WO2021187758A1 - 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 - Google Patents

심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a cardiac organoid capable of self-contraction, and more specifically, a cardiac organoid capable of self-contracting having a structure such as a ventricle and valve similar to that of a living heart, a manufacturing method thereof, and drug toxicity evaluation using the same it's about how
  • organoids are attracting attention as a new human-like model.
  • Organoids are formed into three-dimensional structures such as organs by growing stem cells into specific cells. Unlike the two-dimensional cell-based model, organoids can be cultured in a three-dimensional environment and cultured for a longer period of time.
  • organoids are small in size, but their constituent cells and structures are similar to those of real organs. Accordingly, organoids are being evaluated as the optimal specimens for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs.
  • organoid-related fields have high potential to be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation of new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative therapies.
  • cardiac organoids such as stomach, intestine, early liver, thyroid, lung, and brain have been successfully developed.
  • cardiac organoids developed to date exhibit the characteristics of immature cardiomyocytes in electrophysiological characteristics and the like.
  • cardiac organoids to date have a limitation in that they are not morphologically similar to the living heart. Since most cardiovascular diseases develop after adulthood or aging, it is necessary to develop cardiac organoids including mature cardiomyocytes that are morphologically and functionally similar to adult cardiomyocytes.
  • Organoids may be formed in different organs and tissues according to the differentiation of stem cells. In vivo, the inner cell mass of blastocysts differentiates into endoderm, mesoderm and ectoderm, each of which consequently forms different organs and tissues.
  • the endoderm can mainly be differentiated into the digestive and respiratory organs, and the ectoderm can be differentiated into the epidermis, glandular tissue, sensory epithelium, and nervous system. Manufacturing methods for these endoderm and ectoderm-derived organs have already been established, and various organoids such as small intestine, lung, liver and brain exist.
  • mesoderm can be differentiated into mesenchymal, hematopoietic system, muscle, bone, kidney, reproductive tract and heart.
  • Organs formed by mesoderm are complex organs composed of variously differentiated cells, and the three-dimensional arrangement of differentiated cells is functionally important.
  • the cardiac organoids developed so far do not reach the original performance and structure of a living body because cardiomyocytes differentiated from mesoderm are heterogeneous, ion channel structures are different, or sarcomere formation and arrangement are incomplete.
  • the viability of cardiomyocytes is very low in the process of removing them from the culture vessel in order to be cultured in a three-dimensional environment, so it is very difficult to maintain yield and growth. Accordingly, the development of cardiac organoids is difficult compared to other organoids.
  • the inventors of the present invention have recognized that it is important to provide a suitable environment required for the differentiation of stem cells so that the desired differentiation of stem cells can be made in order to obtain cardiac organoids.
  • the inventors of the present invention formed a cardiac organoid capable of spontaneous beating from pluripotent stem cells through a differentiation process such as the natural development of a living heart, and through this, a cardiac organoid that is structurally and functionally similar to the heart I came to develop a node.
  • an object of the present invention is to provide a cardiac organoid, which has a structure such as a ventricle and a valve similar to that of a living heart, and capable of self-contraction without electrical stimulation, and a method for manufacturing the same.
  • Another problem to be solved by the present invention is to provide a method capable of evaluating the efficacy and toxicity of a drug in the development of a new drug through the aforementioned cardiac organoid.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • CM cardiomyocytes
  • ECM extracellular matrix
  • a method for preparing cardiac organoids comprising:
  • pluripotent stem cell may refer to a cell having the ability to differentiate into all cells constituting the body, and generally an induced pluripotent stem cell having a common characteristic of differentiating to pluripotency.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • ES cell embryonic stem cell
  • embryonic stem cells are derived from the inner cell mass of the blastocyst in the pre-implantation stage. The induced cells are maintained in a specific environment and are capable of unrestricted culture and pluripotent differentiation.
  • induced pluripotent stem cells may refer to pluripotent differentiated cells produced by dedifferentiation from somatic cells of the body, and through a process called reprogramming, such as cell fusion, nuclear substitution, and overexpression of pluripotency regulators, somatic cells are transformed. It is formed by making it very similar to embryonic stem cells.
  • pluripotent stem cells are not limited to embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, and may include both cells having pluripotency in differentiation and self-renewal ability.
  • the pluripotent stem cells may be mammalian cells, more preferably human-derived pluripotent stem cells.
  • myocardial cell refers to cells constituting the heart. Cardiomyocytes can be divided into atrium, ventricle and nodal cardiomyocytes according to the structure of the heart, and cardiomyocytes can be mononuclear cells and lose their dividing function in the body after birth. Therefore, recovery of damaged cardiomyocytes can be difficult. On the other hand, myocardial cells may be damaged or destroyed when exposed to stress such as myocardial infarction or myocarditis. Accordingly, damage or extinction of myocardial cells causes a decrease in myocardial function, which may lead to heart disease. Therefore, in regenerative cell therapy for recovery of cardiac function or treatment of heart disease, cardiomyocytes differentiated from stem cells can be used.
  • organoid refers to a small culture that reproduces both the form and function of a tissue or organ. More specifically, an organoid must contain one or more cell types among various types of cells constituting an organ or tissue, and must be able to reproduce the specific function of each organ, and must be able to reproduce the specific function of each organ, and the cells must be spatially agglomerated with each other. It should be organized in a form similar to These organoids are different from speroids in that they form a lineage rather than an aggregate of simple cells, and can be used as a patient-specific model for drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.
  • the first maintenance medium may not include insulin
  • the second maintenance medium may include insulin.
  • insulin may be a factor that promotes cell proliferation by promoting absorption of sugar and amino acids into cells. However, depending on the condition, it rather inhibits the proliferation of cells and induces cell differentiation, so that the inclusion may be determined according to the purpose.
  • the term “medium” refers to in vitro stem cells containing essential elements for cell growth and proliferation, such as sugar, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. It refers to a mixture for the growth and proliferation of cells.
  • the first culturing step includes inoculating the pluripotent stem cells, maintaining the inoculated pluripotent stem cells in the first maintenance medium, the pluripotent stem cells passing through the mesoderm cell stage to cardiac progenitor cells It may include culturing the pluripotent stem cells in an induction medium to be induced into , and culturing the mesoderm cells in a first maintenance medium so that the cardiac progenitor cells are differentiated into mature cardiomyocytes.
  • the induction medium is a group consisting of IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 and WIKI4 may include at least one of At this time, IWR-1 endo may be used in various embodiments, and the concentration may be used at 10 uM or more, but is not limited thereto.
  • the step of culturing the pluripotent stem cells in the induction medium to be induced into cardiac progenitor cells may be cultured for at least one period of 5 to 7 days.
  • 5 to 7 days may mean 5 to 7 days from the day the pluripotent stem cells are maintained and cultured in the induction medium is started.
  • the culturing of cardiac progenitor cells in the first maintenance medium may include culturing for at least one of 10 to 21 days.
  • 5 to 7 days may mean 10 to 21 days from the date of starting the culture in the induction medium through the step of maintaining the pluripotent stem cells.
  • the first culturing step of pluripotent stem cells to differentiate into cardiomyocytes may be performed for at least one period of 10 to 21 days, and through the first culturing step, spontaneously contractible mature cardiomyocytes can be formed.
  • the extracellular matrix may be obtained from fibroblasts.
  • the second culturing step may be cultured for at least one of 28 to 32 days.
  • the third culturing step may include mincing the fusion tissue, and suspending the minced fusion tissue. At this time, the third culturing step may be cultured for at least one period of 25 days to 3 years or less from the start date of the floating culture, but is not limited thereto.
  • cardiomyocytes developed to date have a short survival period of about 2 to 3 weeks after spontaneous contraction, without maintaining continuous survival and proliferation. Therefore, two-dimensional immature cardiomyocytes cultured for about 2 to 3 weeks have been used to evaluate drug efficacy and toxicity.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention is highly organized, can perform continuous contraction without electrical stimulation, and when an appropriate medium is maintained, long-term growth is possible. More specifically, in the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention, a ventricle that is morphologically similar to the heart, that is, the organoid is empty inside, so that a chamber capable of accommodating the fluid is formed. Accordingly, the cells inside the organoid directly exchange nutrients through the fluid accommodated in the chamber, that is, the medium, and thus, the cells forming the cardiac organoid can grow while maintaining survival.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention has an improved survival period compared to models used for conventional drug efficacy and toxicity evaluation, and can form mature cardiac organoids and cardiomyocytes. , may be more similar in form and function to living organs.
  • the chamber (chamber) in which the fluid is stored the first pipe (track) connected to the chamber and the fluid is introduced, the second pipe is connected to the chamber and the fluid flows out, and the first pipe
  • a cardiac organoid is provided that is formed and includes a valve that spontaneously opens and closes the inlet tube, and performs spontaneous contraction.
  • the chamber expresses TUBB3, TNNT2, PECAM1 and MYL2, and 6-week-old cardiomyocytes can be formed toward the inner tube of the chamber.
  • the chamber may be formed with a calcium transient.
  • the step of reacting the above-described cardiac organoid with a drug, washing the cardiac organoid after the drug reaction has been completed, culturing the washed cardiac organoid, reaction, washing and culturing comprising the steps of taking as an image, obtaining the captured image, and analyzing the obtained image.
  • the analyzing of the image includes the conduction displacement and heart rate variability based on the difference in the amount of change in pixel values between the cell region and the background region in images continuously taken during contraction of the cardiac organoid. and the beating rate can be measured.
  • the beating rate can be measured.
  • it may include, but is not limited to, cellogy pulse analysis.
  • the present invention provides a cardiac organoid, a method for manufacturing the same, and a method for evaluating drug toxicity using the same, so that there is an effect of evaluating a drug in the development of a new drug, that is, efficacy, side effects and toxicity.
  • the present invention has a chamber, an inlet tube and a valve similar to the ventricle, outlet and valve, unlike conventional organoids that have a structure different from that of a living heart, and can spontaneously contract without external electrical stimulation. Thereby, it is possible to circulate the action of the valve such as valve movement and the liquid inside and outside. Accordingly, structural abnormalities of the heart according to the drug can be identified.
  • the present invention expresses TUBB3, a marker for identification of nerve cells, TNNT2, a marker for identification of cardiomyocytes, PECAM1, a marker for identification of vascular endothelial cells, and MYL2, a marker for identification of ventricular cells, thereby providing detailed information such as blood vessels and nerves of the living heart. For function, efficacy, side effects, and toxicity according to the drug can be confirmed.
  • the cardiac organoid of the present invention can be used to evaluate side effects, toxicity, and efficacy of drugs as a human-like model that is functionally and structurally similar to a living heart.
  • the cardiac organoid of the present invention can be used for screening drug candidates in new drug development to dramatically reduce cost and time, and can be used for physiological research and clinical trials of heart cancer. Furthermore, the present invention can be used for personalized diagnosis that can reduce the cost of treatment by preventing unnecessary drug use by allowing experiments on various causes of the invention.
  • the cardiac organoid of the present invention can be used as a regenerative therapeutic agent that can be transplanted into a damaged heart to regenerate the heart.
  • the effect according to the present invention is not limited by the contents exemplified above, and more various effects are included in the present specification.
  • FIG. 1 illustrates a procedure of a method for manufacturing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2A to 2B show the procedure of the first culturing step in the method for preparing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 3A to 3B show the procedure of the second culturing step in the method for preparing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 4A to 4B show a procedure for a method for producing an extracellular matrix used in a method for preparing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 5A to 5B show the procedure of the third culturing step in the method for preparing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 6A to 6B show image results for the myocardium of cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 image results of defective endothelial cells of cardiac organoids are shown according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 8A to 8B show image results of a chamber, which is an organ similar to a ventricle of a living heart, of a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention.
