells remaining in the vicinity of the ischemic heart were significantly higher.
  • the remarkably large number of red stained with DiI means that the globular cell mass shows an excellent effect in terms of survival rate of the injected cells.
  • sacomeric actinin (S-actinin), a myocardial specific marker, to confirm whether the mesenchymal stem cells remaining near the ischemic heart were differentiated into cardiomyocytes that were lost to ischemia.
  • CX43 connexin 43
  • isolecyin B4 which is a vascular-specific marker, is significantly expressed in the spheroid group injected with the globular cell mass compared with the group injected with the mesoderm stem cells which do not induce the globular cell mass. (green stained portion), as shown in the graph quantifying the number per mm 2 it was confirmed that it exhibits more than twice the excellent angiogenic effect.
  • isolecyin B4 was significantly expressed in the spheroid injected group (spheroid) compared with the naive injected mesenchymal stem cells that did not induce spherical cell mass (stained with green). This means that the differentiation rate of mesodermal stem cells into vascular cells was significantly increased due to the spheroid formation.
  • mesodermal stem cells induces an increase in the activity of mesodermal stem cells and further maintains the formed spheres, which further increases the activity of mesodermal stem cells as compared to separating them into single cells after formation. Became clear.
  • EDTA was added to chelate calcium ions (Ca +2 ), a major function of cell adhesion factors.
  • Ca +2 calcium ions
  • FIG. 11 no sphere was formed upon addition of EDTA. That is, it was confirmed that the sphericity of mesoderm stem cells was prevented by the addition of Ca +2 chelator EDTA, and the sphericity was caused by Ca +2 dependent cell adhesion molecule.
  • E-cadherin may act as a major factor in the formation of spheres of human mesoderm stem cells, and thus the present inventors have a specific effect of the E-cadherin on the sphericity of the mesoderm stem cells and high activity of globular cell mass. In order to verify the following experiment was carried out.
  • an antibody having an E-cadherin neutralization function is used, which is a method of removing intercellular adhesion of E-cadherin by using an antibody that recognizes and attaches a cell membrane portion of E-cadherin.
  • spheres were formed in the group treated with IgG and the cell control (naive) that did not process anything, but it was confirmed that spheres were not formed in the E-cadherin inhibitory group (neu E-cad). It was.
  • the Naive group is intended to confirm that the conditions of the antibody treatment group are not special conditions for killing or activating cells, and usually yield the same results compared to the IgG group.
  • E-cadherin adenoviral vector E-cadherin adenoviral vector
  • a vector containing LacZ gene instead of E-cadherin was used as an E-cadherin adenoviral vector control.
  • a na ⁇ ve cell treated with adenoviral vector was used as a cell control for adenoviral vecor (E-cadherin and LacZ) treated groups. After treating the vector for 4 hours to the cells, the effect of inducing the formation was confirmed after 5 hours and 24 hours.
  • the Naive group is intended to confirm that the conditions of the vector treatment group are not special conditions for killing or activating cells, and usually yield the same results compared to the LacZ group.
  • E-cadherin is a major factor regulating the formation of mesoderm stem cells.
  • E-cadherin directly regulates these activators. Specifically, single-cell treatment was performed using an antibody having the function of E-cadherin neutralization, and spherical formation was confirmed by western blot.
  • the naive group which refers to a cell control group not subjected to antibody treatment, is to confirm that the condition of the antibody treatment group is not a special condition for killing or activating cells, and usually produces the same result compared to the IgG group.
  • results were re-validated using an adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector) that overexpresses E-cadherin.
  • E-cadherin adenoviral vector control a vector containing LacZ gene instead of E-cadherin was used as an E-cadherin adenoviral vector control.
  • Naive cells that were not treated with adenoviral vectors were used as cell controls for adenoviral vecor (E-cadherin and LacZ) treatment groups.
  • the Naive group is intended to confirm that the conditions in the vector treatment group are not special conditions for killing or activating cells, and usually yield the same results compared to the LacZ group.
  • E-cadherin overexpression group (E-cad) was shown to increase the activation of ERK and AKT (increase pAKT and pERK) compared to naive and LacZ group.
  • E-cadherin The effects of E-cadherin on the growth and apoptosis of mesoderm stem cells were examined.
  • cell growth for the E-cadherin overexpression group, naive and LacZ group was examined by flow cytometry. After overexpressing E-cadherin for 24 hours, single cells were isolated and stained for cell nuclei. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The growth of the cell is assessed by the percentage of the S phase that labels the active cell growth during the cell cycle.
  • E-cadherin overexpression group (E-cad) was found to increase the S phase, which is the main growth stage for mesoderm stem cell activity.
  • E-cadherin overexpression (E-cad) apoptosis was reduced.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • ELISA using real time PCR and antigen antibody reaction was performed for the E-cadherin overexpression group, naive and LacZ group, and the mRNA and protein levels were compared, respectively, and are shown in FIG. 20.
  • VEGF-specific primers VEGF-real-time PCR
  • VEGF was relatively increased at both E-cadherin overexpression (E-cad) mRNA and protein levels.
  • E-cadherin is not only a specific inducer of human mesoderm stem cells but also acts as a regulator of various in vivo activities. It is obvious that it promotes and further induces high activity of globular cell mass.
