CN112055600A - 用于制备中空3d细胞组织结构的模具和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备中空3D细胞组织结构如类器官的模具及其应用。还提供了用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的方法。

Description

用于制备中空3D细胞组织结构的模具和方法
本发明涉及一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官(特别是人类仿真心脏(heart mimic))的模具，该模具包括：外部主体，其具有界定该外部主体中的空腔的内表面；和内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体定位于所述外部主体的空腔中，并且其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的用于在其中容纳细胞的培养室。此外，本发明还涉及一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官(特别是人类仿真心脏)的方法。
药物的研发过程常常由新研发药物的特异性及低功效加上其毒副作用所困扰，从而导致高的损耗率。因此，药物的研发过程通常为高成本且耗时的过程。尽管在世界范围内用于开发的费用日益增加，但进入市场的新分子实体(new molecular entities)的实际数量却在下降。例如，心血管疾病(遗传性疾病和后天获得性疾病，包括离子通道病(channelopathies)、心肌病、心肌梗塞等)在世界范围内是发病率和死亡率的主要原因，但是尚未获得完全有效的治疗方法。出现药物诱导性心脏毒性是临床安全性试验中30％的候选药物失败的原因，使得新药无法应用于患者，并造成数十亿欧元的投资损失。
在更好地理解疾病的潜在机制以及避免药物诱导性心脏毒性方面的主要局限性在于缺乏可预测的3D细胞组织模型。这种局限性是源于以下事实：由于伦理问题以及缺乏年龄对照和基因匹配对照，无法以人类进行临床前研究。而使用动物模型的缺点是这些非人类模型不能如实地重现人类疾病，这严重限制了这些模型的可预测性和有效性。
人类干细胞的使用，特别是关于人类诱导性多能干细胞(hiPSC)的产生的开创性发现，为个性化药物打开了大门，即利用来源于患者的细胞进行人类体外疾病建模和制备用于再生药物的人类特定细胞类型。因此，在过去的数年中已经开发了新的方法来基于此类细胞生成3D组织结构。一种制造3D细胞组织的已知方法是基于将细胞(例如hPSC心肌细胞)浇铸在模具中，所述细胞被细胞外基质(ECM)如基质胶(Matrigel)、胶原蛋白I和纤维蛋白包围，所述模具具有内部主体，该内部主体位于外部主体的空腔中，其中，外部主体的内表面与内部主体的外表面围成了在二者之间的培养室以用于在其中培养细胞组织。现有模具的缺点在于其中的组织的特定3D结构由设置在模具的内部主体与外部主体之间的培养室确定。当所述主体具有复杂的形式时，特别是在不干扰已形成的3D组织的情况下，由于在培养室中形成3D细胞组织结构后去除模具主体可能很困难，因此现有的模具将仅限于提供相对简明形状的3D细胞组织结构。例如，以当前技术极难或甚至不可能制成特征为比90°尖锐的角的形状、椭圆形状或不同形状的组合，例如模仿心脏的一个心室或者一个心房与一个心室的组合。
因此，本发明涉及用于产生具有高度结构复杂性的基于细胞的结构(生物组织)的装置和方法。更具体地，本发明能够制造具有中空特征的基于细胞的结构。
本发明的一个特定目的是提供一种用于制备中空3D细胞组织结构的改进模具。本发明的另一特定目的是提供一种用于制备类器官、特别是人类的类器官的改进模具。本发明的又一特定目的是提供一种用于制备人类仿真心脏的改进模具。
为了满足本发明的这些以及其他的目的和方面，本发明提供了如所附一项或更多项权利要求中所限定的模具。还提供了如所附一项或更多项权利要求中所限定的方法、用途和生物反应器。
特别地，根据本发明，提供了一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的模具，该模具包括：外部主体，其具有界定该外部主体中的空腔的内表面；和内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体定位于所述外部主体的空腔中，并且其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的用于在其中容纳细胞的培养室，所述模具的特征在于所述内部主体以变形(fugitive)材料制成为预定形状，从而使得所述内部主体的至少一部分能够在不影响所形成的细胞结构和/或细胞组织的完整性的情况下得以降解。根据本发明的模具将生物相容性变形材料的可降解性或融化性与细胞结合在一起，从而允许形成具有复杂形状和特征的三维生物组织。因此，根据本发明的模具特别适用于制备类器官。由于根据本发明的模具包括由变形材料制成的可降解的内部主体，因此它特别适用于制备具有空腔的类器官或中空的类器官。这种类器官的非限制性示例是心脏类器官、肾类器官、肺类器官、消化道类器官、膀胱类器官和眼类器官。在一些优选的实施方案中，用根据本发明的模具来制备人类的类器官。如本文所使用的，人类类器官被定义为这样的类器官：其包含来源于人类细胞的细胞，例如，该细胞来源于人类干细胞和/或人类祖细胞和/或分化程度更高的人类细胞，例如来自生长(分裂)中的人类组织细胞。特别地，根据本发明的模具允许制备人类仿真心脏，其具有呈现出心脏空腔的中空结构并允许细胞组织中的心肌细胞收缩和实现心脏的泵血功能。相同的构思适用于例如肺中的肺泡或肾脏中的肾髓质(椎体)或消化道、膀胱或眼睛的中空结构。
根据本发明，通过以下方法制备3D细胞组织结构、特别是类器官：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为变形材质、呈预定形状并具有外表面；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供细胞，特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞，到所述培养室中；