  • 9A to 9B show image results of nerve cells of cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 10A to 10C are diagrams showing image results for the inlet and outlet tubes and valves of cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11A to 11B show results of spontaneous contraction of cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows a procedure of a drug toxicity evaluation method using a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention.
  • 13A to 13D show results of drug toxicity and efficacy evaluation using cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • differentiation means that a cell develops at the level of a complex or individual of a specific cell or tissue having a specific function.
  • Example 1 Method for manufacturing cardiac organoids and the process of forming cardiac organoids through the same
  • FIGS. 1 to 10C a method for manufacturing a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention and a process for forming a cardiac organoid through the same will be described in detail with reference to FIGS. 1 to 10C .
  • FIG. 1 illustrates a procedure of a method for manufacturing cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • the cardiac organoid manufacturing method a first culturing step to differentiate pluripotent stem cells (PSCs) into cardiomyocytes (CM), the differentiated A second culturing step in a first maintenance medium so that cardiomyocytes and extracellular matrix (ECM) form a fusion tissue, and a third maintenance medium so that the formed fusion tissue forms and grows cardiac organoids and a third culturing step.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • CM cardiomyocytes
  • ECM extracellular matrix
  • first maintenance medium refers to a natural or artificial serum-free medium that does not contain insulin used to maintain and grow animal cells. More specifically, the first maintenance medium intentionally excludes insulin to inhibit the formation of cardiomyocytes, which is a process before myocardium is formed, in the formation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, and contains active oxygen containing antioxidants.
  • the first maintenance medium is insulin-free minimal essential medium (MEM), Eagle's minimal essential medium (Eagle's MEM), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Ham's F 12, It may include all of various serum-free media and variants thereof, such as SF 12 and RPMI 1640, and may preferably be RPMI 1640 that does not contain insulin, but is not limited thereto.
  • the temperature is 36 ° C to 38 ° C, preferably 36.5 ° C to 37.5 ° C, the supply oxygen (O 2 ) is 1% to 25%, and the supply carbon dioxide (CO 2 ) is 1% to 15% day can
  • Figure 2a shows the procedure of the first culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2b shows the procedure of the first culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • the first culturing step includes inoculating pluripotent stem cells, maintaining the inoculated pluripotent stem cells in a first maintenance medium, and induced pluripotent stem cells into cardiac progenitor cells through the mesoderm cell stage. It may include culturing the pluripotent stem cells in a mesodermal induction medium as much as possible, and culturing the cardiac progenitor cells in a first maintenance medium so that the cardiac progenitor cells are differentiated into mature cardiomyocytes.
  • the pluripotent stem cells in an undifferentiated state are separated from the tissue using a proteolytic enzyme, and then suspended in the first maintenance medium so that the density of the pluripotent stem cells is 3 to 6 ⁇ 10 Inoculate (seeding) on the plate so as to be 4 /cm 2 .
  • the density of the inoculated pluripotent stem cells is 3 to 6 ⁇ 10 4 /cm 2 although it appears to be, but is not limited thereto, preferably 5 ⁇ 10 4 /cm 2 It may be.
  • proteolytic enzyme refers to an enzyme capable of isolating an intercellular matrix in order to liberate cells or cell aggregates included in living tissue, and isolate or cell pluripotent stem cells from tissues.
  • Collagenase, Dispase, Protease, Trypsin, etc. may be used to separate the cell aggregate, but is not limited thereto.
  • the term "plate” as used herein is not limited as long as cell culture can be made, and it is not limited to flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, micro plates, micro well plates, micro slides, Pamber slides, Plates of various shapes such as petri dishes, tubes, trays and culture bags may be used, and may include a cell adhesion layer coating film on the upper surface. More specifically, the coating film of the plate may include at least one of collagen, fibronectin, lamidine, lamidine fragment, vitronecrin, basement membrane matrix, gelatin, hyaluronic acid, polylysine, vitronecrin, and matrigel, but is not limited thereto. it is not As the pluripotent stem cells are cultured on a plate including a coating film, adhesion and extension of cells is promoted, so that differentiation efficiency of mesodermal cells can be increased.
  • maintaining the inoculated pluripotent stem cells in the first maintenance medium is a step for adaptation and stabilization of the inoculated pluripotent stem cells, replacing the first maintenance medium daily for 2-3 days and culturing the pluripotent stem cells .
  • the pluripotent stem cells are stabilized through the step of maintaining in the first maintenance medium, and the spherical pluripotent stem cells appear to be attached to the plate on the culture start day (D0).
  • the pluripotent stem cells attached to the plate are cultured for 2 days in a medium containing 0.1 to 8 ⁇ M of CHIRR99021 and the first maintenance medium on the culture start day (D0).
  • the content of CHIRR99021 may be 0.5 to 8 ⁇ M, but preferably, the content of CHIRR99021 capable of improving the effect of survival and proliferation of pluripotent stem cells on the culture start day (D0) may be 5 to 7 ⁇ M.
  • CHIRR99021 is a substance that inhibits the activity of Glycogen synthase kinase (GSK)-3 ⁇ . More specifically, as GSK-3 ⁇ is inhibited, ⁇ -catenin of the signaling system involved in cell proliferation is not degraded by GSK-3 ⁇ , so the expression level of the gene involved in cell proliferation is increased, thereby improving the survival and proliferation of cells can be
  • Activin A and BMP4 are growth and differentiation factors belonging to the TGF- ⁇ group, and by activating BMP and Activin/Nodal signals, which are important cell signaling systems during embryonic development, inhibit differentiation into the ectodermal nervous system and enter the mesodermal system. may promote the differentiation of
  • the Wnt inhibitor is a substance that inhibits Wnt protein that contributes to the intracellular signal transduction system, and can differentiate mesoderm cells into cardiac progenitor cells by activating GSK-3 ⁇ .
  • the Wnt inhibitor may include at least one of the group consisting of IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 and WIKI4, but , but is not limited thereto, and may include any substance capable of activating GSK-3 ⁇ by inhibiting the Wnt signaling system.
  • mesoderm cells can be differentiated into high-purity cardiac progenitor cells having a positivity rate of 80 to 98% of cTnT (cardiac troponin T), one of the constituent proteins of cardiomyocytes.
  • cTnT cardiac troponin T
  • the pluripotent stem cells (D2) on the second day of culture are removed from CHIRR99021 and mixed with 50 to 150 ng/ml of Activin A and Matrigel in a volume ratio of 1:40 to a medium containing a first maintenance medium. They are replaced and incubated for 1 day.
  • the pluripotent stem cells (D3) on the third day of culture were replaced with a medium containing 0.5 to 8 ⁇ M of CHIRR99021, 1 to 10 ng/ml of BMP4, and the first maintenance medium, cultured for 2 days to induce mesoderm cells.
  • the content of CHIRR99021 may be 0.5 to 8 ⁇ M, but preferably, the content of CHIRR99021 capable of improving the effect of survival and proliferation of pluripotent stem cells on the third day (D3) of culture may be 0.5 to 2 ⁇ M.
  • the pluripotent stem cells (D5) on day 5 of culture induced with mesoderm cells are replaced with a medium containing 0.01 to 3 ⁇ M of a Wnt inhibitor and a first maintenance medium and cultured for 2 days.
  • the pluripotent stem cells (D7) cultured for 7 days can be induced to differentiate into cardiac progenitors through the mesodermal cell stage. More specifically, referring to FIG. 2B , pluripotent stem cells can be cultured in a form attached to a plate (D0), go through the mesodermal cell stage (D2 to D3), and can be induced to differentiate into cardiac progenitor cells (D5).
  • the differentiated cardiac progenitor cells are then cultured in a first maintenance medium to differentiate into mature cardiomyocytes. More specifically, referring to FIG. 2B , mature cardiomyocytes that self-contract from the fifth day of culture (D10) of cardiac progenitor cells begin to appear, and after the appearance of mature cardiomyocytes, 4 in the first maintenance medium Cardiomyocytes can be proliferated and grown through culture for 5 to 5 days. In this case, when the period of culture for proliferation and growth of cardiomyocytes passes 4 to 5 days, the number of cardiomyocytes may be reduced. Accordingly, the culture period for maximizing the yield of cardiomyocytes may be preferably 4 to 5 days (14 to 15 days after culturing from pluripotent stem cells).
  • the pluripotent stem cells have the effect of differentiating mature cardiomyocytes capable of self-contraction with a high yield. Furthermore, these mature cardiomyocytes can be utilized as a fundamental therapeutic agent for cardiac muscle cells. For example, it can be used in regenerative cell therapy to restore heart function or to treat heart disease.
  • the cardiomyocytes formed through the first culturing step may be used in an experiment to determine the stability and effect of a candidate substance on cardiac toxicity in the process of developing a new drug.
  • Figure 3a shows the procedure of the second culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3b shows the procedure of the second culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • the second culturing step is performed after the first culturing step so that the pluripotent stem cells are differentiated into mature cardiomyocytes, and the mature cardiomyocytes formed through the first culturing step are collected to release the extracellular matrix. It is placed on top, and a first maintenance medium is added and cultured for at least one of 28 to 32 days so that the cardiomyocytes and the extracellular matrix form a fusion tissue.
  • FIG. 3B it appears that the cardiomyocytes and the extracellular matrix are separated from each other on the first day of the second culture (D0). However, as the cell culture progresses, the cardiomyocytes and the extracellular matrix are tightly fused to each other to form a cell clump. It appears that a fusion tissue of
  • extracellular matrix is a three-dimensional structure that plays an important role in providing signals affecting various cellular metabolic pathways such as cell proliferation, differentiation and death. support for the development of The extracellular matrix stores and supplies biochemical factors necessary for cell growth and differentiation, and at the same time can provide a physical environment that cells can recognize.
  • the extracellular matrix is a product created by the cells constituting each tissue as needed, structural proteins such as collagen and elastin, polysaccharides such as GAG (glycosaminoglycan), and It contains adhesive proteins and growth factors. This extracellular matrix is composed of different components depending on the tissue and cell from which it is derived, and has special physical properties.
  • the extracellular matrix used in an embodiment of the present invention may be obtained from fibroblasts, preferably from fibroblasts derived from heart tissue.
  • fibroblasts obtained from heart tissue were treated with 8 to 10% FBS, 0.5 to 2% glutamax, 0.5 to 2% non-essential amino acids, 0.5 to 2% Antibiotix-antimycotix, 1 to 3 mM acetic acid, 0.1 to 0.3 mM ascorbic acid, and 5 to 15 ng/ml of BMP4 in a low serum medium (Advanced DMEM/F12) containing BMP4 for 3 weeks by culturing, cells from fibroblasts excretes the extraneous substance.
  • FBS fetal bovine serum
  • glutamax glutamax
  • non-essential amino acids 0.5 to 2%
  • Antibiotix-antimycotix 1 to 3 mM acetic acid
  • 0.1 to 0.3 mM ascorbic acid 0.1 to 0.3 mM ascorbic acid
  • 5 to 15 ng/ml of BMP4 in a low serum medium (Advanced DMEM/F12) containing BMP4 for 3 weeks
  • the extracellular matrix is discharged, and only the extracellular matrix is extracted through the decellularization process of the tissue bonded to the fibroblasts in the form of a patch.
  • 0.25% trypsin was treated in a constant temperature bath at 37 °C for 3 hours to the tissue bonded in the form of a patch, and PBS containing 3% triton-X and 0.05% EDTA was added. It can be carried out by stirring for 30 minutes. Accordingly, referring to FIG. 4B , the connective tissue, which was opaque due to a mixture of fibroblasts and extracellular matrix, undergoes decellularization, and the fibroblasts are separated and only the extracellular matrix remains, decreasing in volume and changing to transparent.
  • the cardiomyocytes are cultured with the extracellular matrix derived from fibroblasts of the heart tissue, there is an effect that they can develop into a heart fusion tissue in a physical environment similar to a living body.