  • the method of inducing highly active human mesoderm stem cells of the present invention is a standardized method that can be applied to all human mesoderm stem cells having different genetic backgrounds and / or origins and is very useful for developing and selecting a taga-derived cell therapy.
  • the present invention also enables the mass production of highly active human mesoderm stem cells.
  • the present invention is expected to contribute to accelerate the practical use of cell therapy by increasing the efficiency of human mesoderm stem cells as a cell therapy, and furthermore, it is expected to contribute greatly to the development of treatments for intractable diseases such as cardiovascular diseases and nervous system diseases. .

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Abstract

본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도방법에 관한 것으로, 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하고 이를 유지시키는 단계를 포함하며 E-cadherin에 의해 조절되는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 유도된 고활성 줄기세포, 상기 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등에 관한 것이다.

Description

인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법
본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 유도된 고활성 줄기세포, 및 상기 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ES cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및 또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있다.
배아줄기세포는 배아발생초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성되며, 모든 세포로 분화가능한 잠재력을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고 미분화상태에서 배양가능하며, 성체줄기세포와 달리 배세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어진 것이다. 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암발생의 위험과 면역거부반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정이다.
이에 대한 보완책으로 최근 보고되고 있는 것으로 유도만능줄기세포 (iPS) 가 있다. 만능줄기세포의 개념으로 포함되고 있는 iPS 는 분화가 끝난 성체세포를 여러 가지 방법으로 역분화시켜, 분화 초기 단계인 배아줄기세포로의 상태로 회귀시킨 세포이다. 현재까지 iPS 는 유전자 발현과 분화능에서 만능줄기세포인 배아줄기세포와 거의 동일한 성격을 나타내는 것으로 보고 되어 있다. 이러한 iPS 의 경우, 자가 세포를 이용하여 면역거부반응의 위험성은 배제할 수 있으나 암발생의 위험성은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.
최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중배엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
중배엽 줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등 다양한 조직에서 분리, 배양이 가능하나 각 기원에 따른 세포 표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중배엽 줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현하는 경우 일반적으로 중배엽 줄기세포로 규정하고 있다. 이와 관련하여, 상이한 유전적 기원 및/또는 배경을 가지는 중배엽 줄기세포들의 경우, 위에서 언급한 기존의 중배엽 줄기세포를 규정하는 기준들에 대하여는 서로 유의적 차이를 나타내지 아니하지만 통상적으로 각각의 생체내 활성에 있어서는 차이를 나타내게 된다. 또한 중배엽 줄기세포를 타가 유래 세포치료제로 사용하는 경우, 사용가능한 pool 이 한정적이므로 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도가 낮아도 선택의 여지가 없어 대체가 불가능한 경우가 발생한다.
이에 더하여, 일반적으로 중배엽 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및/또는 세포치료 분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X109 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 따라서 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하려면 in vitro(생체외)실험에서 최소 10번 이상의 계대배양이 필요하게 되는데 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 더 이상 세포치료제로서의 목적을 달성하기에는 적합하지 아니하게 되는 문제가 발생한다.
상기와 같은 문제점을 고려해 볼 때, 세포치료제의 가장 바람직한 재료로 기대되고 있는 중배엽 줄기세포가 세포치료의 목적으로 효율적으로 사용되기 위해서는 중배엽 줄기세포의 고활성을 유도하여 적은 수의 고활성 줄기세포로 치료효율을 극대화시킬 수 있는 방안을 찾는 것이 세포치료제의 실용화를 앞당기기 위해 당업계가 해결해야 할 과제라 할 것이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 노화되거나 상대적으로 생체내 활성도가 낮은 중배엽 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법을 제공하고 나아가 고활성 중배엽 줄기세포의 대량생산을 가능하게 함으로써, 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 실용성 및 치료효율을 극대화시키는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다양한 유전적 배경 및/또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시키는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하고 이를 유지시키는 단계를 포함하며 E-cadherin에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는, 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 유도된 고활성 줄기세포, 상기 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등을 제공한다.
또한 본 발명은 E-cadherin 에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포 배양시스템으로, 하기 단계를 포함하는 시스템을 제공한다: bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 인간 중배엽 줄기세포를 부유배양하는 단계; 및 상기 부유배양에서 생성된 구형 세포괴와 구형 세포괴에 포함되지 않은 세포를 스트레이너(strainer)를 이용하여 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 생물반응장치(Bioreactor)를 이용하여 E-cadherin에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물반응장치(Bioreactor)를 이용하여 E-cadherin에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 시스템을 제공한다.
본 발명에 따르면, 노화되거나 상대적으로 생체내 활성도가 낮은 중배엽 줄기세포의 생체활성을 증가시켜 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 실용성 및 치료효율을 극대화시킬 수 있다. 또한 본 발명의 고활성 유도 방법은 상이한 유전적 배경 및/또는 기원을 가지는 다양한 인간 중배엽 줄기세포에 모두 적용할 수 있는 규범화된 방법으로 타가 유래 세포치료제 개발 및 선발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
이에 더하여, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 효율을 극대화시킴으로써 세포치료 및 재생의학에서 필요로 하는 고기능의 적절한 인간 중배엽 줄기 세포수의 도출을 가능하게 할 것이다. 또한 본 발명은 고활성 인간 중배엽 줄기세포의 대량생산을 가능하게 한다.