-在所述内部主体的外表面周围的培养室中，将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进支承细胞结构(supported cell structure)的形成，和/或将其置于温育条件下以促进细胞组织的形成；
-将所述变形材料的内部主体置于使该变形材料反应的条件下从而使该内部主体降解，以从所述空腔中除去该内部主体，而不显著影响在培养室中形成的支承细胞结构或细胞组织的完整性，并保持该支承细胞结构或形成的细胞组织的功能。
如本文所使用的，术语“支承细胞结构”是指其中细胞的运动能力与水溶液中的细胞的运动能力相比降低的结构。优选地，细胞的运动能力被限制到这样的程度即它们是固定的，这意味着细胞保持在给定位置周围的特定区域内。优选地，这是通过将细胞包封到水凝胶中来实现的。因此，优选的支承细胞结构是具有被包封的细胞的水凝胶。
如本文所使用的，术语“组织的形成”是指其中细胞彼此连接的过程。通常，组织的形成涉及细胞的增殖和/或细胞彼此的附着，从而生长出细胞组织结构，优选其为类器官。
促进支承细胞结构的形成的温育条件例如包括允许使培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液的黏度提高的条件，和/或允许形成水凝胶的条件。
促进细胞组织的形成的温育条件例如包括约37摄氏度的温度和/或包含5％CO2和21％O2的环境。
如本文所使用的，术语“不显著影响所形成的支承细胞结构或细胞组织的完整性”是指所形成的支承细胞结构或细胞组织的结构和/或功能不会由于内部主体的降解而被显著改变。在优选的实施方案中，内部主体的降解不会不利地影响培养室中的支承细胞结构或细胞组织的完整性，这意味着与内部主体降解之前的支承细胞结构或细胞组织的细胞数量和功能相比，内部主体的降解不会导致支承细胞结构或细胞组织的可测量的细胞损失或可测量的功能降低。
根据本发明的用于制备中空3D细胞组织结构的模具和方法二者均基于内部主体在培养室中形成了支承细胞结构和/或细胞组织之后是可降解的，从而不管支承细胞结构或细胞组织结构的形状如何并且在不显著干扰或影响支承细胞结构或细胞组织的情况下，使得内部主体可以从所述细胞结构和/或细胞组织中得以释放出来。为此，内部主体至少部分地并且优选地完全由变形材料制成。如本文所使用的，变形材料包括如下条件的任何材料：允许在将特定条件应用于该材料时通过将该材料改变或转变成不同形式或状态而将其与其他材料相分离，该特定条件不会显著影响或改变支承细胞结构或细胞组织。例如，变形材料可以是从固态转变为流体状态的材料(在固态下，它可以以预定的形状形成根据本发明的模具的内部主体，在流体状态下，其可以流出)，从而在支承细胞结构或细胞组织结构内部形成空腔。用于使变形材料变化或转变的特定条件可以例如是暴露于酶、反应性化合物、温度、压力、声音和/或特定波长的光。如果超过了用于变形材料的这些条件的特定阈值，则这些条件可以导致变形材料的变化或转变。所述变形材料可以特别适合于具有这些条件中之一的阈值，其允许所述变形材料在这样的阈值处变化或转变为以下状态：其中，模具的内部主体降解，而不会显著干扰或影响支承细胞结构或细胞组织，优选不会不利地影响所形成的细胞结构或细胞组织的功能。
因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述变形材料适合于在以下情况下降解：在高于或低于温度阈值的情况下和/或在酶存在的情况下和/或在反应性化合物存在的情况下和/或通过超声处理的情况下和/或在具有大于或小于阈值的波长的光存在的情况下。
在可以使变形材料变化或转变从而使内部主体降解的可能条件中，采用温度变化在许多情况下可以容易地实现。因此，在另一优选实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述变形材料适合于在10至50摄氏度之间、更特别地在25至40摄氏度之间的温度下降解。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述变形材料在低于10摄氏度时基本上是固态的，并且适合于在高于10摄氏度时融化和/或液化，特别是在10至42摄氏度之间的温度下融化和/或液化。例如，由明胶制成的内部主体可以适合于在低于10摄氏度时为固体，从而以预定的形状形成内部主体，并且在将内部主体暴露于在10至42摄氏度之间的较高温度时液化，使得所产生的液体可以在3D细胞结构或细胞组织结构已在模具中形成时从3D细胞结构或细胞组织结构中流出。对于大多数细胞结构和细胞组织而言，在10至42摄氏度之间的温度不是会造成干扰或影响的条件。特别地，当将细胞暴露于这样的温度下时，细胞的活性将不会或至少不会相应地降低。
在另一个特定实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述变形材料在高于15摄氏度时基本上是固体，并且适合于在低于15摄氏度时融化和/或液化。例如，包含
Figure BDA0002753235360000041
F-127的内部主体可以适合于在15摄氏度以上为固体(特别是凝胶状)，从而以预定的形状形成内部主体，并且在将内部主体暴露于低于15摄氏度的温度时(例如利用温度低于15摄氏度的溶解性流体)融化，使得所产生的溶液可以在模具中形成3D细胞结构或细胞组织结构时从3D细胞结构或细胞组织结构中流出。