  • Figure 5a shows the procedure of the third culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5b shows the procedure of the third culturing step in the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • the third culturing step is performed after the second culturing step for forming a fusion tissue, and the fusion tissue formed from the second culturing step is cultured in a second maintenance medium. More specifically, referring to FIG. 5B , a microscopic image in which the fusion tissue in the form of a patch is sliced is shown. Prior to culture, the fusion tissue in the form of a patch is physically minced into several pieces using a pipette or the like. Then, after transferring 3 to 10 minced tissue to the plate, and replacing the second maintenance medium once every 2 days, floating culture (floating culture or suspension culture).
  • the term "floating culture” as used herein is suspended in a liquid to prevent the cells from adhering to the bottom by constantly moving the cells using a stirrer such as a spinner and a rotational chamber. It refers to a three-dimensional cell culture model that grows in an established ecology. Floating culture has the characteristics of creating a structure reflecting the original tissue structure by adhering cells with higher affinity to each other through cell-to-cell interactions when the cells are floating in the culture medium.
  • the term "second maintenance medium” refers to a natural or artificial serum-free medium containing insulin used for maintaining and growing animal cells. More specifically, the second maintenance medium may promote absorption of glucose and amino acids, including insulin, and promote cardiac organoid formation and growth. Further, the second maintenance medium includes insulin-containing Minimal essential medium (MEM), Eagle's MEM, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Ham's F 12, SF 12 and RPMI 1640, etc., may include all of various serum-free media and variants thereof, preferably RPMI 1640 containing insulin, but is not limited thereto.
  • MEM Minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Ham's F 12 SF 12
  • RPMI 1640 Ham's F 12
  • RPMI 1640 RPMI 1640
  • the cardiac organoid formed by the above-described method may be formed through a process similar to the embryological process of the living heart, and thus, a living body model having a shape and function very similar to that of the living heart may be formed.
  • the fusion tissue formed from cardiomyocytes and extracellular matrix forms myocardium and blood vessels, chambers (ventricles) and nerves, inflow ducts and valves, and endocardial muscle during the third culturing step. It can develop into a cardiac organoid, and can be continuously grown and maintained. At this time, the period of formation of each tissue appears to be 0 to 10 days for myocardium and blood vessels, 10 to 30 days for chambers and nerves, 30 to 60 days for outflow tubes and valves, and 60 to 90 days for endocardial muscle from the start date of the third culturing step. However, the formation period of each cell and tissue is not limited thereto, and may vary depending on the development and growth rate of cells according to the size of the sliced tissue.
  • FIG. 6a a fluorescent staining image of the myocardial development using Fluo-4, a staining reagent that binds intracellular calcium, is shown. It appears that calcium transients are formed on the outside and inside of the heart organoids, which means that calcium-formed cardiomyocytes exist in the heart organoids, and through this, spontaneous contractions can be performed without external electrical stimulation. It can mean that you can
  • cardiomyocytes in the lumen are formed by trabeculation in the medial direction of cardiac organoids. This appears to be analogous to the process by which, during the development of the heart, cardiomyocytes extend into the ventricular lumen, forming 6-week-old cardiomyocytes, hypertrophy and fibrosis of the myocardium. More specifically, referring to FIG. 6B , it appears that the myocardium of the cardiac organoid becomes enlarged due to the 6-week-old cardiomyocytes as the culture progresses. At this time, it appears that the cardiomyocytes are formed for 0 to 10 days from the start date of the third culturing step, but is not limited thereto.
  • blood vessels are formed in cardiac organoids simultaneously with the formation of myocardium. More specifically, referring to FIG. 7 , an immunofluorescence staining image for angiogenesis using TNNT2 (troponin T2), a cardiomyocyte identification marker, and platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM1), a vascular endothelial cell identification marker is shown. At this time, the nucleus and chromatin were confirmed by contrast using DAPI staining. Vascular endothelial cells appear to form in the lateral and lumen of cardiac organoids along cardiomyocytes.
  • TNNT2 troponin T2
  • PECAM1 platelet endothelial cell adhesion molecule 1
  • the method for manufacturing a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention and the cardiac organoid through the same can form the myocardium of the cardiac organoid through a process similar to the formation of the myocardium that occurs in the heart development process, and As calcium is formed in the myocardial cells, a contractile motion can be performed according to the concentration of calcium ions.
  • FIG. 8a immunofluorescence staining for ventricular formation using myosin regulatory light chain 2 (MYL2), a ventricular confirmation marker An image is shown. It appears that MYL2, a ventricular identification marker, was expressed around the entire cardiac organoid, and as DAPI was also expressed at the same time as MYL2 expression, apoptosis of the formed cardiac organoid did not appear. At this time, the chamber appears to be formed for 10 to 30 days from the start date of the third culturing step, but is not limited thereto.
  • MYL2 myosin regulatory light chain 2
  • the ventricle of a living body may refer to a tissue in which a chamber capable of accommodating a liquid is formed, rather than a simple muscle tissue.
  • FIG. 8B a microscopic image of a chambered cardiac organoid is shown.
  • a needle and forceps were used.
  • the liquid contained in the chamber of the cardiac organoid is ejected.
  • the method for manufacturing a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention and the cardiac organoid through the same can form a chamber morphologically similar to a living ventricle.
  • FIG. 9A a microscopic image of self-contracting cardiomyocytes is shown. More specifically, it appears that a bundle of neuron fibers is formed around the cardiomyocytes. Accordingly, it may mean that nerve cells are formed from cardiomyocytes before organoids are formed.
  • FIG. 9B an immunofluorescence staining image for neuronal cell formation using TUBB3 ( ⁇ -tubulin-III), a neuronal cell identification marker, is shown. It appears that TUBB3, a neuronal cell identification marker, was expressed around the entire organoid. Accordingly, the cardiac organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention and the cardiac organoid through the same can exchange signals by an electrical method as nerve cells are formed.
  • FIG. 10A a microscopic image of the inflow and outflow ducts of cardiac organoids is shown. More specifically, it appears that the cardiac organoid is formed with a first tube through which a fluid flows into the chamber by being connected to the chamber, and a second tube through which the fluid in the chamber flows out by being connected to the chamber. That is, the cardiac organoid may form a structure similar to a living heart in which blood is circulated by being connected to veins and arteries.
  • a valve capable of controlling the inflow of the fluid is formed in the first pipe through which the fluid flows by opening and closing the inflow pipe. More specifically, referring to FIG. 10B , a fluorescently stained image of a valve formed in the first tube of a cardiac organoid is shown. A valve formed in the first canal of the cardiac organoid appears to open and close the first canal by a thin muscle layer derived from the myocardium.
  • valves of the cardiac organoids are shown to be regulated according to fluid flow. That is, cardiac organoids can form a valve-like function and structure that helps blood flow constantly.
  • the method for manufacturing a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention and the cardiac organoid through the same can circulate a fluid inside and outside the cardiac organoid in one direction uniformly through the first tube, the second tube, and the valve. have.
  • Example 1 the method for manufacturing a cardiac organoid used in various embodiments of the present invention and the cardiac organoid through the same are formed to be structurally and functionally similar to a living heart, and thus a more biocompatible biosimilar model. can be used
  • FIG. 11A to 11B show results of spontaneous contraction of cardiac organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11a a video image of the cardiac organoid contraction movement is shown.
  • Cardiac organoids appear to contract in whole, but not part, area during contraction and expand during relaxation. More specifically, referring to (b) of FIG. 11a , a result in which the video image information of FIG. 11a (a) is expressed in pixels/sec is shown.
  • Spontaneous contractions of cardiac organoids appear to occur about once per second. This could mean that cardiac organoids have a rate similar to the normal human heart rate of 60-100 beats per minute.
  • the contractile motion of the cardiac organoid appears to occur about once per second, but is not limited thereto, and may be different depending on the size and culture period of the cardiac organoid.
  • FIG. 11B an image of the myocardium during contraction of cardiac organoids is shown.
  • the thickness of the myocardium appears to be 188 to 250 ⁇ m
  • the thickness of the myocardium appears to be 310 ⁇ m.
  • the thickness of the myocardium of the cardiac organoid is 188 to 250 ⁇ m when relaxed and 310 ⁇ m when contracted, but is not limited thereto, and may be different depending on the size and culture period of the cardiac organoid.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention has a voluntary contraction movement, that is, a rate similar to that of the living heart, the function of the living heart in evaluating the toxicity and effectiveness of a new drug It can be used as a simulated model. Furthermore, the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention can monitor changes in the myocardium and the inflow of fluid according to the contractile motion occurring inside the organoid.
  • the method for evaluating drug toxicity using cardiac organoids includes reacting the cardiac organoid with the drug (S110), washing the cardiac organoid after the drug reaction has been completed (S120), and culturing the washed cardiac organoid (S130) , reaction, washing and culturing may include a step of taking an image (S140), a step of obtaining a photographed image (S150), and a step of analyzing the obtained image (S160).
  • the cardiac organoid may refer to a cardiac organoid generated by the method for manufacturing a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention.
  • the myocardium can be formed through a process similar to that of the myocardium that appears in the process.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention is formed in a chamber in which a fluid is stored, a first tube connected to the chamber and the fluid is introduced, and a second tube and a first tube connected to the chamber and the fluid is discharged. It may include a valve for spontaneously opening and closing the inlet pipe.
  • the cardiac organoid may express TUBB3, an identification marker for nerve cells, TNNT2, an identification marker for cardiomyocytes, PECAM1, and a ventricular identification marker, MYL2, for identification of vascular endothelial cells.
  • TUBB3 an identification marker for nerve cells
  • TNNT2 an identification marker for cardiomyocytes
  • PECAM1 an identification marker for cardiomyocytes
  • MYL2 a ventricular identification marker
  • calcium transients can form.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention has a structure similar to that of an internal heart, can spontaneously contract without external electrical stimulation, and can circulate external and internal fluids. Therefore, cardiac organoids can be used as human imitation models in the evaluation of side effects, toxicity, and efficacy of drugs.
  • anticancer drugs essential for anticancer treatment often induce cardiotoxicity and affect the patient's prognosis, and ventricular dysfunction (LV dysfunction), ischemia, hypertension, and arrhythmias may occur as cardiac side effects due to cardiotoxicity of anticancer drugs.
  • anthracyclines drugs such as doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, and epiribucin cause damage to myocardial cells.
  • TNNT2 a marker for identification of cardiomyocytes, drugs for damaging myocardial cells such as anthracyclines can be evaluated.
  • vascular endothelial cells were identified by the expression of PECAM1
  • a marker for identifying vascular endothelial cells cyclophosphamide, capecitabine, and 5-fluorouracil ( Fluorouracil) can be evaluated for drugs that damage vascular endothelial cells.
  • MYL2 which is a ventricular confirmation marker, mitoxantrone, ifosfamide, sunitinib, etc. Drugs that cause ventricular insufficiency can also be evaluated.
  • MYL2 is a ventricular confirmation marker, mitoxantrone, ifosfamide, sunitinib, etc. Drugs that cause ventricular insufficiency can also be evaluated.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention includes both functional and structural elements of the heart, toxicity and effectiveness of various drugs can be evaluated.
  • the cardiac organoid according to an embodiment of the present invention is reacted with the drug on a plate for 15 to 60 minutes.
  • drug may include all substances used to change or examine a physiological system or disease state for the benefit of an organism. More specifically, it may include at least one of the group consisting of vitamins, hormones, metal salts, vaccines, antiserum agents, antibiotics, chemotherapeutic agents, cardiac agents, blood pressure regulators, antihistamines, steroids, antidote and contrast agents, but It is not limited.
  • the cardiac organoids after the drug reaction is finished are washed (S120), and the washed cardiac organoids are cultured (S130).