궁극적으로, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대되며 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료제 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 인간 배아줄기세포 배양배지(ESM: embryonic stem cell media)에서 bFGF (basic fibroblast growth factor) 를 제거한 배지를 이용하여 인간 중배엽 줄기세포를 배양한 결과 부유상태가 유도된 것을 나타내는 것이다.
도 2는 인간 중배엽 줄기세포를 저부착 디쉬(dish)에서 부유배양하여 구체형성을 유도한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 배양 디쉬(dish) 뚜껑에서 중력에 반하게 중배엽 줄기세포를 부유배양하여 구체형성을 유도한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 좌심실 확장기내경(Left ventricular end-diastolic dimension (LVE DD)) 및 좌심실 수축기내경(Left ventricular end- systolic dimension(LVESD))을 수치화 하여 허혈성 심장 질환의 호전여부를 나타낸 것이다.
도 5는 e좌심실 구혈률(Left ventricular end-Ejection Fraction(LVEF)) 및 좌심실 분획단축(Left ventricular end-Fractional Shortening(LVFS)을 수치화 하여 허혈성 심장 질환의 호전여부를 나타낸 것이다.
도 6은 심장벽의 두께(infarcted wall thickness) 및 섬유화 면적 (infarct area)을 각각 수치화하여 허혈성 심장 질환의 호전여부를 나타낸 것이다.
도 7은 구형세포괴 형성을 유도하지 아니한 중배엽 줄기세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 구형세포괴를 주입한 그룹(spheroid) 의 경우, 허혈성 심장 부근에 남아 있는 세포가 현저히 많음을 보여주는 그림이다.
도 8은 구형세포괴 주입군에서 sacomeric actinin(도 8a) 및 connexin 43(도 8b)의 발현을 확인한 그림이다.
도 9는 혈관형성에 대한 효과를 살펴보기 위하여 혈관특이적 표지자인 isolecyin B4 의 발현여부를 확인하고 그 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 10은 주입한 중배엽 줄기세포의 혈관세포로의 분화 여부를 살펴보기 위하여 Isolecyin B4 의 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 EDTA 첨가시 구체가 형성되지 아니함을 나타내는 결과이다.
도 12는 Ca+2 의존성 세포부착인자인 N-cadherin 및 E-cadherin 의 구체형성과정에서의 변화를 western blot 을 이용하여 살펴본 결과이다.
도 13은 E-cadherin 의 기능을 억제시킨 경우 중배엽 줄기세포의 구체형성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 E-cadherin 을 과발현시키는 adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector)를 이용하여 구체형성에 미치는 효과를 살펴본 결과이다.
도 15는 구체형성에 따른 ERK(extracellular signal-regulated kinase) 및 AKT(V-akt murine thymoma viral oncogene homolog)의 활성도 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 ERK 및 AKT의 활성도에 미치는 E-cadherin 의 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 E-cadherin 을 과발현시키는 adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector)를 이용하여 ERK 및 AKT의 활성도 변화를 살펴본 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 세포생장에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 세포 사멸에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 VEGF (Vascular endothelial growth factor, 혈관내피세포 성장인자) 분비능에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하고 이를 유지시키는 단계를 포함하며 E-cadherin에 의해 조절되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 구형세포괴 유도는 배양 디쉬(dish) 뚜껑에서 중력에 반하게 중배엽 줄기세포를 배양하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포의 배양은 20% SR(serum replacement)을 포함하는 혈청배제배지를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 혈청배제배지는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 구형세포괴 유도는 저부착 배양 디쉬(dish)에서 20% SR(serum replacement)을 포함하는 혈청배제배지를 사용하여 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 배양하는 시스템을 제공한다. 구체적으로, 상기 시스템은 인간 중배엽 줄기세포를 부유배양하여 구형세포괴를 형성하는 단계를 포함하며, 상기 시스템은 생성된 구형 세포괴와 구형 세포괴에 포함되지 않은 세포를 스트레이너(strainer)를 이용하여 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 고활성 유도 방법에 의해 생성된 고활성 인간 중배엽 줄기세포괴를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 고활성 인간 중배엽 줄기세포괴를 포함하는 세포치료제를 제공한다. 상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 또는 심근세포 형성에 이용될 수 있다. 상기 세포치료제는 심혈관 질환의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인간 중배엽 줄기세포는 그 유전적 배경 및/또는 기원에 있어서 제한이 없다. 예를 들면 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 기존의 세포를 배양접시에 부착시켜 늘어 놓고 키우는 평판 배양의 한계를 극복하기 위하여, 생물반응장치(Bioreactor)를 이용하여 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 방법을 제공한다.