因此，一些特定的实施方案提供了一种用于制备中空的3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的模具，该模具包括：外部主体，其具有界定该外部主体中的空腔的内表面；内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体定位于所述外部主体的空腔中，其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的用于在其中容纳细胞的培养室，该模具特征在于：所述内部主体以可降解材料制成为预定形状，从而使得所述内部主体的至少一部分能够在不显著影响所形成的细胞结构和/或细胞组织的完整性的情况下降解。可降解材料优选在以下情况下可降解：在高于或低于温度阈值的情况下和/或在酶存在的情况下和/或在反应性化合物存在的情况下和/或通过超声处理的情况下和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下。在一些实施方案中，可降解材料在10至50摄氏度之间、优选在25至40摄氏度之间的温度下可降解。在一些实施方案中，可降解材料在低于10摄氏度时基本上是固体，并且在高于10摄氏度时融化和/或液化，优选在10至42摄氏度之间的温度下融化和/或液化。在一些实施方案中，可降解材料在高于15摄氏度时基本上是固体，并且在低于15摄氏度时融化和/或液化。
根据本发明的模具的另一优选实施方案的特征在于，变形材料包括明胶、特别是至少10％的明胶，和/或
Figure BDA0002753235360000051
F-127和/或聚(乙烯醇)(PVA)。这些变形材料与细胞和/或细胞组织具有生物相容性，并且还允许利用常规的众所周知的手段(例如，简单的切割工具)将模具的部件形成为预定的或期望的形状。
根据本发明的模具的另一特定实施方案的特征在于，内部主体和外部主体由变形材料制成。因此，除了内部主体之外，模具的外部主体也可以由变形材料制成，以便可以将其降解以在3D细胞结构或细胞组织结构在模具中形成时将其从模具中完全释放出来。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，内部主体和外部主体由不同的变形材料形成。因此，由于模具的内部主体和外部主体不是由相同的变形材料制成，因此可以防止当将变形材料暴露于变化或转变性的条件时内部主体和外部主体同时降解。相反，变形材料可以在特定条件下具有不同的变化或转变阈值，或者可以需要完全不同的条件，以便能够独立地控制内部主体和外部主体的降解。在备选的实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，内部主体和外部主体由相同的变形材料形成，从而允许内部主体和外部主体一步降解或同时降解。通过在模具内在更加局部的范围内施加降解条件(通过使内部主体或外部主体暴露于该降解条件)可以使由相同的变形材料形成的内部主体和外部主体彼此独立地降解。例如，可以通过向模具中的相应的主体供应降解性流体(例如热的流体或含有已融化的降解性化学制品、酶等的流体)使内部主体或外部主体降解。
在本发明的另一方面，模具包括或设置有支撑装置，该支撑装置用于支撑模具的外部主体的至少一部分。支撑装置可以由外部主体的外层形成，该外层是非变形(non-fugitive)材料，即在内部主体的变形材料和/或外部主体的内层降解的情况下是不可降解的。支撑装置也可以与外部主体是完全分开的。例如，支撑装置可以包括支撑主体，例如支撑容器，其限定了以下腔室：其中放置有模具的外部主体和内部主体以在其中形成3D细胞组织结构。优选地，支撑装置，例如支撑容器，在使用模具形成3D细胞组织结构的整个过程中(例如，在培养过程中)保持完整。支撑装置(例如，支撑容器)可以限定用于在其中放置模具的外部主体和内部主体的腔室，该腔室被密封或至少对于外部环境几乎不透液体地封闭。特别地，由支撑装置限定的腔室构成无菌环境，在该环境中可以形成和维持3D细胞组织结构。优选地，支撑装置(例如，支撑容器)使得在至少模具的内部主体和/或外部主体降解之后3D细胞组织结构可以被保持在容器中。支撑装置(例如，支撑容器)可以是模具的一部分，例如被包括在模具的外部主体中，或者可以是与模具分开的另外的实体，例如，由例如塑料制成的单独的容器。优选地，支撑装置(例如，支撑容器)是透明的，以便可以目视检查腔室及其内容物，例如：模具和/或支承细胞结构和/或细胞组织结构。优选地，根据本发明的模具允许在组织结构形成之后并且可选地在通过降解而除去模具的内部主体和/或外部主体之后在模具中培养和分析3D细胞组织结构，例如类器官。例如，这可以通过支撑装置在模具的内部主体和/或外部主体降解之后来支撑3D细胞组织结构来实现。特别地，这消除了进一步处理或转移所形成的3D细胞组织结构的需要。因此，利用根据本发明的模具可以减少3D细胞组织结构的处理步骤和/或处理时间。此外，显著减少了由于处理这类通常敏感的组织而产生问题的风险，例如破坏或不利地影响所述组织。
在另一优选实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述内部主体被制成不规则形状和/或任何其他期望的形状，特别是心室状或心房状或心状的形状。由于本发明依赖于模具的内部主体是可降解的，所以不论主体形状如何，都可以将这种内部主体从所形成的细胞结构或细胞组织以及外部主体中移出。因此，可用本发明的模具和方法制备的细胞组织可以具有任何期望的形状，无论是规则形状还是更复杂的形状。因此，可以制备类似于任何类器官(例如人的心脏)的3D细胞组织结构，其允许进行对人类心脏功能的逼真的建模。
在另一优选实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，所述外部主体包括至少一个与所述空腔流体连通的开口。所述至少一个开口提供了通过外部主体进入空腔的入口，使得可以将例如细胞、细胞组织的其他成分和培养基引入到培养室中。
在另一优选实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，外部主体包括：第一开口，其通过用于将流体引导至所述空腔的第一导管与用于容纳的所述空腔间流体连通；以及第二开口，其通过用于将流体引导离开所述空腔的第二导管与用于容纳的所述空腔间流体连通。开口和相应的导管允许流体例如细胞培养基流入和流出空腔。特别地，流体的流动可以实现为连续的流动，以维持针对培养室内的细胞组织的合适条件。