  • the temperature is 36 °C to 38 °C, preferably 36.5 °C to 37.5 °C
  • the supply oxygen (O 2 ) is 1% to 25%
  • the supply carbon dioxide (CO 2 ) is 1% to 15% days and the incubation time may be 30 to 90 minutes, but is not limited thereto.
  • the drug toxicity evaluation using a cardiac organoid includes the steps of taking the above-described reaction, washing and culturing as an image (S140), obtaining the captured image (S150) and It may include analyzing the obtained image (S160).
  • Cellogy pulse analysis was used in the steps of taking images of the reaction, washing and culturing steps (S140), obtaining the photographed image (S150), and analyzing the obtained image (S160).
  • the method of analyzing through images may refer to a method of measuring a difference in the amount of change in pixel values between a cell region and a background region in continuously captured images, but is not limited thereto.
  • the temperature, nerve activity, conductivity, pressure, ions, etc. of the cardiac organoid are measured as well as the method of analysis through the captured image. It is possible to measure and evaluate the degree of change in cardiac organoids caused by drugs through various electrical devices that can do this.
  • FIGS. 13A to 13D the results of drug toxicity and efficacy evaluation using cardiac organoids according to an embodiment of the present invention are shown.
  • FIG. 13A an image and a heat map for a beating rate according to a calcium antagonist drug treatment of a cardiac organoid according to an embodiment of the present invention are shown.
  • cardiac organoids calcium channels are blocked by nifedipine and verapamil, and the beating rate is decreased, and the beating rate is increased again after washing and incubation for 1 hour.
  • cardiac organoid according to an embodiment of the present invention can exhibit the effect of a calcium antagonist for the treatment of hypertension and arrhythmias in the same response as that of a living heart.
  • the conduction displacement may evaluate abnormality in the electrical signal of the heart, and the change in the heart may be expressed as a change in the velocity of the heart.
  • the heart rate variation may refer to the ability of the heart to adapt to unexpected stimuli, and may evaluate the health of the heart and the state of the autonomic nervous system that regulates heart activity.
  • the 100 nM group showed the highest conduction displacement before nifedipine treatment, and the 100 nM group showed the highest conduction displacement after nifedipine treatment.
  • the conduction displacement after washing appears to be similar for all three groups.
  • the rate before nifedipine treatment was also shown to be the highest in the 100 nM group, and the rate after nifedipine treatment was also shown to be the highest in the 100 nM group, and the rates after washing were similar in all three groups. This may be a difference due to a difference in contractility according to each group.
  • nifedipine may cause side effects in the heart in vivo when it is 10 ⁇ M or more. Furthermore, it may mean that cardiac organoids can mimic electrical disturbances appearing in a living heart.
  • FIG. 13C the results showing the conduction displacement, beating rate, and heart rate variation of cardiac organoids according to the amount of verapamil processed are shown.
  • the conduction displacement before verapamil treatment was similar in all three groups, and the 1 ⁇ M group showed the highest conduction displacement after treatment. Furthermore, the conduction displacement after washing also appears to be the highest in the 1 ⁇ M group. Furthermore, the rate before nifedipine treatment was shown to be the highest in the 10 ⁇ M group, and the rates after treatment and after washing were similar in all three groups.
  • the heart rate variability before verapamil treatment was similar in all three groups, but the heart rate variability after verapamil treatment was higher in both groups of 10 ⁇ M and 100 nM compared to the 1 ⁇ M group at a similar level, and the heart rate variability after washing was higher in the 10 ⁇ M group. appears to be the highest.
  • This may mean that, in the case of verapamil, cardiac organoids exhibit abnormally fast contractions, such as arrhythmias, in the heart even at low drug treatment doses. Therefore, when verapamil is 100 nM or more, it can be inferred that it can cause side effects in the heart in vivo, and it may mean that the drug toxicity to the heart is higher than that of nifedipine described above.
  • FIG. 13D the results for contractile motion of cardiac organoids following nifedipine 10 ⁇ M treatment are shown. More specifically, cardiac organoids before nifedipine treatment were shown to beat once every 25 frames, with a size of 50 to 60 pixels in systolic and 30 to 40 pixels in diastolic, and a contraction magnitude of 25 frames. It appears to have a size of 2 to 3 pixels once in each. However, cardiac organoids after nifedipine treatment appear to have a beating velocity of 50 to 100 pixels in systolic phase and 40 to 80 pixels in diastolic phase, with a beating velocity at 25 frames, with a contraction magnitude of once every 50 frames. It appears to have a size of 5 to 7.5 pixels.
  • cardiac organoids before nifedipine treatment appear to have uniform contraction and relaxation movements, but cardiac organoids after nifedipine treatment appear to exhibit sporadic contraction and relaxation movements. This could mean that nifedipine can cause side effects, such as arrhythmias with sporadic heart rates in a normal heart.
  • drug toxicity evaluation using a cardiac organoid can evaluate side effects, toxicity and effectiveness of the drug. Furthermore, drug toxicity evaluation using cardiac organoids according to an embodiment of the present invention can predict the dose and adaptability of a drug for each patient, and can determine an effective amount of the drug in the development of a new drug.

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Abstract

본 명세서에서는 유체가 저장되는 챔버, 상기 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관, 상기 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2 관 및 상기 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브를 포함하고, 자가 수축을 하는 심장 오가노이드, 전술한 오가노이드 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 대하여 제공한다.

Description

심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
본 발명은 자가 수축을 할 수 있는 심장 오가노이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생체 심장과 유사한 심실 및 판막 등의 구조를 가지며 자가 수축할 수 있는 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 관한 것이다.
신약개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적으로도 문제가 될 수 있다.
이에, 인간의 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 나아가, 2차원 세포 기반 모델(cell based in vitro model)은 비용 및 노동력 측면에서 인간의 조직으로부터 유래된 일차 배양 세포보다 효율적이기 때문에 약물 독성 및 유효성 평가에 많이 사용되고 있다. 그러나, 2차원 세포 기반 모델은 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호 작용으로 발생하는 생리 기능과 조직 복합성을 구현하기엔 불충분하다.
한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다.
현재까지 위, 장, 초기 간, 갑상선, 폐, 뇌 등의 다양한 오가노이드가 성공적으로 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 심장 오가노이드는 전기 생리적인 특성 등이 미성숙한 심근세포의 특성을 나타낸다. 또한, 현재까지의 심장 오가노이드는, 형태학적으로도 생체 심장과 유사하지 못하는 한계가 있다. 대부분의 심혈관 질환은 성인이 되거나 노화가 진행된 후 발병되기 때문에 성체 심근세포와 형태적 및 기능적으로 유사한 성숙 심근세포를 포함한 심장 오가노이드의 개발이 필요한 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
오가노이드는 줄기세포의 분화에 따라 형성되는 기관 및 조직이 달라질 수 있다. 생체 내에서 배반포의 내부 세포 덩어리는 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 분화되며, 이들 각각은 결과적으로 다른 기관 및 조직을 형성한다.
내배엽은 주로 소화기관 및 호흡기관으로 분화될 수 있으며, 외배엽은 표피, 샘조직, 감각상피 및 신경계로 분화될 수 있다. 이러한 내배엽 및 외배엽 유래의 장기들에 대한 제작 방법은 이미 확립되어, 소장, 폐, 간 및 뇌 등의 다양한 오가노이드가 존재한다.
한편, 중배엽은 간엽, 조혈계, 근육, 뼈, 신장, 생식관 및 심장으로 분화될 수 있다. 중배엽으로 형성되는 기관들은 다양하게 분화된 세포들로 구성되는 복잡한 기관으로, 분화된 세포들의 3차원 배열이 기능적으로 중요하다. 그러나, 현재까지 개발된 심장 오가노이드는, 중배엽으로부터 분화된 심근세포들이 이질적이거나, 이온 채널의 구조가 상이하거나, 근절의 형성 및 배열이 불완전하여 생체 본래 성능 및 구조에 못 미친다. 나아가, 심근세포는 3차원 환경에서 배양하기 위하여 배양용기에서 떼어내는 과정에서 생존성이 매우 저하되어, 수율 및 성장 유지가 매우 어렵다. 이에, 심장 오가노이드에 대한 개발은 다른 오가노이드에 비하여 어려운 실정이다.
한편, 본 발명의 발명자들은 심장 오가노이드를 얻기 위해서 줄기세포를 원하고자하는 분화가 이루어질 수 있도록, 줄기세포의 분화에 요구되는 적합한 환경을 제공하는 것이 중요하다는 것을 인식하였다.
본 발명의 발명자들은, 만능 줄기세포로부터 자발적인 박동을 할 수 있는 심장 오가노이드를 생체 심장의 자연 발생과정(natural development)과 같은 분화 과정을 통하여 형성하고, 이를 통하여 구조 및 기능적으로 심장과 유사한 심장 오가노이드를 개발하는데 이르렀다.
이에, 본 발명이 해결하고 하는 과제는, 생체 심장과 유사한 심실 및 판막 등의 구조를 가지며, 전기적인 자극없이도 자가 수축을 할 수 있는 심장 오가노이드 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명이 해결하고 하는 다른 과제는, 전술한 심장 오가노이드를 통해 신약 개발에 있어 약물에 대한 유효성 및 독성을 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계, 융합 조직을 형성하도록 상기 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계 및 심장 오가노이드를 형성하도록 상기 융합 조직을 제 2 유지 배지에서 제 3배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법이 제공된다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "만능 줄기세포"는 몸을 구성하는 모든 세포로 분화하는 능력을 갖추고 있는 세포를 의미할 수 있으며, 일반적으로 다능성으로 분화한다는 공통적인 특징을 갖는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)와 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 배아 줄기세포는 착상 이전 단계에 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리(inner cell mass)로부터 유도된다. 유도된 세포는 특정한 환경에서 유지되며, 무제한적인 배양 및 다능성 분화가 가능하다. 나아가, 유도 만능 줄기세포는 신체 체세포로부터 역분화되어 만들어지는 다능성 분화 세포를 의미할 수 있으며, 세포 융합, 핵 치환, 다분화성 조절 인자의 과발현과 같은 재프로그래밍(reprograming)이라는 과정을 통해 체세포를 배아 줄기세포와 매우 유사한 상태로 만들어줌으로써 형성된다. 나아가, 만능 줄기세포는 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포에 제한되는 것은 아니며, 분화 다능성 및 자기 복제능을 겸비한 세포를 모두 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게 만능 줄기세포는 포유동물의 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 만능 줄기세포일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "심근 세포"는 심장을 이루는 세포를 의미한다. 심근 세포는 심장 구조에 따라서, 심방, 심실 및 노들 심근 세포로 나뉠 수 있으며, 심근 세포는 단핵 세포일 수 있고 출생 후 인체 내에서 분열 기능이 상실될 수 있다. 따라서, 손상된 심근 세포의 회복은 어려울 수 있다. 한편, 심근 세포는 심근 경색 또는 심근염 등의 스트레스에 노출되게 되면 손상되거나 소멸될 수 있다. 이에, 심근 세포의 손상 또는 소멸은 심근 기능의 저하를 유발하고, 이는 심장 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 심장 기능의 회복 또는 심장 질환의 치료를 위한 재생 세포치료에 있어서, 줄기세포로부터 분화된 심근세포가 이용될 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.