Bioreactor는 생물반응장치로 생물학적으로 활성적 환경을 유지 및 지지하는 시스템 또는 장비이다. 상기 bioreactor 의 일 예로, 유기체나 특정 유기체에서 만들어지는 기질의 생산을 위한 화학 공정을 수행하는 장치를 들 수 있다. 통상 이러한 장치는 긴 원통형이고 사이즈는 벤치용에서 대량 생산용까지 다양하게 제작 가능하다. 상기 bioreactor 의 또 다른 일 예로, 세포 배양에서 세포나 조직의 생산 장치 또는 시스템을 들 수 있다. 이러한 장치는 조직공학적 용도로 통상 사용 개발되고 있다. 상기 bioreactor 내에서 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴를 유도할 수 있으며, 나아가 형성된 구형세포괴를 bioreactor 내에서 계속 배양하면 contact inhibition 없이 성장이 가능한 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량 생산할 수 있을 것이다. 즉, 혈청배제배지 등을 사용하여 bioreactor 에서 stir 등을 이용한 원심력으로 구체 형성을 유도할 수 있으며, 이후 동일 배지를 이용하여 계속적으로 배양하면 구형의 고활성 인간 중배엽 줄기세포의 대량 증폭이 가능하게 될 것이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 생물반응장치(bioreactor)내에서 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 상기 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산할 수 있다.
또한 본 발명은 생물반응장치(bioreactor)를 이용하여 E-cadherin 에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 시스템은 생물반응장치(bioreactor)내에서 혈청배제배지를 사용하여 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 시스템은 상기 구형세포괴를 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 대량생산하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명에서는 MEDIPOST(주)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 인간 중배엽 줄기세포 동정 실험을 실시하여 선별된 것으로, 중배엽 줄기세포의 양성 세포 표지자(CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, HLA-ABC) 95%이상 표현과 음성 세포 표지자(CD34, CD45, HLA-DR) 5% 미만의 획일적 표현 확인, 및 중배엽 줄기세포의 다중 분화능을 확인한 후 “인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포”로 동정ㆍ분류된 것이다.
실시예 1. 인간 중배엽 줄기세포의 구체 형성 유도
(1) 구체형성 유도배지
먼저 상기 중배엽 줄기세포를 기존의 중배엽 줄기세포 배양 배지인 α-MEM(Invitrogen 사 제조)에 SR(serum replacement)을 첨가하여 부유배양을 시도하였으나 부유상태가 만들어지지 아니하였다 (도 1 참조).
다음으로, 상기 중배엽 줄기세포를 인간배아 줄기세포 배양배지(ESM: embryonic stem cell media)에서 bFGF (basic fibroblast growth factor) 를 제거한 배지를 이용하여 배양한 결과 부유상태를 유도하는데 성공하였다(도 1 참조). 상기 배지는 fetal bovine serum(소혈청) 이 포함되지 아니한 배지이다. 구체적으로, DMEM/F-12(Invitrogen), 20% Knock out SR (Invitrogen), 0.1mmol/L β-mercaptoethanol(Sigma), 1% 비필수아미노산 (Invitrogen) 및 50 IU/ml 페니실린 및 50mg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 배지를 사용하였다.
(2) 구체형성방법
본 발명자들은 2가지 방법을 이용하여 인간 중배엽 줄기세포의 구체형성을 유도하였으며, 하기 2가지 방법 모두에서 성공적으로 구체가 형성되었다.
먼저 인간 중배엽 줄기세포를 저부착 디쉬(dish)에서 상기 (1)의 부유상태유도배지를 사용하여 구체형성을 유도하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 방법으로 유도된 중배엽 구형세포괴는 스트레이너(strainer)를 이용하여 구체형성에 포함되지 아니한 세포와 분리하였다.
구체형성을 유도하기 위한 또 다른 방법으로, 배양 디쉬 뚜껑에서 중력에 반하게 중배엽 줄기세포를 배양(300~3000 cells/배지 20ul)하여 구체 형성을 유도하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 방법은 형성되는 구체의 크기를 균일하게 할 수 있는 장점이 있다.
실시예 2. 구체형성의 효과 - 생체내 활성도에 미치는 영향
허혈성 심혈관 래트(rat) 모델을 이용하여 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도를 평가하였다. 상기 허혈성 심혈관 래트 모델이라 함은 심장의 관상동맥을 결찰시켜 허혈상태를 유도하여 만든 동물 허혈성 심혈관 질환 모델을 의미한다.
상기 실시예 1.의 방법에 의해 유도된 구형세포괴 자체를 주입한 그룹(spheroid), 구형세포괴 형성 후 다시 단독세포(single cell)로 만들어 주입한 그룹(dissociate), 그리고 구형세포괴 형성을 유도하지 않은 세포를 주입한 그룹(naive)으로 나누어 진행하였다. 상기 그룹 각각에 대하여 최소 7 마리 이상의 래트(rat)를 사용하였다.