在另一优选实施方案中，根据本发明的模具的特征在于，外部主体包括入口壁(inlet wall)，所述第一开口和所述第二开口均设置在所述入口壁中。通过在外部主体的相同的壁中、优选在外部主体的上壁中提供开口，外部主体的其他没有开口的壁可以提供外部主体该部分的液密性。这样，降低了在使用模具时的泄漏风险。
在一些实施方案中，被提供到培养室以形成细胞组织的细胞是祖细胞和/或干细胞，优选为多能干细胞。非限制性实例是成体干细胞和诱导性多能干细胞。在一些优选的实施方案中，将分化程度更高的细胞提供给培养室。在一些实施方案中，所述已分化的细胞选自心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心内膜细胞、心外膜细胞、心内膜细胞、平滑肌细胞、外膜细胞(percicytes)和神经细胞。在一些实施方案中，所述已分化的细胞是在体外利用引导干细胞和/或祖细胞分化为一种或更多种感兴趣的细胞类型的培养条件从干细胞和/或祖细胞获得的。优选地，使用人类干细胞，更优选为人类多能干细胞(hPSC)。在一些实施方案中，所述人类干细胞是人类诱导性多能干细胞(hiPSC)。当前的技术能够使人类多能干细胞分化为人体的大多数(如果不是全部)细胞类型，包括心血管谱系(lineage)。例如，已经完成了使hPSC分化为心房心肌细胞(Devalla等，2015)、心室心肌细胞(Elliott等，2011)、前体心外膜细胞(pro-epicardial cells)(Guadix等，2017)、心脏成纤维细胞(Witty等，2014)、平滑肌细胞(Witty等，2014)和内皮细胞(Orlova等，2014)。例如，通过使用补充有细胞因子(BMP4、ACTIVIN A和GSK3抑制剂(Chir99021))的混合物的根据(Ng，Davis，Stanley，&Elefanty，2008)的BPEL培养基(牛血清白蛋白[BSA]聚乙烯醇必需脂质)并施用Wnt抑制剂(XAV939)使人类多能干细胞分化为心血管谱系。作为另一示例，可以使hPSC分化为肾细胞(Takasato等，2014)、肺组织(Jacob等，2017)、消化道组织(Spence等，2011)、膀胱细胞(Oottamasathien等，2007)和视网膜组织(Osakada，Ikeda，Sasai和Takahashi，2009)。
被提供到培养室的细胞优选存在于培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中。
在优选的实施方案中，所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液包含一种或更多种用于使培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液的黏度提高的化合物。这种能够提高培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液的黏度的化合物在本文中也被称为增黏化合物。培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液的黏度提高有助于组织的形成，原因在于较高的黏度为培养的细胞提供了更多的支撑。在一些优选的实施方案中，使用能够在所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中形成水凝胶的化合物。这种化合物在本文中也被称为形成水凝胶的化合物。所得的水凝胶优选在培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液存在的情况下或与它们一起形成三维网状结构。由于水凝胶的3D结构为该3D空间中的培养细胞提供了更多支撑，所以水凝胶的存在特别有利于组织的形成。所述增黏化合物或形成水凝胶的化合物例如包括可以聚合和/或交联的化合物。如本文所使用的，术语“聚合”是指单体与另一单体或与增长中的聚合物链偶联，从而产生(更大的)聚合物链。术语“交联”是指在至少两条不同的聚合物链之间形成至少一个键。通常形成在两条支链聚合物链之间的所述键优选是共价键或离子键。在所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中增黏化合物的聚合和/或交联通常产生具有更高黏度的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液。在所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中形成水凝胶的化合物的聚合和/或交联通常产生至少部分包含培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液并可以将细胞包封的水凝胶。优选地，形成在稳态时其形状不改变的胶体或聚合物网络。这提供了以下优点：水凝胶为培养的细胞提供了特别良好的支撑，使得支承细胞结构在内部主体降解时也可以保持其形状。这样，形成了被支承细胞结构包围的中空空腔，可以对其进行进一步培养，以生长中空组织如类器官。在优选的实施方案中，所述增黏化合物或所述形成水凝胶的化合物包含支链聚合物。增黏化合物和/或形成水凝胶的化合物的非限制性实例是纤维蛋白原、I型胶原、聚乙烯醇、藻酸钙、Pluronic F-127、明胶、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、基质胶和聚乙二醇。
在本发明的优选实施方案中，使用增黏化合物或形成水凝胶的化合物，所述化合物在形成充足的细胞组织之后被降解。所述增黏化合物或所述形成水凝胶的化合物的降解不应完全或显著破坏细胞组织的结构和功能。优选地，所述增黏化合物或所述形成水凝胶的化合物的降解不会不利地影响细胞组织的结构和功能。
在特别优选的实施方案中，提供了以下根据本发明的方法，其中在培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中存在纤维蛋白原和凝血酶。在凝血酶存在的情况下，纤维蛋白原通常形成纤维蛋白链，所述纤维蛋白链聚合并与其他纤维蛋白链交联以形成广泛的互连纤维蛋白网络。因此在这些实施方案中纤维蛋白原被用作形成水凝胶的化合物。所产生的纤维蛋白网络为培养的细胞提供合适的支撑，从而形成支承细胞结构。随后，优选通过由细胞产生的金属蛋白酶来降解纤维蛋白网络。纤维蛋白网络通常在若干天内降解，而不会不利地影响正在形成的细胞组织的结构和功能。若干天的时间范围已经足够长，从而实现在内部主体降解之后所出现的中空结构(空腔)周围形成细胞组织。