본 발명의 특징에 따르면, 제 1 유지 배지는 인슐린을 포함하지 않으며, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함할 수 있다. 이때, 인슐린은 당과 아미노산을 세포 내로 흡수를 촉진하여 세포의 증식을 촉진시키는 인자(factor)일 수 있다. 그러나, 조건에 따라 오히려 세포의 증식을 억제하고 세포 분화를 유발시킴에 따라, 목적에 따라 포함 유무를 결정할 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계는, 만능 줄기세포를 접종하는 단계, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(induction medium)에서 배양하는 단계 및 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록, 중배엽 세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 유도 배지는, IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이때, 다양한 실시예에서 IWR-1 endo가 사용될 수 있으며, 농도는 10 uM이상으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계는, 5 내지 7일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다. 이때, 5 내지 7일은 만능 줄기세포가 유지하는 단계를 거쳐 유도배지에서 배양을 시작하는일로부터의 5 내지 7일을 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계는, 10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다. 이때, 5 내지 7일은 만능 줄기세포가 유지하는 단계를 거쳐 유도배지에서 배양을 시작하는일로부터의 10 내지 21일을 의미할 수 있다. 이에, 만능 줄기세포를 심근세포로 분화되도록 제 1 배양하는 단계는 10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으며, 제 1 배양하는 단계를 통하여, 자발적으로 수축가능한 성숙한 심근세포를 형성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 세포외 기질은, 섬유아세포(fibroblast)로부터 획득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배양 단계는, 28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 3 배양 단계는, 융합조직을 세절하는 단계, 및 세절된 상기 융합 조직을 부유배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 제 3 배양하는 단계는 부유 배양시작일로부터 25일 내지 3년 이하의 기간 중 적어도 하나의 기간동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 현재까지 개발된 심근 세포는 자발적인 수축이 나타난 뒤, 지속적인 생존 및 증식을 유지하지 못하고 2 내지 3주 정도의 짧은 생존 기간을 가졌다. 이에, 약물 유효성 및 독성평가에 2 내지 3주 정도의 기간 동안 배양된 2차원의 미성숙 심근 세포가 이용되어 왔다.
나아가, 생체 장기들과 보다 유사하게 모사하기 위하여, 심근 세포로부터 개발된 종래의 3차원 스페로이드(speroid) 및 오가노이드는 2차원의 심근 세포와 마찬가지로 지속적인 수축 운동이 이루어지지 않아 전기 자극을 공급해주어야 한다. 또한, 스페로이드 및 오가노이드 내부의 세포들은 외부환경과 교류를 할 수 없어, 영양을 공급받지 못하여 사멸하게 된다. 이러한, 3차원의 스페로이드는 2차원의 심근 세포와 마찬가지로 생존 능력이 안정적이지 못하다는 한계가 있다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 고도화로 조직화되어, 전기 자극없이 지속적인 수축운동을 할 수 있으며, 적정 배지가 유지될 경우, 장기간 성장이 가능하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 형태학적으로 심장과 유사한 심실 즉, 오가노이드 내부가 비어있어 유체를 수용할 수 있는 챔버가 형성되어 있다. 이에 따라, 오가노이드 내부의 세포는 챔버에 수용된 유체 즉, 배지를 통하여 직접적으로 영양을 교류하고, 이에, 심장 오가노이드를 형성하고 있는 세포들은 생존을 유지하며 성장할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 종래의 약물 유효성 및 독성평가에 이용되어 왔던 모델들보다 향상된 생존 기간을 가지며, 성숙한 형태의 심장 오가노이드 및 심근 세포를 형성할 수 있음에 따라, 생체 장기와 형태 및 기능이 보다 유사할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유체가 저장되는 챔버(chamber), 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관(track), 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2 관, 및 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브(valve)를 포함하고, 자가 수축(spontaneous contraction)을 하는 심장 오가노이드가 제공된다.
이때, 본 발명의 특징에 따르면, 챔버는, TUBB3, TNNT2, PECAM1 및 MYL2를 발현하고, 육주화된 심근 세포가 챔버의 내관을 향하여 형성될 수 있다. 나아가, 챔버는 칼슘 트랜지언트가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전술한 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계, 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하는 단계, 세척된 심장 오가노이드를 배양하는 단계, 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계, 촬영된 영상을 수득하는 단계 및 수득된 영상을 분석하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 상기 영상을 분석하는 단계는 심장 오가노이드의 수축 운동 시의 연속적으로 촬영된 영상에서 세포 영역과 배경 영역 간의 픽셀(pixel)값의 변화량 차이에 기초하여 전도 변위, 심박 변이 및 박동 속도를 측정할 수 있다. 예를 들어, cellogy pulse analysis을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 생체 심장과 상이한 구조를 가졌던 종래의 오가노이드들과는 달리 심실, 유출입구 및 판막과 유사한 구조의 챔버, 유출입관 및 밸브를 가지고, 외부의 전기 자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있으며, 이에 따른 판막운동과 같은 밸브의 작용 및 외내부의 액체를 순환시킬 수 있다. 이에, 약물에 따른 심장의 구조적 이상을 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명은 신경 세포의 확인 마커인 TUBB3, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1 및 심실 확인 마커인 MYL2를 발현함에 따라, 생체 심장의 혈관 및 신경과 같은 세부적인 기능에 대해서도 약물에 따른 유효성, 부작용 및 독성을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 심장 오가노이드는, 생체 심장과 기능적 및 구조적으로 유사한 인체 모사 모델로서 약물의 부작용, 독성 및 유효성 평가에 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 심장 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 심장암의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 발명의 다양한 원인에 대한 실험이 가능하여 불필요한 약의 복용을 막아 치료에 대한 비용을 줄일 수 있는 개인별 맞춤 진단에 활용될 수 있다.
또한, 오가노이드는 종양원성이 낮고 재생능력이 뛰어나기 때문에, 본 발명의 심장 오가노이드는 손상된 심장에 이식되어 심장을 재생시킬 수 있는 재생치료제로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 2a 내지 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 3a 내지 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 2 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 4a 내지 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서 사용되는 세포외 기질을 생산하는 방법에 대한 절차를 도시한 것이다.
도 5a 내지 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 3 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다.
도 6a 내지 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 심근에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 결환 내피세포에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 8a 내지 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 생체 심장의 심실과 유사한 기관인 챔버에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9a 내지 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 신경 세포에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 10a 내지 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 유출입관 및 밸브에 대한 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 13a 내지 13d는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 및 유효성 평가에 대한 결과를 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 분화(Differentiation) "는 세포가 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 발달하는 것을 의미한다.
실시예 1. 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드의 형성 과정
이하에서는 도 1 내지 10c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드의 형성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법은, 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계, 분화된 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)이 융합 조직을 형성하도록 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계 및 형성된 융합 조직이 심장 오가노이드를 형성하여 성장하도록 제 3 유지 배지에서 제 3 배양하는 단계를 포함한다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "제 1 유지 배지"는, 동물세포를 유지 및 성장시키기 위해 사용되는 인슐린을 포함하지 않은 천연 또는 인공의 무혈청 배지를 의미한다. 보다 구체적으로, 제 1 유지 배지는 인슐린을 의도적으로 배제하여 만능 줄기세포 유래의 심근세포 형성에 있어, 심근이 형성되기 전 과정인 심중배엽 형성을 억제할 수 있으며, 항상화 물질을 포함하여 활성 산소에 의한 세포 손상을 억제할 수 있다. 나아가, 제 1 유지 배지는 인슐린을 포함하지 않는 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F 12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인슐린을 포함하지 않는 RPMI 1640일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 배양 환경 조건에서 온도는 36 ℃내지 38 ℃바람직하게는 36.5 ℃내지 37.5 ℃이며, 공급 산소(O2)는 1 % 내지 25 %이며, 공급 이산화탄소(CO2)는 1 % 내지 15 %일 수 있다.
이하에서는 전술한 제 1 배양하는 단계, 제 2 배양하는 단계 및 제 3 배양하는 각 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
(1) 심근세포 형성을 위한 제 1 배양 단계
먼저, 도 2a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 2b를 참조하여 설명한다.
도 2a를 참조하면, 제 1 배양하는 단계는, 만능 줄기세포를 접종하는 단계, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(Mesodermal induction medium)에서 배양하는 단계 및 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 만능 줄기세포를 접종하는 단계에서는, 미분화 상태의 만능 줄기세포를 단백질 분해 효소를 이용하여 조직에서 분리한 후, 제 1 유지 배지와 현탁하여 만능 줄기세포의 밀도가 3 내지 6 × 104 /cm2 되도록 플레이트상에 접종(Seeding)시킨다. 이때, 접종된 만능 줄기세포의 밀도는 3 내지 6 × 104 /cm2 인 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 5 × 104 /cm2일 수 있다.
나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 분해 효소"는, 생체 조직에 포함되는 세포 또는 세포 집합체를 유리시키기 위해서 세포간 기질을 단리시킬 수 있는 효소를 의미하며, 조직으로부터 만능 줄기세포를 분리 또는 세포 및 세포 집합체를 분리하기 위하여 콜라제네이즈(Collagenase), 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease) 및 트립신(Trypsin) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더 나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "플레이트"는, 세포 배양이 이루어질 수 있는 것이라면 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 팸버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이 및 배양 백 등 다양한 모양의 플레이트가 이용될 수 있으며, 상부 표면에 세포 부착층 코팅막을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 플레이트의 코팅막은, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미딘, 라미딘 프래그먼트, 비트로넥린, 기저막 매트릭스, 젤라틴, 히알루론산, 폴리리신, 비트로넥린 및 마트리겔 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 만능 줄기세포는 코팅막을 포함하는 플레이트에 배양됨에 따라 세포의 접착 및 신전이 촉진되어, 중배엽 계통 세포의 분화 효율이 증가될 수 있다.
그 다음, 접종된 만능 줄기세포를 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계는 접종된 만능 줄기세포를 적응 및 안정화를 위한 단계로서, 2 내지 3일간 제 1 유지 배지를 매일 교체해주며 만능 줄기세포를 배양한다. 이에, 도 2b를 참조하면, 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계를 통하여 만능 줄기세포가 안정화되어, 배양 시작일(D0)에는 구형의 만능 줄기세포가 플레이트에 부착된 것으로 나타난다.
그 다음, 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계에서는, 0.1 내지 8 μM의 CHIRR99021, 50 내지 150 ng/ml의 Activin A, 1 내지 10 ng/ml의 BMP4, 0.01 내지 3 μM의 Wnt 저해제 및 제 1 유지 배지를 포함하는 유도 배지에서 만능 줄기세포가 배양됨으로써, 중배엽 세포가 유도될 수 있다.
보다 구체적으로, 플레이트에 부착된 만능 줄기세포는 배양 시작일(D0)에 0.1 내지 8 μM의 CHIRR99021 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지에서 2일간 배양된다. 이때, CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 8μM일 수 있으나, 바람직하게, 배양 시작일(D0)에 만능 줄기세포의 생존 및 증식의 효과를 향상시킬 수 있는 CHIRR99021의 함량은 5 내지 7uM일 수 있다.
이때, CHIRR99021는 GSK(Glycogen synthase kinase)-3β의 활성을 억제하는 물질이다. 보다 구체적으로, GSK-3β가 억제됨에 따라 세포 증식에 관여하는 신호전달체계의 ß-catenin이 GSK-3β에 의해 분해되지 않아 세포 증식에 관여하는 유전자 발현량이 증가되어, 세포의 생존 및 증식이 향상될 수 있다.
또한, Activin A 및 BMP4는 TGF-β그룹에 속하는 성장 및 분화인자로서, 배아 발생과정 중 중요한 세포신호 체계인 BMP 및 Activin/Nodal 신호를 활성화하여 외배엽성 신경계로의 분화는 억제하고 중배엽성 계통으로의 분화를 촉진시킬 수 있다.
또한, Wnt 저해제는 세포내 신호 전달 시스템에 기여하는 Wnt 단백질을 저해하는 물질로서, GSK-3β를 활성시켜 중배엽 세포를 심장 전구세포로 분화시킬 수 있다. 나아가, Wnt 저해제는 IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, Wnt 신호 체계를 저해하여 GSK-3β를 활성시킬 수 있는 모든 물질을 포함할 수 있다. 이러한, Wnt 저해제의 처리를 통하여 중배엽 세포는 심근 세포의 구성 단백질 중 하나인 cTnT(cardiac troponin T) 양성률이 80 내지 98 %인 고순도의 심장 전구세포로 분화될 수 있다.