(1) 심전도 측정
상기 질환 모델화 후 4일째 baseline 심전도를 측정하였으며, 상기 질환 모델화 후 7일째에 상기 줄기세포를 상기 질환 모델에 주입하였다. 구체적으로, 마찰력이 없는 유리로 만들어진 헤밀턴 실린지를 이용하여 허혈성 심장질환이 유도된 심근 주위에 주입하였으며, 래트 한 마리당 주입된 중배엽 줄기세포수는 1X105 개가 되도록 조정하였다. 상기 세포 주입 후, 4 주째 및 8 주째에 심전도를 측정한 후 좌심실 확장기내경(Left ventricular end-diastolic dimension(LVEDD)), 좌심실 수축기내경(Left ventricular end- systolic dimension(LVESD)), 좌심실 분획단축(Left ventricular end-Fractional Shortening(LVFS)), 및 좌심실 구혈률(Left ventricular end-Ejection Fraction(LVEF)) 을 수치화 하여 질환의 호전여부를 분석하였다. 좌심실 분획단축(LVFS)은 LVEDD-LVESD/LVEDD으로 정의되며 좌심실 구혈률 (LVEF)은 LVEDD2-LVESD2/LVEDD2 로 정의된다. 좌심실 확장기내경(LVEDD) 및 좌심실 수축기내경(LVESD)이 작을수록, 좌심실 분획단축(LVFS) 및 좌심실 구혈률 (LVEF)이 클수록 높은 호전도를 나타낸다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 구형세포괴 자체를 주입한 그룹(spheroid) 및 구형세포괴 형성 후 다시 단독세포(single cell)로 만들어 주입한 그룹(dissociate)의 경우, 구형세포괴 형성을 유도하지 않은 세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 좌심실 확장기내경(LVEDD) 및 좌심실 수축기내경(LVESD)이 작게 나타났다. 특히 구형세포괴 자체를 주입한 그룹(spheroid)의 경우, 구형세포괴 형성을 유도하지 않은 세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 현저하게 낮은 LVEDD 및 LVESD 값을 나타내었으며, 또한 구형세포괴 형성 후 다시 단독세포(single cell)로 만들어 주입한 그룹(dissociate)과 비교시에도 낮은 LVEDD 및 LVESD 값을 나타내었다.
또한 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 구형세포괴 자체를 주입한 그룹(spheroid) 및 구형세포괴 형성 후 다시 단독세포(single cell)로 만들어 주입한 그룹(dissociate)의 경우, 구형세포괴 형성을 유도 하지 않은 세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 높은 좌심실 분획단축(Left ventricular end-Fractional Shortening(LVFS) 및 좌심실 구혈률(Left ventricular end-Ejection Fraction(LVEF) 값을 나타내었다. 특히 구형세포괴 자체를 주입한 그룹(spheroid)의 경우, 구형세포괴 형성을 유도하지 않은 세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 현저하게 높은 LVFS 및 LVEF 값을 나타내었 으며, 또한 구형세포괴 형성 후 다시 단독세포(single cell)로 만들어 주입한 그룹(dissociate)과 비교시에도 높은 LVFS 및 LVEF 값을 나타내었다.
상기 결과로부터, 구형세포괴 자체를 주입한 경우 높은 호전도를 나타냄을 알 수 있다.
(2) 심장의 크기 및 섬유화 비교
심전도 측정에 더하여 상기 구형세포괴 주입시 전체적인 심장벽의 두께 및 섬유화(fibrosis)에 미치는 효과를 살펴보았다. 도 6은 심장벽의 두께 (infarcted wall thickness) 및 섬유화 면적 (infarct area)을 각각 수치화하여 나타낸 것이다.
일반적으로 심장이 허혈에 노출되었을 경우, 심장벽의 섬유화로 인해 심벽이 얇아지고, 운동성 상실과 부피 확장이 일어난다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 구형세포괴 자체를 주입한 경우, 구형세포괴를 형성하지 아니한 세포를 주입한 그룹과 비교시 허혈에 노출되었음에도 통상적으로 허혈이 진행됨에 따라 나타나는 심벽의 얇아지고 섬유화가 진행되는 현상이 상대적으로 현저히 줄어 든 것을 알 수 있다. 또한 구형세포괴 자체를 주입한 경우, 구형세포괴 형성 후 다시 single cell 로 분리 후 주입한 군과 비교시 심벽의 얇아지고 섬유화가 진행되는 현상이 상대적으로 줄어 든 것을 알 수 있다.
(3) 심장의 조직학적 분석
심장 허혈 모델에 대한 생체내 활성도(호전도)와 관련하여 그 원인을 밝히기 위하여 심장을 조직학적으로 분석하는 실험을 수행하였다. 주입 후 잔존하는 중배엽 줄기세포의 추적을 용이하게 하기 위하여, 세포에 DiI 염색을 한 후 허혈 모델에 주입하였다. 조직에서의 주입된 세포의 확인을 위해 심장조직을 샘플링하여, 전체 세포를 DAPI로 핵염색 하고 형광 현미경으로 확인하였다. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 는 모든 세포의 이중나선 DNA 의 AT cluster 의 minor groove 에 강하게 부착하여 푸른색 형광을 나타내는 물질이다.
DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) 는 소수성 및 친지성 (hydrophobic and lipophilic)을 띠는 물질로 세포의 이중 지질막에 부착하여 붉은색으로 세포를 표지시킨다.
도 7에 나타난 바와 같이, 구형세포괴 형성을 유도하지 아니한 중배엽 줄기세포를 주입한 그룹(naive)에 비하여 구형세포괴를 주입한 그룹(spheroid) 의 경우, 허혈성 심장 부근에 남아 있는 세포가 현저히 많음을 확인할 수 있었다. 즉, DiI 으로 염색된 세포(red)가 현저히 많다는 것은 주입된 세포의 생존율(survival rate)면에서 구형세포괴가 탁월한 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
또한 허혈성 심장 부근에 잔존하는 중배엽 줄기세포가 허혈로 소실된 심근세포로 분화가 진행되었는지를 확인하기 위하여 심근 특이적 표지자인 sacomeric actinin (S-actinin)의 발현을 확인하였으며, 이에 더하여 남아 있는 심근세포와의 연결에 중요한 역할을 하는 connexin 43(CX43) 의 발현을 확인하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 구형세포괴 주입군에서 S-actinin (green 으로 염색된 부분)의 발현이 확인되었으며(도 8a 참조), 이는 허혈성 심장 부근에 남아 있는 중배엽 줄기세포가 소실된 심근세포로 분화 유도되었음을 의미한다. 또한 구형세포괴 주입군에서 심근세포 기능에 중요한 connexin 43(green 으로 염색된 부분)의 발현도 확인되었다(도 8b 참조).