为了促进细胞组织的形成，优选使用包含营养物和生长因子的培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含血清。优选地，例如还通过将模具置于37摄氏度、5％CO2和21％O2的培养箱中以向细胞提供氧气。
在一些实施方案中，在增黏化合物或形成水凝胶的化合物存在或不存在的情况下，所培养的细胞本身形成三维网状结构。在一些实施方案中，细胞通过细胞自组装形成三维网络。在一些实施方案中，所使用的细胞包含能够使细胞偶联的非天然化合物。在一些实施方案中，所使用的细胞在其细胞膜上包含生物正交基团，该基团可彼此结合，从而使细胞彼此连接。此类连接通常被称为“点击生物正交化学(click-bio-orthogonal chemistry)”(Rogozhnikov，O’Brien，Elahipanah和Yousaf，2016年)，适用于使细胞膜结合，从而使细胞彼此结合。这样，形成了3D细胞网状结构，该结构为培养的细胞提供了支撑并促进了组织的形成。在一些实施方案中，若干细胞在其细胞表面上具有酮基，而其他细胞在其细胞表面上具有氧胺基。随后，在混合这些细胞时，酮基和氧胺基将彼此结合，从而使细胞彼此结合。
在一些优选的实施方案中，根据本发明的方法用于制备心脏类器官。
如前所述，在更好地理解心脏疾病的潜在机制方面以及在避免药物诱导的心脏毒性方面的主要限制为缺乏可预测的人类心脏模型。在过去的数年中，已经开发出新的方法来生成更具预测性的3D的基于hPSC-心肌细胞的组织，如biowire(Nunes等人，2013)和工程化心脏组织(EHT)(Schaaf等人，2011)。尽管这些心脏组织允许测量收缩力，但它们的3D结构仅限于心脏组织带(cardiac tissue strips)，而由于心脏组织带不允许测量心脏体积和流体压力，所以无法直接对心脏的流体泵送功能进行建模。
尽管这些心脏组织带在心脏疾病建模领域具有广阔的前景，但它们具有缺少人类心脏泵血功能的重大缺点。其他已知的使用模具形成3D细胞组织结构的技术，例如如WO2015/184273中所述的使用球囊和导管，局限于具有相当简明形状的3D细胞组织结构。模拟3D泵血心脏功能优选例如分析泵血功能(射血分数)和液体流量，相当于体内心脏通过循环来泵送血液。此外，心输出量、射血分数和心脏电生理是主要的临床诊断输出这一事实强调了能够在体外心脏(疾病)模型中测量这些心脏参数的重要性。优选地，制造人类心脏类器官。与已知技术对比，本发明现在能够生成具有与人类心脏中存在的空腔类似的形状的中空心脏结构，其中四个对应的空腔(两个心房和两个心室)可以被按比例模制并成型，并且能够与人类心脏泵送血液类似地来泵送流体。特别地，本发明允许在3D细胞组织结构中设置单独的入口和出口通道，从而实现液体通过组织结构的空腔和通道连续地流动，例如经由出口通道将组织结构中的经由入口通道接收的流体泵送出该组织结构，其中所述出口通道在物理上与所述入口通道分开。与充其量提供具有相当简明的形状以及单个入口/出口通道的3D细胞组织结构的已知技术相比，这更为严格地模拟了人类的心脏。
根据本发明的用于制备心脏类器官的方法还具有以下优点：可以在无须将心脏组织从一个器皿(vessel)或容器移动到另一个器皿或容器的额外的处理步骤的情况下来形成中空的心脏结构，并且该中空结构可以为许多不同的形式，如果需要的话可以是不规则的形式。
根据本发明的一些实施方案，通过以下方法制备心脏类器官、优选为人类心脏类器官：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为变形材质、呈预定形状并具有外表面；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供细胞、特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中；
-在所述内部主体的外表面周围的培养室中，将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进支承细胞结构的形成，和/或将其置于温育条件下以促进细胞组织的形成；
-将所述变形材质的内部主体置于使该变形材料反应的条件下从而使该内部主体降解，以从所述空腔中除去该内部主体，而不显著影响所述培养室中已形成的细胞结构或细胞组织的完整性，并保持所形成的细胞结构或细胞组织的功能。
促进支承细胞结构的形成的步骤优选地包括将细胞包封到水凝胶中。
将内部主体置于使变形材料反应的条件下的步骤优选地包括通过温度变化来使内部主体液化和/或融化，特别是通过将温度从低于10摄氏度的起始温度升高到在10至40摄氏度之间的降解温度来使内部主体融化。
在本发明方法的一个特定实施方案中，通过将液化剂或融化剂供应至内部主体来使内部主体液化和/或融化。
在本发明方法的又一特定实施方案中，所述液化剂或融化剂包括酶或化合物或组合物。
在本发明的方法的另一实施方案中，通过超声处理或通过暴露于一定波长的光来使内部主体液化和/或融化。
特别地，在本发明方法的又一实施方案中，提供细胞到培养室中的步骤包括：提供细胞到外部主体的空腔中，然后将内部主体放置在外部主体的空腔内，从而将细胞(优选干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞)置于培养室中。
在本发明的方法的又一特定实施方案中，外部主体通过以下步骤来制备：制备外部主体的第一部分，其包括空腔的第一区；制备外部主体的单独的第二部分，其包括空腔的第二区，并且，将第一部分和第二部分彼此耦接，使得空腔的第一区和空腔的第二区彼此连通，从而形成空腔。这样，外部主体可以由两个最初分开的部分(例如，一半)制成，从而允许将内部主体便捷地引入和定位在空腔内。