그 다음, 배양 2일째의 만능 줄기세포(D2)는 CHIRR99021가 제거되고, 50 내지 150 ng/ml의 Activin A 및 마트리겔과 1 : 40의 부피비를 이루도록 혼합된 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 1일간 배양된다.
그 다음, 배양 3일째의 만능 줄기세포(D3)는 0.5 내지 8 μM의 CHIRR99021, 1 내지 10 ng/ml의 BMP4 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 2일간 배양되어 중배엽 세포로 유도될 수 있다. 이때, CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 8μM일 수 있으나, 바람직하게, 배양 3일째(D3)에 만능 줄기세포의 생존 및 증식의 효과를 향상시킬 수 있는 CHIRR99021의 함량은 0.5 내지 2uM일 수 있다.
그 다음, 중배엽 세포로 유도된 배양 5일째의 만능 줄기세포(D5)는 0.01 내지 3 μM의 Wnt 저해제 및 제 1 유지 배지를 포함하는 배지로 교체되어 2일간 배양된다.
이에, 전술한 방법에 의하여, 7일간 배양된 만능 줄기세포(D7)는 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포(cardiac progenitor)로 유도 분화될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 만능 줄기세포는 플레이트에 부착된 형태로 배양되어(D0), 중배엽 세포 단계(D2 내지 D3)을 거쳐, 심장 전구세포(D5)로 유도 분화될 수 있다.
그 다음, 분화된 심장 전구세포는 성숙한 심근세포로 분화되도록 제 1 유지 배지에서 배양된다. 보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 심장 전구세포는 배양 5일째(D10)부터 자가 수축(spontaneous contraction)하는 성숙한 심근세포가 출현하기 시작하며, 성숙한 심근세포의 출현 이후, 제 1 유지 배지에서 4 내지 5일간의 배양을 통하여 심근세포를 증식 및 성장시킬 수 있다. 이때, 심근세포의 증식 및 성장을 위한 배양의 기간이 4 내지 5일을 경과할 경우, 심근세포의 수가 줄어들 수 있다. 이에, 심근세포의 수율이 극대화될 수 있는 배양기간은 바람직하게 4 내지 5일(만능 줄기세포로부터 배양된지 14 내지 15일)일 수 있다.
이상의 제 1 배양하는 단계를 통해, 만능 줄기세포는 자가 수축할 수 있는 성숙한 심근 세포를 고수율로 분화시킬 수 있는 효과가 있다. 나아가, 이러한 성숙한 심근세포는 심장 근육세포의 근본적 치료제로 활용할 수 있다. 예를 들어, 심장 기능의 회복 또는 심장 질환의 치료를 위한 재생 세포치료에 이용될 수 있다. 또한, 제 1 배양하는 단계를 통해 형성된 심근 세포는 신약 개발 과정에서 후보물질의 심장 독성에 대한 안정성 및 효과 판별 실험에도 사용될 수 있다.
(2) 융합 조직 형성을 위한 제 2 배양 단계
먼저, 도 3a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 2 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 3b 내지 4b를 참조하여 설명한다.
도 3a을 참조하면, 제 2 배양하는 단계는, 만능 줄기세포가 성숙한 심근세포로 분화되도록 제 1 배양하는 단계 이후에 수행되며, 제 1 배양단계를 통하여 형성된 성숙한 심근세포를 포집하여 세포외 기질이 위에 얹고, 제 1 유지 배지를 첨가하여 심근세포와 세포외 기질이 융합 조직을 형성하도록 28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양한다.
보다 구체적으로, 도 3b를 참조하면, 제 2 배양 첫날(D0)에서는 심근 세포와 세포외 기질이 서로 구분되어 떨어져 있는 것으로 나타난다. 그러나, 세포 배양이 진행될수록, 심근세포와 세포외 기질은 서로 단단히 융합되어 세포 집괴(cell clump)가 형성되고, 30일 동안 배양하였을 때, 세포 집괴가 세포외 기질에 넓게 퍼져 패치(patch) 형태의 융합 조직이 형성된 것으로 나타난다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 세포외 기질은 섬유아세포로부터 획득될 수 있으며, 바람직하게는 심장 조직에서 유래한 섬유아세포로부터 획득될 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4a를 참조하면, 먼저, 심장 조직으로부터 획득된 섬유아세포를 8 내지 10 %의 FBS, 0.5 내지 2 %의 glutamax, 0.5 내지 2 %의 non-essential amino acids, 0.5 내지 2 %의 antibiotix-antimycotix, 1 내지 3 mM의 acetic acid, 0.1 내지 0.3 mM의 ascorbic acid 및 5 내지 15 ng/ml의 BMP4를 포함하는 저혈청 배지(Advanced DMEM/F12)에서 3주간 배양하여, 섬유아세포로부터 세포외 기질을 배출시킨다. 그 다음, 세포외 기질이 배출되어, 섬유아세포와 패치 형태로 결합되어 있는 조직을 탈세포화(decellularization) 과정을 통하여 세포외 기질만 추출한다. 이때, 탈세포화 과정은 패치 형태로 결합되어 있는 조직에 0.25 %의 trypsin을 37 ℃의 항온수조에서 3시간 동안 처리한 뒤, 3 %의 triton-X 및 0.05 %의 EDTA가 포함되어 있는 PBS를 첨가하여 30분간 교반시켜 수행될 수 있다. 이에, 도 4b를 참조하면, 섬유아세포와 세포외기질이 뒤섞여 불투명했던 결합 조직이 탈세포화 과정을 통하여, 섬유아세포가 분리되어 세포외 기질만 남아 부피가 줄어들고, 투명하게 변한 것으로 나타난다.
이상의 제 2 배양하는 단계를 통해, 심근세포는 심장 조직의 섬유아세포로부터 유래한 세포외 기질과 배양됨에 따라, 생체와 유사한 물리적 환경에서 심장 융합 조직으로 발달할 수 있는 효과가 있다.
(3) 심장 오가노이드 형성을 위한 제 3 배양 단계
먼저, 도 5a는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에서의 제 3 배양하는 단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 5b 내지 10c를 참조하여 설명한다.
도 5a를 참조하면, 제 3 배양하는 단계는, 융합 조직 형성을 위한 제 2 배양 단계 이후에 수행되며, 제 2 배양 단계로부터 형성된 융합 조직이 제 2 유지 배지에서 배양된다. 보다 구체적으로, 도 5b를 참조하면, 패치 형태의 융합 조직이 세절된 현미경 이미지가 도시된다. 배양에 앞서, 패치 형태의 융합 조직을 피펫 등을 이용하여 물리적으로 여러 조각으로 세절한다. 그 다음, 3 내지 10개의 세절된 조직을 플레이트에 옮긴 뒤, 2일에 한번씩 제 2 유지 배지를 교체해주며 부유 배양(floating culture 또는 suspension culture)한다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "부유 배양"은, 스피너(spinner) 및 로테이셔널 챔버(rotational chamber) 등과 같은 교반기(stirrer)를 이용하여 세포를 끊임없이 움직여 바닥에 세포가 부착하지 못하도록 액상 내에 부유된 생태로 자라는 3차원 세포 배양 모델을 의미한다. 부유 배양은 세포가 배양액에 떠서 움직이다 보면 세포간 상호작용을 통해 보다 친화성이 높은 세포끼리 접착하고, 원래의 조직 구조를 반영한 구조를 만드는 특징이 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "제 2 유지 배지"는, 동물세포를 유지 및 성장시키기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 천연 또는 인공의 무혈청 배지를 의미한다. 보다 구체적으로, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함하여 포도당 및 아미노산의 흡수를 촉진시키고, 심장 오가노이드 형성 및 성장을 증진시킬 수 있다. 나아가, 제 2 유지 배지는 인슐린을 포함하는 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F 12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인슐린을 포함하는 RPMI 1640일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 방법에 의하여 형성된 심장 오가노이드는 생체 심장의 발생학 과정과 유사한 과정을 통하여 형성될 수 있으며, 이에, 형태 및 기능이 생체 심장과 매우 유사한 생체 대응 모델을 형성할 수 있다.
예를 들어, 다시 도 5a를 참조하면, 심근 세포와 세포외 기질로부터 형성된 융합 조직은 제 3 배양하는 단계 동안 심근 및 혈관, 챔버(심실) 및 신경, 유출입관 및 밸브, 심 내막근을 형성하여 심장 오가노이드로 발달할 수 있으며, 지속적으로 성장 및 유지될 수 있다. 이때, 각 조직의 형성 기간은 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 심근 및 혈관 0 내지 10일, 챔버 및 신경 10 내지 30일, 유출입관 및 밸브 30 내지 60일 및 심내막근 60 내지 90일인 것으로 나타난다. 그러나, 각 세포 및 조직의 형성 기간은 이에 제한되는 것은 아니며, 세절된 조직의 크기에 따라 세포의 발달 및 성장 속도에 따라 상이할 수 있다.
한편, 심장은 심근 세포 내의 칼슘 이온 농도의 조절로 인하여 수축됨에 따라, 칼슘 트랜지언트(transient)의 확인을 통하여 심근 세포의 존재 및 자발적인 수축 운동의 여부를 확인할 수 있다.
이에, 심근의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 6a를 참조하면, 세포내 칼슘에 결합하는 염색 시약인 Fluo-4를 이용한 심근 발달 형태에 대한 형광염색 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드의 외측(outside) 및 내강(inside)에 칼슘 트랜지언트(transient)가 형성된 것으로 나타나며, 이는, 심장 오가노이드에 칼슘이 형성된 심근 세포가 존재하며, 이를 통하여 외부의 전기자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 내강에서의 심근 세포는 심장 오가노이드의 내측 방향으로 육주화(trabeculation)되어 형성된 것으로 나타난다. 이는, 심장의 발달 동안, 심근 세포가 심실 내강 내로 연장되어, 육주화된 심근 세포를 형성하여 심근을 비대하고 섬유화하는 과정과 유사한 것으로 나타난다. 보다 구체적으로, 도 6b를 참조하면, 배양이 진행될수록 심장 오가노이드의 심근이 육주화된 심근 세포로 인하여 비대해지는 것으로 나타난다. 이때, 심근 세포는 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 0 내지 10일 동안 형성되는 것으로 나타나며, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 심근의 형성과 동시에 심장 오가노이드에 혈관이 형성된다. 보다 구체적으로, 도 7을 참조하면, 심근 세포 확인 마커인 TNNT2(troponin T2) 및 혈관 내피 세포 확인 마커인 PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1)을 이용한 혈관 형성에 대한 면역 형광 염색 이미지가 도시된다. 이때, DAPI 염색을 이용하여 핵과 염색질(chromatin)을 대조적으로 확인하였다. 혈관 내피 세포는 심근 세포를 따라 심장 오가노이드의 외측 및 내강에 형성된 것으로 나타난다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 심장 발생 과정에서 나타나는 심근의 형성과 유사한 과정을 통하여 심장 오가노이드의 심근을 형성할 수 있으며, 심장 오가노이드의 심근 세포 내에 칼슘이 형성됨에 따라, 칼슘 이온 농도에 따른 수축 운동을 할 수 있다.
그 다음, 심장 오가노이드에서 생체 심장의 심실과 같은 기관인 챔버의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 8a를 참조하면, 심실 확인 마커인 MYL2(myosin regulatory light chain 2)를 이용한 심실 형성에 대한 면역 형광염색 이미지가 도시된다. 심실 확인 마커인 MYL2가 심장 오가노이드의 전체를 둘러싸며 발현된 것으로 나타나며, MYL2의 발현과 동시에 DAPI도 발현함에 따라, 형성된 심장 오가노이드의 세포 사멸(apoptosis)는 발생하지 않은 것으로 나타난다. 이때, 챔버는 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 10 내지 30일 동안 형성되는 것으로 나타나며, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 생체의 심실은 단순한 근육 조직이 아닌 액체를 수용할 수 있는 챔버(chamber)가 형성된 조직을 의미할 수 있다. 이에, 도 8b를 참조하면, 챔버가 형성된 심장 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시된다. 이때, 심장 오가노이드의 챔버 확인을 위하여, 바늘(needle) 및 집게(forcep)을 이용하였다. 제 3 배양하는 단계 시작일로부터 30일째의 심장 오가노이드를 집게를 이용하여 쥐어 짜낸 결과, 심장 오가노이드의 챔버 내에 수용되어 있던 액체가 분출되는 것으로 나타난다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 생체 심실과 형태학적으로 유사한 챔버를 형성할 수 있다.