이에 더하여 허혈심장의 호전에 가장 중요한 혈관형성에 대한 효과를 살펴보는 실험을 수행하였다. 구체적으로 혈관특이적 표지자인 isolecyin B4 의 발현여부를 확인하고 그 결과를 정량화 하여 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 구형세포괴를 유도하지 아니한 중배엽 줄기세포를 주입한 군(naive) 에 비하여 구형세포괴를 주입한 군 (spheroid)에서 혈관특이적 표지자인 isolecyin B4 이 현저하게 발현됨을 알 수 있으며(green 으로 염색된 부분), mm2 당 그 수를 정량화 한 그래프에서 알 수 있는 바와 같이 2배 이상의 탁월한 혈관형성 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
이러한 혈관형성에 있어서의 차이가 허혈 모델에 남아 있는 중배엽 줄기 세포의 혈관세포로의 분화에 기인한 것인지를 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로 DiI 와 함께 isolectin B4 로 염색하여 그 결과를 분석하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 구형세포괴를 유도하지 아니한 중배엽 줄기세포를 주입한 군(naive) 에 비하여 구형세포괴를 주입한 군 (spheroid)에서 isolecyin B4 이 현저하게 발현됨을 알 수 있으며(green 으로 염색된 부분), 이는 구체형성으로 인하여 중배엽 줄기세포의 혈관세포로의 분화율이 현저히 증가되었다는 것을 의미한다.
상기 결과로부터 인간 중배엽 줄기세포를 부유배양하여 구체를 형성하고 또한 이를 다시 single cell 로 분리하지 않고 그대로 유지시킨 상태의 구형세포괴를 허혈성 심장 질환 모델에 주입시, 구체를 형성하지 아니한 세포 및 구체형성 후 다시 분리된 단독세포에 비하여 현저히 증가된 치료효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한 구형세포괴 주입군에서 허혈성 심장 질환에 대한 향상된 치료효과를 나타내는 것은 구체형성으로 인하여 중배엽 줄기세포의 세포생존율, 심근세포로의 분화효율, 혈관형성능 등이 현저하게 증가된 것에 기인함을 확인하였다.
결론적으로, 중배엽 줄기세포의 구체형성유도는 중배엽 줄기세포의 활성의 증가를 유도하고 더 나아가 형성된 구체를 유지하는 것이 구체형성 후 다시 single cell 로 분리하는 것에 비하여 중배엽 줄기세포의 활성을 더욱 증가시킨다는 것이 명백해졌다.
실시예 3. 구체형성의 기전분석 - 생체내 활성차이 검증
상기 실시예 2에서 살펴본 생체내 활성도 차이를 유발하는 구체형성의 기전을 분석하는 실험을 실시하였다.
먼저 EDTA를 첨가하여 세포의 부착인자 중 주요한 기능을 하는 칼슘이온(Ca+2)을 킬레이트화 시켜 보았다. 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이 EDTA 첨가시 구체가 형성되지 아니하였다. 즉, 중배엽 줄기세포의 구체형성이 Ca+2 chelator 인 EDTA 첨가로 인해 방해되는 것으로 확인됨으로써 구체형성은 Ca+2 의존성 세포부착인자(cell adhesion molecule)에 의하여 일어남을 알 수 있다.
이에, Ca+2 의존성 세포부착인자인 N-cadherin 및 E-cadherin 의 구체형성과정에서의 변화를 western blot 을 이용하여 살펴보았다. 도 12에서 알 수 있는 바와 같이, N-cadherin 의 경우, 부유배양 (anchorage deprivation)에 의해 구체형성이 유도됨에 따라 없어지는 것으로 나타났으며, 이의 counterpart 로 알려져 있는 E-cadherin 은 구체 형성이 유도됨에 따라 그 발현이 증가하는 것으로 나타났다. α-tubulin을 대조군으로 사용하였다.
상기 결과로부터 E-cadherin 이 인간 중배엽 줄기세포의 구체 형성의 주요인자로 작용할 수 있음이 확인되었으며, 이에 본 발명자들은 상기 E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 구체형성 및 구형세포괴의 고활성에 미치는 구체적인 효과를 검증하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.
실시예 4. E-cadherin 의 활성 확인 - 구체형성 및 구형세포괴의 고활성에 미치는 효과
(1) 구체형성에 미치는 효과
먼저 E-cadherin 의 기능을 억제시킨 경우 중배엽 줄기세포의 구체형성에 미치는 효과를 살펴보았다.
구체적으로, E-cadherin neutralization 기능이 있는 항체를 이용하였으며, 이는 E-cadherin 의 세포막 부분을 인지하여 부착하는 항체를 이용하여 E-cadherin 의 세포간 부착 작용을 제거하는 방법이다.