被提供到培养室的细胞优选是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞。
在一些实施方案中，细胞组织的形成是在使内部主体降解的步骤之前。在其他实施方案中，细胞组织是在内部主体降解之后形成的。在这种情况下，在内部主体降解之前首先例如通过将细胞包封到水凝胶中来形成支承细胞结构，使得细胞保留在内部主体降解之后形成的空腔周围。
一些实施方案提供了一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的方法，该方法包括以下步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为变形材质、呈预定形状并具有外表面；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供细胞、特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中；
-在所述内部主体的外表面周围的培养室中，将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进支承细胞结构的形成；
-将所述变形材质的内部主体置于使该变形材料反应的条件下从而使该内部主体降解，以从所述空腔中除去该内部主体，而不显著影响支承细胞结构的完整性；以及
-允许形成中空的3D细胞组织。
如本文前面所述，所述细胞优选存在于包含增黏化合物的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中，以增强对所培养的细胞的支撑。在特别优选的实施方案中，所述细胞存在于包含形成水凝胶的化合物的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中，从而形成三维网络为细胞提供合适的支持。在一个优选的实施方案中，内部主体由明胶制成，其可以在高于25℃的温度下降解。
一些实施方案提供了一种用于制备心脏类器官、优选为人类心脏类器官的方法，其包括以下步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为预定形状并具有外表面，其中所述内部主体由明胶制成；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中，其中，所述细胞存在于包含增黏化合物和/或形成水凝胶的化合物的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中；
-允许提高培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液的黏度，和/或形成水凝胶，从而形成支承细胞结构；
-使明胶内部主体在20至40℃之间的温度下液化和/或融化；以及
-将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进心脏组织的形成。
所述明胶内部主体优选在25至40℃之间的温度、更优选在30至40℃之间的温度、更优选在35至37℃之间的温度、更优选在约37℃的温度下液化和/或融化。
所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液优选包含纤维蛋白原和凝血酶，其允许形成纤维蛋白网络，该纤维蛋白网络为所培养的细胞提供合适的支撑并且随后可以被降解，其优选被所培养的细胞所产生的金属蛋白酶降解，而不会不利地影响正在形成的细胞组织的结构和功能。
因此，一些实施方案提供了一种用于制备心脏类器官、优选为人类心脏类器官的方法，该方法包括以下步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为预定形状并具有外表面，其中所述内部主体由明胶制成；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中，其中，所述细胞存在于包含纤维蛋白原和凝血酶的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中；
-允许纤维蛋白原的聚合，从而形成支承细胞结构；
-使明胶内部主体在20至40℃之间的温度下液化和/或融化；以及
-将细胞置于温育条件下一段时间以促进心脏组织的形成。
一些实施方案提供了一种制备心脏类器官、优选人类心脏类器官的方法，其包括以下步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为预定形状并具有外表面，其中所述内部主体由明胶制成；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中，其中，所述细胞存在于包含纤维蛋白原和凝血酶的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中；
-允许纤维蛋白原的聚合，从而形成支承细胞结构；
-使明胶内部主体在20至40℃之间的温度下液化和/或融化；以及
-允许形成心脏类器官。
在一些实施方案中，根据本发明的方法的所述步骤是连续的步骤。
因此，还于此提供了根据本发明的模具用于制备中空3D细胞组织结构、优选为具有空腔的类器官的用途。在一些优选的实施方案中，所述模具用于仿真心脏的制备。因此，一些实施方案提供了根据本发明的模具用于制备心脏类器官的用途。所述心脏类器官优选地是人类心脏类器官。为了制备中空3D细胞组织结构，例如心脏类器官，优选提供细胞，特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到培养室。因此，进一步提供了以下用途：
-根据本发明的模具；和
-细胞，优选干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞；
用于制备中空3D细胞组织结构，优选为具有空腔的类器官，更优选为心脏类器官。