그 다음, 신경 세포의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 9a를 참조하면, 자가 수축하는 심근 세포의 현미경 이미지가 도시된다. 보다 구체적으로, 심근 세포의 주변에 신경 섬유 다발(bundle of neuron fiber)이 형성된 것으로 나타난다. 이에, 신경 세포는 오가노이드가 형성되기 전, 심근 세포에서부터 형성된다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 도 9b를 참조하면, 신경 세포 확인 마커인 TUBB3(β-tubulin-III)를 이용한 신경 세포 형성에 대한 면역 형광염색 이미지가 도시된다. 신경 세포 확인 마커인 TUBB3가 오가노이드의 전체를 둘러싸며 발현된 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 신경 세포가 형성됨에 따라, 전기적인 방법으로 신호를 교류할 수 있다.
그 다음, 유출입관의 형성 여부를 확인하기 위하여, 도 10a를 참조하면, 심장 오가노이드의 유출입관에 대한 현미경 이미지가 도시된다. 보다 구체적으로, 심장 오가노이드는 챔버와 연결되어 챔버 내로 유체가 유입되는 제 1 관 및 챔버와 연결되어 챔버 내의 유체가 유출될 수 있는 제 2 관이 형성된 것으로 나타난다. 즉, 심장 오가노이드는 정맥 및 동맥과 연결되어 혈액이 순환되는 생체 심장과 유사한 구조를 형성할 수 있다.
나아가, 유체가 유입되는 제 1 관에는 유입관을 개폐시켜, 유체의 유입을 조절할 수 있는 밸브(valve)가 형성된 것으로 나타난다. 보다 구체적으로, 도 10b를 참조하면, 심장 오가노이드의 제 1 관에 형성된 밸브에 대한 형광염색 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드의 제 1 관에 형성된 밸브는 심근으로부터 유래된 얇은 근육층이 제 1 관을 개폐시키는 것으로 나타난다.
더 나아가, 도 10c를 참조하면, 심장 오가노이드의 밸브가 유체 흐름에 따라 조절되는 것으로 나타난다. 즉, 심장 오가노이드는 혈액을 일정하게 흐르도록 도와주는 판막과 유사한 기능 및 구조를 형성할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 제 1 관, 제 2 관 및 밸브를 통하여 심장 오가노이드 내부와 외부에 유체를 한 방향으로 일정하게 순환시킬 수 있다.
이상의 실시예 1을 통해, 본 발명의 다양한 실시예에 이용되는 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통한 심장 오가노이드는 생체 심장과 구조 및 기능적으로 유사하게 형성되어, 보다 생체 대응성이 높은 생체 유사 모델로 이용될 수 있다.
실시예 2. 심장 오가노이드의 기능성 검증 평가 확인
이하에서는 도 11a 및 11b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 수축 운동에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 11a의 (a)를 참조하면, 심장 오가노이드는 수축 운동에 대한 영상 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드는 일부분이 아닌 전체적인 면적이 수축 시에 줄어들고, 이완 시에는 확장되는 것으로 나타난다. 보다 구체적으로 11a의 (b)를 참조하면, 도 11a의 (a)의 영상 이미지 정보를 pixels/sec로 나타낸 결과가 도시된다. 심장 오가노이드의 자발적인 수축 운동은 초당 1회 정도 발생하는 것으로 나타난다. 이는, 심장 오가노이드가 인간의 정상적인 심장 박동수인 분당 60 내지 100회와 유사한 박동수를 갖는 것을 의미할 수 있다. 이때, 심장 오가노이드의 수축 운동은 초당 1회 정도 발생하는 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 심장 오가노이드의 크기 및 배양 시기에 따라 상이할 수 있다.
나아가, 도 11b를 참조하면, 심장 오가노이드의 수축 운동 시의 심근에 대한 이미지가 도시된다. 심장 오가노이드가 이완되어 유체가 유입될 경우, 심근의 두께는 188 내지 250 μm인 것으로 나타나며, 심장 오가노이드가 수축되어 유체가 유출될 경우, 심근의 두께는 310 μm인 것으로 나타난다. 이때, 심장 오가노이드의 심근의 두께는 이완될 경우 188 내지 250 μm이며, 수축될 경우 310μm인 것으로 나타나지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 심장 오가노이드의 크기 및 배양 시기에 따라 상이할 수 있다.
이상의 실시예 2를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는, 생체 심장과 유사한 수준의 자발적인 수축 운동 즉, 박동수를 가짐에 따라, 신약의 독성 및 유효성 평가에 있어 생체 심장에 대한 기능 모사 모델로 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 오가노이드 내부에서 발생하는 수축 운동에 따른 심근의 변화 및 유체의 유입까지 모니터링할 수 있다.
실시예 3. 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가
이하에서는 도 12 내지 13d를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법의 절차를 도시한 것이다. 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법은 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계(S110), 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하는 단계(S120), 세척된 심장 오가노이드를 배양하는 단계(S130), 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)를 포함할 수 있다.
이때, 심장 오가노이드는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드 제조 방법에 의하여 생성된 심장 오가노이드를 의미할 수 있으며, 육주화된 심근세포가 챔버의 내관을 향하여 형성됨에 따라, 심장의 발생 과정에서 나타나는 심근의 형성과 유사한 과정을 통하여 심근을 형성할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 유체가 저장되는 챔버, 챔버와 연결되어 유체가 유입되는 제 1 관, 챔버와 연결되어 유체가 유출되는 제 2관 및 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 신경 세포의 확인 마커인 TUBB3, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1 및 심실 확인 마커인 MYL2를 발현할 수 있으며, 칼슘 트랜지언트가 형성할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 체내 심장과 유사한 구조를 가지고, 외부의 전기 자극 없이 자발적인 수축 운동을 할 수 있으며, 외내부의 액체를 순환시킬 수 있다. 따라서, 심장 오가노이드는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성 평가에 있어 인체 모사 모델로 이용될 수 있다.
예를 들어, 항암 치료에 필수적인 항암제들은 종종 심독성을 유발하여 환자의 예후에 영향을 미치며, 항암제의 심독성으로 인한 심장 부작용으로 심실 기능 부전(LV dysfunction), 허혈, 고혈압 및 부정맥 등이 발생할 수 있다. 보다 구체적으로, 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 아이다루비신(Idarubicin), 에피리부신(Epirubicin) 등의 안트라사이클린계(Anthracyclines) 약물들은 심근 세포에 손상을 일으킨다. 이에, 심근 세포의 확인 마커인 TNNT2의 발현으로 심근 세포가 확인된 본 발명의 심장 오가노이드를 통하여, 안트라사이클린계 같은 심근 세포 손상 약물을 평가할 수 있다. 나아가, 혈관 내피세포의 확인 마커인 PECAM1의 발현으로 혈관 내피 세포가 확인된 본 발명의 심장 오가노이드를 통하여, 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 카페시타빈(Capecitabine) 및 5-플루오로유라실(Fluorouracil) 등과 같이 혈관 내피 세포를 손상시키는 약물을 평가할 수 있다. 더 나아가, 심실 확인 마커인 MYL2의 발현으로 심실이 확인된 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 통하여, 미토산트론(Mitoxantrone), 이포스파미드(Ifosfamide) 및 수니티닙(Sunitinib) 등과 같이 심실 기능 부전을 일으키는 약물을 평가할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드는 심장의 기능 및 구조적 요소를 모두 포함함에 따라, 다양한 약물에 대한 독성 및 유효성을 평가할 수 있다.
먼저, 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계(S110)에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 약물과 함께 플레이트에서 15 내지 60 분동안 반응시킨다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은, 생물의 이익을 위해 생리적 시스템 또는 질병 상태를 변화시키거나 검토하기 위해서 사용되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 비타민제, 호르몬제, 금속염류, 백신, 항혈청제, 항생제, 화학요법제제, 강심제, 혈압조절제, 항히스타민제, 스테로이드제, 해독제 및 조영제로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 다음, 약물 반응이 끝난 심장 오가노이드를 세척하고(S120), 세척된 심장 오가노이드를 배양한다(S130). 이때, 배양 환경 조건에서 온도는 36 ℃내지 38 ℃바람직하게는 36.5 ℃내지 37.5 ℃이며, 공급 산소(O2)는 1 % 내지 25 %이며, 공급 이산화탄소(CO2)는 1 % 내지 15 %일 수 있으며, 배양 시간은 30 내지 90 분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 다음, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 전술한 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)를 포함할 수 있다.
이때, 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계(S140), 촬영된 영상을 수득하는 단계(S150) 및 수득된 영상을 분석하는 단계(S160)에서는 Cellogy pulse analysis가 사용었으며, 촬영된 영상을 통하여 분석하는 방법은 연속적으로 촬영된 영상에서 세포 영역과 배경 영역 간의 픽셀(pixel)값의 변화량 차이를 측정하는 방법을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는, 촬영된 영상을 통하여 분석하는 방법뿐만 아니라, 심장 오가노이드의 온도, 신경 활동, 전도도, 압력 및 이온 등을 측정할 수 있는 다양한 전기 장치를 통하여 약물에 의한 심장 오가노이드의 변화도를 측정하고 평가할 수 있다.
한편, 전술한 방법에 의하여, 다양한 약물에 대한 심장 독성 및 유효성에 대하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 도 13a 내지 13d를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 및 유효성 평가에 대한 결과가 도시된다.
도 13a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드의 칼슘 길항제(calcium antagonist) 약물 처리에 따른 이미지 및 박동 속도에 대한 히트맵이 도시된다. 심장 오가노이드는 니페디핀(nifedipine) 및 베라파밀(verapamil)에 의하여 칼슘 채널이 차단되어, 박동 속도가 감소되고, 세척 및 1시간 배양 이후에는 박동 속도가 다시 증가하는 것으로 나타난다.
이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드가 고혈압 및 부정맥의 치료를 위한 칼슘 길항제의 효과를 생체 심장과 마찬가지로 동일한 반응으로 나타낼 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
*나아가, 도 13b를 참조하면, 니페디핀의 처리량에 따른 심장 오가노이드의 전도 변위, 박동 속도 및 심박 변이를 나타내는 결과가 도시된다. 이때, 전도 변위(conduction displacement)는 심장의 전기적 신호의 이상을 평가할 수 있으며, 이에 따른 심장의 변화는 박동 속도(velocity)의 변화로 나타낼 수 있다. 나아가, 심박 변이(beat rate variation)는 심장이 예기치 못한 자극에 적응하는 능력을 의미할 수 있으며, 심장의 건강상태 및 심장 활동을 조절하는 자율 신경계의 상태를 평가할 수 있다.
먼저, 니페디핀 처리 전의 전도 변위는 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 니페디핀의 처리 후의 전도 변위도 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 그러나, 세척 후의 전도 변위는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다. 나아가, 이에 따른 니페디핀 처리 전의 속도 또한, 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 니페디핀 처리 후의 속도도 100 nM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 세척 후의 속도는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다. 이는, 각 그룹에 따른 수축력의 차이로 기인한 차이일 수 있다.