도 13에서 알 수 있는 바와 같이, IgG 를 처리한 그룹 및 아무것도 처리하지 않은 세포 대조군(naive) 에서는 구체가 형성되었지만 E-cadherin 기능 억제 그룹(neu E-cad)에서는 구체 형성이 이루어지지 않는 것을 확인하였다. Naive 군은 항체처리 그룹의 조건이 세포를 사멸하거나 활성화시키는 특수조건이 아님을 확인하기 위한 것으로, IgG 그룹과 비교하여 통상적으로 동일한 결과를 도출한다.
이에 더하여 E-cadherin 을 과발현시키는 adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector)를 이용하여 구체형성에 미치는 효과를 재검증하였다. 동일 vector에서 E-cadherin 대신 LacZ 유전자가 들어간 vector 를 E-cadherin adenoviral vector 대조군으로 사용하였다. adenoviral vector 를 처리하지 않은 세포군(naive)은 adenoviral vecor (E-cadherin 및 LacZ) 처리 그룹에 대한 세포 대조군으로 사용하였다. 세포에 vector 를 4시간 동안 처리한 후, 구체형성을 유도하여 5시간 및 24시간 후 구체형성 유도 효과를 살펴보았다. Naive 군은 vector 처리군의 조건이 세포를 사멸하거나 활성화시키는 특수조건이 아님을 확인하기 위한 것으로, LacZ 그룹과 비교하여 통상적으로 동일한 결과를 도출한다.
도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 중배엽 줄기세포에 E-cadherin 을 과발현 시켰을때(E-cad), E-cadherin 의 기능 억제 때와는 반대로 구체 형성이 빠르게 진행되고 유도효율이 증대되는 것으로 나타났다.
상기 결과로부터 E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 구체형성을 조절하는 주요한 인자임이 명백해졌다.
(2) ERK 및/또는 AKT 에 대한 영향
세포의 생리기전 설명시 ERK(extracellular signal-regulated kinase) 와 AKT(V-akt murine thymoma viral oncogene homolog)의 인산화를 통한 활성화는 세포의 활성을 나타내는 가장 핵심적 factor 이다. 따라서 먼저 구체형성에 따른 이들의 활성도를 확인하는 실험을 실시하였다. 상기 실시예 1의 방법에 따라 구체 형성을 유도한 후 30분, 1시간, 3시간 간격으로 세포를 샘플링하였다. ERK 와 AKT 의 인산화는 통상적으로 각종 처리 후 3시간 이내에 확인되므로 위와 같은 시간대로 샘플링하여 인산화 정도를 평가하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 부유배양(anchorage deprivation)으로 구형세포괴가 형성됨에 따라 전체 AKT(tAKT) 및 ERK(tERK) 중 활성화된 AKT(pAKT) 및 ERK(pERK) 가 증가됨을 알 수 있다. 상기 결과로부터, 중배엽 줄기세포의 부유배양으로 인한 구형세포괴 형성은 AKT 및 ERK 모두를 활성화 시키는 결과를 나타내며 이는 또한 AKT 및 ERK 통로가 인간 중배엽 줄기세포 구체 형성에 따른 활성 통로가 될 수 있음을 시사하는 결과이기도 하다.
다음으로, 이러한 활성인자를 E-cadherin 이 직접적으로 조절하는지를 확인하는 실험을 실시하였다. 구체적으로 E-cadherin neutralization 기능이 있는 항체를 이용하여 단일 세포에 처리하고, 구체 형성을 유도하여 western blot 으로 확인하였다.
구체적으로 E-cadherin 의 세포막 부분을 인지하여 부착하는 항체로 E-cadherin 의 세포간 부착 작용을 제거 후 샘플링하여 인산화 정도를 평가한 후 그 결과를 도 16에 나타내었다. 항체 처리가 되지 않은 세포 대조군을 지칭하는 naive 그룹은 항체 처리그룹의 조건이 세포를 사멸하거나 활성화시키는 특수조건이 아님을 확인하기 위한 것으로, IgG 그룹과 비교하여 통상적으로 동일한 결과를 도출한다.
도 16에서 알 수 있는 바와 같이, control 그룹인 IgG 를 처리한 그룹 및 naive 그룹 에서는 활성화된 pAKT 및 pERK 의 변화가 없는 반면, E-cadherin 기능 억제 그룹(neuE-cad) 에서는 AKT 및 ERK의 활성도가 감소하는 것을 확인하였다(pAKT 및 pERK 감소).
이에 더하여 E-cadherin 을 과발현시키는 adenoviral vector (E-cadherin adenoviral vector)를 이용하여 상기 결과를 재검증하였다.
동일 vector에서 E-cadherin 대신 LacZ 유전자가 들어간 vector 를 E-cadherin adenoviral vector 대조군으로 사용하였다. Adenoviral vector 를 처리하지 않은 세포군(naive)은 adenoviral vecor (E-cadherin 및 LacZ) 처리 그룹에 대한 세포 대조군으로 사용하였다. Naive 그룹은 vector 처리그룹의 조건이 세포를 사멸하거나 활성화시키는 특수조건이 아님을 확인하기 위한 것으로, LacZ 그룹과 비교하여 통상적으로 동일한 결과를 도출한다.