如上所述，所述细胞优选存在于包含增黏化合物和/或形成水凝胶的化合物的培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液中，以为细胞提供合适的支撑。在一些实施方案中，所述培养基、液体、胶状组合物或细胞悬液包含纤维蛋白原和凝血酶。为了制备心脏类器官，内部主体优选地具有心室状的形状或心房状的形状或心状的形状。在一些优选的实施方案中，内部主体由明胶制成，其可以在高于25℃的温度下降解。
还提供了根据本发明的模具，其已经和感兴趣的细胞一起提供。这种根据本发明的包含细胞的模具(在本文中也被称为根据本发明的生物反应器)使得可以形成中空的3D细胞组织结构，如具有空腔的类器官。
因此，进一步提供了一种生物反应器，该生物反应器包括：根据本发明的模具；以及细胞，其存在于所述模具的培养室中在外部主体的内表面与内部主体的外表面之间。一些实施方案提供了用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的生物反应器，该生物反应器包括：外部主体，其具有界定该外部主体中的空腔的内表面；内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体位于所述外部主体的空腔中，其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的培养室，并且其中，所述细胞存在于所述培养室中，该生物反应器的特征在于：所述内部主体以变形材料制成为预定形状，从而使得所述内部主体能够在不显著影响所形成的细胞结构和/或细胞组织的完整性的情况下降解。在一些实施方案中，本发明的生物反应器包括支撑装置，例如，支撑容器。如本文所述，该支撑装置被配置为在模具的内部主体和/或外部主体降解之后至少支撑3D细胞结构和/或细胞组织。
如本文之前所述，优选地，内部主体和外部主体均由变形材料制成。在一些实施方案中，内部主体和外部主体由不同的变形材料形成。
所述变形材料优选适于在以下情况下降解：在高于或低于温度阈值的情况下和/或在酶存在的情况下和/或在反应性化合物存在的情况下和/或通过超声处理的情况下和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下。在一些实施方案中，变形材料适于在10至50摄氏度之间、更特别地在25至40摄氏度之间的温度下降解。在一些实施方案中，变形材料在低于10摄氏度时基本上是固体，并且适于在高于10摄氏度时融化和/或液化，特别是在10至42摄氏度之间的温度下融化和/或液化。在一些实施方案中，变形材料在15摄氏度以上基本上是固体，并且适于在15摄氏度以下融化和/或液化。变形材料优选地包括明胶、特别是至少10％的明胶，和/或
Figure BDA0002753235360000141
F-127和/或聚(乙烯醇)(PVA)。
因此，一些特定的实施方案提供了一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的方法，该方法包括以下步骤，尤其是连续步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定该外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为可降解材质、呈预定形状并具有外表面；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供细胞，特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞到所述培养室中；
-在所述内部主体的外表面周围的培养室中，将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进支承细胞结构的形成，和/或将其置于温育条件下以促进细胞组织的形成；
-将所述可降解材质的内部主体置于使该可降解材料反应的条件下从而使该内部主体降解，以从所述空腔中除去该内部主体，而不显著影响所述培养室中已形成的支承细胞结构或细胞组织的完整性，并保持已形成的细胞结构或细胞组织的功能。在一些实施方案中，所述方法包括进一步的步骤，即允许形成中空3D组织。一些特定的实施方案提供了一种用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏的生物反应器，该生物反应器包括：外部主体，其具有界定该外部主体中的空腔的内表面；内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体定位于所述外部主体的空腔中，其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的培养室，并且其中，所述细胞存在于所述培养室中，该生物反应器的特征在于：所述内部主体以可降解材料制成为预定形状，从而使得所述内部主体能够在不显著影响所形成的细胞结构和/或细胞组织的完整性的情况下降解。
一些实施方案提供了根据本发明的方法或生物反应器，其中，所述可降解材料在以下情况下可降解：高于或低于温度阈值的情况下和/或在酶存在的情况下和/或在反应性化合物存在的情况下和/或通过超声处理的情况下和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下。一些实施方案提供了根据本发明的方法或生物反应器，其中，所述可降解材料在10至50摄氏度之间、优选在25至40摄氏度之间的温度下可降解。一些实施方案提供了根据本发明的方法或生物反应器，其中，可降解材料在低于摄氏10度时基本上是固体，并且在高于10摄氏度时融化和/或液化，优选在10至42摄氏度之间的温度下融化和/或液化。一些实施方案提供了根据本发明的方法或生物反应器，其中，可降解材料在高于15摄氏度时基本上是固体，并且在低于15摄氏度时融化和/或液化。一些实施方式提供了根据本发明的方法，其中，将所述内部主体置于使可降解材料反应的条件下的步骤包括通过温度变化来使所述内部主体液化和/或融化，优选地包括通过将温度从低于10摄氏度的起始温度升高到在10至40摄氏度之间的降解温度来使所述内部主体融化。一些实施方案提供了根据本发明的方法，其中，通过向所述内部主体供应液化剂或融化剂(优选为酶或化合物或组合物)来使所述内部主体液化和/或融化。一些实施方案提供了根据本发明的方法，其中，通过超声处理和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下使所述内部主体液化和/或融化。