그러나, 니페디핀 처리 전의 심박 변이는 세 그룹 모두 비슷한 것으로 나타나나, 니페디핀 처리 후의 심박 변이는 10 μM 처리 군이 가장 높으며, 100 nM 처리 군이 가장 낮은 것으로 나타나며, 니페디핀의 처리량이 증가할수록 비례적으로 심박 변이가 높아지는 것으로 나타난다. 이는, 니페디핀의 약물 처리량이 증가할수록, 심장오가노이드가 생체 심장의 부정맥과 같은 비정상적으로 빠른 수축 운동을 하는 것을 의미할 수 있다. 이에, 니페디핀은 10 μM 이상일 경우, 생체 내 심장에서 부작용을 야기할 수 있다는 것을 유추할 수 있다. 나아가, 심장 오가노이드는 생체 심장에서 나타나는 전기적 장애를 모사할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 도 13c를 참조하면, 베라파밀의 처리량에 따른 심장 오가노이드의 전도 변위, 박동 속도 및 심박 변이를 나타내는 결과가 도시된다.
먼저, 베라파밀 처리 전의 전도 변위는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타나며, 처리 후의 전도 변위는 1 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 나아가, 세척 후의 전도 변위 또한, 1 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 더 나아가, 이에 따른 니페디핀 처리 전의 속도는 10 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타나며, 처리 후 및 세척 후의 속도는 세 그룹이 모두 비슷한 것으로 나타난다.
그러나, 베라파밀 처리 전의 심박 변이는 세 그룹 모두 비슷한 것으로 나타나나, 베라파밀 처리 후의 심박 변이는 10 μM 및 100 nM 두 그룹이 비슷한 수준으로 1 μM 그룹에 비하여 높은 것으로 나타나며, 세척 후의 심박 변이는 10 μM 그룹이 가장 높은 것으로 나타난다. 이는, 베라파밀의 경우, 적은 약물 처리량에서도 심장오가노이드가 심장에서의 부정맥과 같은 비정상적으로 빠른 수축 운동을 하는 것을 의미할 수 있다. 이에, 베라파밀은 100 nM 이상일 경우, 생체 내 심장에서 부작용을 야기할 수 있다는 것을 유추할 수 있으며, 전술한 니페디핀보다 심장에 대한 약물 독성이 더 높은 것을 의미할 수 있다.
또한, 도 13d를 참조하면, 니페디핀 10 μM 처리에 따른 심장 오가노이드의 수축 운동에 대한 결과가 도시된다. 보다 구체적으로, 니페디핀 처리 전의 심장 오가노이드는 수축기에 50 내지 60 pixels 및 이완기에 30 내지 40 pixels의 크기로, 25 frames에 한번씩 박동(beating velocity)하는 것으로 나타나며, 수축 크기(contraction magnitude)는 25 frames에 한번씩 2 내지 3 pixels의 크기를 갖는 것으로 나타난다. 그러나, 니페디핀 처리 후의 심장 오가노이드는 수축기에 50 내지 100 pixels 및 이완기에 40 내지 80 pixels의 크기로, 25 frames에 여러번 박동(beating velocity)하는 것으로 나타나며, 수축 크기(contraction magnitude)는 50 frames에 한번씩 5 내지 7.5 pixels의 크기를 갖는 것으로 나타난다.
즉, 니페디핀 처리 전의 심장 오가노이드는 일률적인 수축 및 이완 운동을 하는 것으로 나타나나, 니페디핀 처리 후의 심장 오가노이드는 산발적인 수축 및 이완 운동을 하는 것으로 나타난다. 이는, 니페디핀이 정상적인 심장에서 심박수가 산발적인 부정맥과 같은 부작용을 일으킬 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
이상의 실시예 3을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성을 평가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가는 환자에 따른 약물에 대한 용량 및 적응력을 예측할 수 있으며, 신약 개발에 있어 약물이 유효량을 판달할 수 있다. 이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 2017R1D1A1B03036063
[부처명] 교육부
[연구관리 전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 이공학개인기초연구지원사업
[연구과제명] 진피섬유아세포를 인공심장유사조직으로 직접유도하고 심근경색모델에서의 치료효능과 기전을 규명
[기여율] 1/2
[주관기관] 연세대학교
[연구기간] 2020.03.01 ~ 2020.05.31
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 2015M3A9C6031514
[부처명] 과학기술정보통신부
[연구관리 전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 원천기술개발사업
[연구과제명] 유도만능줄기세포에서 심근세포 아형으로의 분화와 분리 및 이를 이용한 세포치료제 및 약물평가 기반기술 개발
[기여율] 1/2
[주관기관] 연세대학교
[연구기간] 2020.01.01 ~ 2020.05.31

Claims (17)

  1. 만능 줄기세포(pluripotent stem cells, PSCs)를 심근세포(cardiomyocytes, CM)로 분화되도록 제 1 배양하는 단계;
    융합 조직을 형성하도록 상기 심근세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 제 1 유지 배지(maintenance media)에서 제 2 배양하는 단계, 및
    심장 오가노이드를 형성하도록 상기 융합 조직을 제 2 유지 배지에서 제 3 배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 유지 배지는,
    인슐린은 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 배양 단계는,
    만능 줄기세포를 접종하는 단계;
    접종된 상기 만능 줄기세포를 상기 제 1 유지 배지에서 유지하는 단계;
    상기 만능 줄기세포가 중배엽 세포 단계를 거쳐 심장 전구세포로 유도되도록 만능 줄기세포를 유도 배지(induction medium)에서 배양하는 단계, 및
    상기 심장 전구세포가 성숙 심근세포로 분화되도록, 상기 중배엽 세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  4. 제 1항 내지 3항에 있어서,
    상기 제 1 유지 배지는,
    인슐린을 포함하지 않는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 유도 배지는,
    IWR-1 endo, XAV-939, JW74, SEN461, ICG-001, LGK-974, IWP-2, IWP-4, Wnt-C59 및 WIKI4로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 만능 줄기세포를 유도 배지에서 배양하는 단계는,
    5 내지 7일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 심장 전구세포를 제 1 유지 배지에서 배양하는 단계는,
    10 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포외 기질은,
    섬유아세포(fibroblast)로부터 획득된, 심장 오가노이드 제조 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 배양 단계는,
    28 내지 32일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 제 3 배양 단계는,
    상기 융합조직을 세절하는 단계, 및
    세절된 상기 융합조직을 부유배양하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드 제조 방법.
  11. 유체가 저장되는 챔버(chamber);
    상기 챔버와 연결되어 상기 유체가 유입되는 제 1 관(track);
    상기 챔버와 연결되어 상기 유체가 유출되는 제 2 관, 및
    상기 제 1 관에 형성되어 자발적으로 유입관을 개폐시키는 밸브(valve)를 포함하고,
    자가 수축(spontaneous contraction)을 하는, 심장 오가노이드.
  12. 제 12항에 있어서,
    상기 챔버는,
    TUBB3, TNNT2, PECAM1 및 MYL2를 발현하는 것을 특징으로 하는, 심장 오가노이드.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 챔버는,
    육주화(trabeculation)된 심근세포가 상기 챔버의 내관을 향하여 형성된, 심장 오가노이드.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 챔버는,
    칼슘 트랜지언트(transient)가 형성된, 심장 오가노이드.
  15. 청구항 제 11항 내지 14항 중 어느 한 항에 기재된 심장 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계;
    상기 약물 반응이 끝난 상기 심장 오가노이드를 세척하는 단계;
    세척된 상기 심장 오가노이드를 배양하는 단계;
    상기 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계;
    촬영된 상기 영상을 수득하는 단계, 및
    수득된 상기 영상을 분석하는 단계를 포함하는, 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법.
  16. 제 16항에 있어서,
    상기 영상을 분석하는 단계는
    상기 심장 오가노이드의 수축 운동 시의 연속적으로 촬영된 영상에서 세포 영역과 배경 영역 간의 픽셀(pixel)값의 변화량 차이에 기초하는, 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법.
  17. 제 17항에 있어서,
    상기 영상을 분석하는 단계는,
    전도 변위(conduction displacement), 심박 변이(beat rate variation) 및 박동 속도(velocity)를 측정하는, 심장 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913655A (zh) * 2018-07-16 2018-11-30 浙江大学 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230052384A (ko) * 2021-10-13 2023-04-20 고려대학교 산학협력단 심장 중배엽 세포 기반 성숙 심실 타입 심장 오가노이드
KR20230060365A (ko) * 2021-10-27 2023-05-04 조재연 3차원 세포 배양용 세포외 기질 및 이의 제조 방법
KR20230067138A (ko) * 2021-11-09 2023-05-16 고려대학교 산학협력단 다능성 줄기세포 유래 성숙한 심혈관 오가노이드 제조 방법
KR102553210B1 (ko) 2022-04-19 2023-07-06 사회복지법인 삼성생명공익재단 옥살리플라틴 약물 효능 예측용 조성물 및 이의 용도
KR20240043723A (ko) * 2022-09-27 2024-04-03 오알지 주식회사 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법
WO2024091043A1 (ko) * 2022-10-26 2024-05-02 한국화학연구원 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 신장암 오가노이드, 갑상선 오가노이드 또는 갑상선암 오가노이드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017059171A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Wake Forest University Health Sciences Spontaneously beating cardiac organoid constructs and integrated body-on-chip apparatus containing the same
KR20180038573A (ko) * 2015-09-03 2018-04-16 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘) 오가노이드 배양을 위한 3차원 하이드로겔
KR20190040317A (ko) * 2016-08-26 2019-04-17 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드 심근세포 성숙
WO2019174879A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Medizinische Hochschule Hannover Process for producing cardiac organoids
WO2019244044A1 (en) * 2018-06-20 2019-12-26 Novoheart Limited Ex vivo methods of screening for, and characterizing, cardiac therapeutics using preloaded cardiac tissues
WO2020014212A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Clemson University Research Foundation Myocardial organoids and methods of making and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2741806T3 (es) * 2013-09-20 2020-02-12 Georg August Univ Goettingen Stiftung Oeffentlichen Rechts Univsmedizin Un método para la diferenciación directa de células madre pluripotentes en músculo cardíaco funcional
JP7315923B2 (ja) * 2017-09-29 2023-07-27 史敏 石野 臓器オルガノイド及びその製造方法
WO2019106438A1 (en) * 2017-11-29 2019-06-06 Novoheart Limited Bioreactor screening platform for modelling human systems biology and for screening for inotropic effects of agents on the heart
CN112055600A (zh) * 2018-03-07 2020-12-08 特温特大学 用于制备中空3d细胞组织结构的模具和方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180038573A (ko) * 2015-09-03 2018-04-16 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘) 오가노이드 배양을 위한 3차원 하이드로겔
WO2017059171A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Wake Forest University Health Sciences Spontaneously beating cardiac organoid constructs and integrated body-on-chip apparatus containing the same
KR20190040317A (ko) * 2016-08-26 2019-04-17 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드 심근세포 성숙
WO2019174879A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Medizinische Hochschule Hannover Process for producing cardiac organoids
WO2019244044A1 (en) * 2018-06-20 2019-12-26 Novoheart Limited Ex vivo methods of screening for, and characterizing, cardiac therapeutics using preloaded cardiac tissues
WO2020014212A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Clemson University Research Foundation Myocardial organoids and methods of making and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILLS RICHARD J.; PARKER BENJAMIN L.; QUAIFE-RYAN GREGORY A.; VOGES HOLLY K.; NEEDHAM ELISE J.; BORNOT AURELIE; DING MEI; ANDERSSO: "Drug Screening in Human PSC-Cardiac Organoids Identifies Pro-proliferative Compounds Acting via the Mevalonate Pathway", CELL STEM CELL, ELSEVIER, CELL PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 24, no. 6, 1 January 1900 (1900-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 895, XP085709120, ISSN: 1934-5909, DOI: 10.1016/j.stem.2019.03.009 *
See also references of EP4123014A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913655A (zh) * 2018-07-16 2018-11-30 浙江大学 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法

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