도 17에서 알 수 있는 바와 같이, E-cadherin 과발현 그룹(E-cad)에서 naive 및 LacZ 그룹에 비하여 ERK 와 AKT 의 활성화가 증대(pAKT 및 pERK 증가)되는 것으로 나타났다.
(3) 세포 생장 및 세포사멸에 미치는 효과
E-cadherin 이 중배엽 줄기세포의 생장 및 사멸에 미치는 효과를 살펴보았다.
구체적으로, E-cadherin 과발현 그룹, naive 및 LacZ 그룹에 대한 세포 생장력을 유세포분석을 통해 살펴보았다. E-cadherin 을 24시간 과발현 시킨 후 단일 세포로 분리하여 세포핵을 염색한 후 유세포 분석기로 cell cycle 을 분석하였다. Cell cycle 중 활발한 세포의 생장을 표지하는 합성기(S phase)의 %로 그 세포의 생장력을 평가한다.
도 18에 나타난 바와 같이, navie 및 LacZ 그룹에 비해 E-cadherin 과발현 그룹(E-cad)에서 중배엽 줄기세포의 활성에 주요한 생장기인 S phase 가 증가되는 것으로 확인되었다.
또한 도 19에 나타난 바와 같이, E-cadherin 과발현시(E-cad) 세포사멸이 감소되는 것으로 확인되었다.
(4) VEGF 의 분비능에 미치는 효과
E-cadherin이 중배엽 줄기세포의 VEGF (Vascular endothelial growth factor, 혈관내피세포 성장인자) 분비능에 미치는 효과를 살펴보았다. VEGF 는 허혈성 심장 질환의 호전에 주요한 인자이다.
구체적으로, E-cadherin 과발현 그룹, naive 및 LacZ 그룹에 대해 real time PCR 과 항원 항체 반응을 이용한 ELISA를 실시하여 각각 mRNA 및 protein 수준을 비교하여 도 20에 나타내었다.
세포에 vector를 처리하고 48시간 후 세포를 샘플링하여 RNA 를 추출하고, cDNA 를 합성 후 VEGF 특이적 primer를 이용하여 정량적으로 RNA 수준을 측정하였으며 (VEGF-real-time PCR), 세포에 vector를 처리하고 48시간 후 그 배양액에 대하여 VEGF 항원-항체 반응을 유도하여 단백질 수준에서의 VEGF 양을 측정 하였다 (VEGF-ELISA).
도 20에서 알 수 있는 바와 같이, E-cadherin 과발현시(E-cad) mRNA 및 protein 수준 모두에서 VEGF 가 상대적으로 증가되는 것으로 나타났다.
상기 결과로부터 E-cadherin 은 인간 중배엽 줄기세포의 구체형성 유도 인자일 뿐만 아니라 다양한 생체내 활성 조절 인자로 작용하는 것을 알 수 있으며, 결론적으로 E-cadherin 은 인간 중배엽 줄기세포의 부유배양시 구체형성을 촉진하고 나아가 구형세포괴의 고활성을 유도하는 것이 명백하다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면 등은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면 등에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되지 아니한다는 것은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 고활성 인간 중배엽 줄기세포 유도 방법은 상이한 유전적 배경 및/또는 기원을 가지는 다양한 인간 중배엽 줄기세포에 모두 적용할 수 있는 규범화된 방법으로 타가 유래 세포치료제 개발 및 선발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 고활성 인간 중배엽 줄기세포의 대량생산을 가능하게 한다. 궁극적으로 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대되며 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료제 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도방법으로, 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하고 이를 유지시키는 단계를 포함하며 E-cadherin에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 구형세포괴 유도는 배양 디쉬(dish) 뚜껑에서 중력에 반하게 중배엽 줄기세포를 배양하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포의 배양은 20% SR(serum replacement)을 포함하는 혈청배제배지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 혈청배제배지는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 구형세포괴 유도는 저부착 배양 디쉬(dish)에서 20% SR(serum replacement)을 포함하는 혈청배제배지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 중배엽 줄기세포는 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 고활성 인간 중배엽 줄기세포괴.
  8. 제 7항의 고활성 인간 중배엽 줄기세포괴를 포함하는 세포치료제.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 또는 심근세포 형성에 이용되는 세포치료제.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 세포치료제는 심혈관 질환의 치료에 이용되는 세포치료제.
  11. E-cadherin 에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포 배양시스템으로, 하기 단계를 포함하는 시스템:
    (a) bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 인간 중배엽 줄기세포를 부유배양하는 단계; 및
    (b) 상기 부유배양에서 생성된 구형 세포괴와 구형 세포괴에 포함되지 않은 세포를 스트레이너(strainer)를 이용하여 분리하는 단계.
  12. 생물반응장치(bioreactor)를 이용하여 E-cadherin 에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 생물반응장치(bioreactor)내에서 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 상기 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 방법.
  14. 생물반응장치(bioreactor)를 이용하여 E-cadherin 에 의해 조절되는 고활성 인간 중배엽 줄기세포를 대량생산하는 시스템.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 시스템은 생물반응장치(bioreactor)내에서 혈청배제배지를 사용하여 인간 중배엽 줄기세포의 구형세포괴 형성을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 시스템은 상기 구형세포괴를 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하지 아니한 인간 배아줄기세포 배양배지에 20% SR(serum replacement)를 추가한 배지를 사용하여 대량생산하는 단계를 더 포함하는 시스템.
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