在一些实施方案中，内部主体被制成不规则形状和/或任何其他期望的形状，特别是心室状或心房状或心状的形状。在一些实施方案中，外部主体包括至少一个与所述空腔流体连通的开口。外部主体优选地包括：第一开口，其通过用于将流体引导至所述空腔的第一导管与用于容纳的所述空腔间流体连通；以及第二开口，其通过用于将流体引导离开所述空腔的第二导管与用于容纳的所述空腔间流体连通。在一些实施方案中，外部主体包括入口壁，其中，所述第一开口和所述第二开口均设置在所述入口壁中。
还提供了通过根据本发明的方法获得或可获得的中空3D细胞组织结构。所述中空3D细胞组织结构优选为类器官，更优选为具有空腔的类器官，诸如，例如心脏类器官、肾类器官、肺类器官、消化道类器官、膀胱类器官或眼类器官。在一些优选的实施方案中，所述类器官是人类心脏类器官。
通过根据本发明的方法制造的类器官还可用于药物研发。例如，利用根据本发明的方法，可以制造这样的心脏类器官：其严格地模拟了(人类)心脏的空腔(心房和/或心室)并且能够泵送流体，因此是药物研发的优选工具。
根据本发明的类器官的其他应用在再生医学领域。可以使用根据本发明的方法在体外制备类器官。随后，可以将这样的类器官或其一部分植入个体中。使用由给定个体的细胞制备的类器官组织大大减少了器官移植排斥的可能性。
在下文中，通过构成本申请的一部分的附图和相应的实施方案进一步阐明本发明的这些和其他的目的和方面。除非清晰明确地指明，否则附图无论如何也不构成对本发明范围的限制。在附图中：
图1A至图1F示出了根据本发明的模具和生物反应器的制备实施方案的连续步骤。
在本申请中，相似或相应的特征由相似或相应的附图标记表示。对各种实施方案的描述不限于附图中示出的示例，并且在详细描述和权利要求书中所使用的附图标记不旨在对实施方案的描述加以限制，而是通过参考附图中示出的示例来将其加入以阐明该实施方案。
在如图1所示的实施方案中，本发明涉及一种模具，该模具包括处于外部主体的空腔内的内部主体，如下所述来形成该模具。在第一步中，采用生物相容性树脂将内模(00)3D打印成期望的预定形状，在本文中为具有单独的入口通道和出口通道的人类仿真心脏的形状。如图1A所示，内模(00)用于以聚二甲基硅氧烷来铸造内模(00)的阴模(03)。然后例如通过使用锋利的刀片将阴模(03)切成两半(未示出)，从而使得可以从阴模(03)的内部移除内模(00)。接下来，阴模(03)的两半被再次耦接在一起以形成具有由所移除的内模(00)形成的空腔的阴模(03)。阴模(03)的两半可以被紧密地夹紧在一起，以使空腔至少基本上是不透液体的，从而避免被引入到空腔中的液体泄漏。由于内模(00)包括相应的入口出口通道，所以经由在阴模(03)中形成的每个入口空间和出口空间插入玻璃毛细管(02)。每个玻璃毛细管的一端延伸到阴模(03)的人类心形的空腔中。
将明胶(Sigma-Aldrich)以10％(w/v)溶解在PBS或培养基中，并在120摄氏度下高压灭菌。将明胶溶液储存在4摄氏度下。将所储存的明胶溶液加热至37摄氏度，并通过一根玻璃毛细管(02)将其移液到阴模(03)中，直到阴模(03)的空腔中填满明胶。将填充有明胶的阴模(03)冷却至4摄氏度，以使明胶胶凝。如图1B所示，胶凝后的明胶形成了根据本发明的模具的人类心形的内部主体(07)。
在下一步骤中，使用生物相容性树脂将外模(01)3D打印成与内模(00)相对应但尺寸更大的形状。如图1C所示，外模(01)用于以聚二甲基硅氧烷来铸造外模(01)的外部阴模(04)。然后，例如使用锋利的刀片(未示出)将外部阴模(04)切成两半。这使得可以从外部阴模(04)的内部移除外模(01)。可选地，可以使外模(01)保留在切割后的部分阴模(04)之内。然而，将阴模(04)的底部与阴模(04)的顶部分开。然后，如图1D所示，将阴模(04)的顶部与外模(01)一起(或者可选地单独地将外模(01))放置在由支撑装置(即支撑容器(05))限定的空腔内，并且由于阴模(04)的顶部紧紧地安装在容器(05)上，因此容器(05)中的空腔相对于外部环境密封。独立于内部主体(07)和/或组织的入口/出口，容器(05)包含一对入口/出口套管进入容器的内部。
为了制备外部主体，将先前所述的储存的明胶溶液加热到37摄氏度，并通过入口/出口套管将其引入容器(05)的空腔中未被外模(01)占据的剩余的空闲空间。将容器(05)、阴模(04)的顶部、外模(01)与引入的明胶的组件冷却至4摄氏度，以使明胶胶凝。明胶凝胶化后，将阴模(04)的顶部部分和外模(01)从容器(05)中移除，从而将根据本发明的模具的明胶外部主体(06)留在容器(05)内。
接下来从阴模(04)的顶部部分去除外模(01)。在阴模(04)上制作另外一对从外表面到空腔表面的入口和出口。
接下来，打开阴模(03)，并移除明胶材质的固体内部主体(07)以及入口和出口毛细管。然后将内部主体(07)部分地放置在容器(05)中由外部主体(06)限定的空间中，并利用入口和出口毛细管将其适当地校正。如图1E所示，由此将外部主体(06)与内部主体(07)一起在容器(05)内定位。通过外部主体(06)和内部主体(07)的完美匹配，可以进行适当地校正，从而在内部主体(07)的外表面和外部主体(06)的内表面之间形成均匀的间隙。
跳动心肌细胞制备如下。在E8培养基(Life Technologies)中在Vitronectin重组人蛋白(Life Technologies)涂覆的塑料板上培养来自体外细胞培养或可商购来源的人类胚胎干细胞(hESC)和/或人类诱导性多能干细胞(hiPSC)。hESC和hiPSC使用含有EDTA0.5mM(Life Technologies)或TryplE(Gibco)的PBS(Life Technologies)来进行传代。
如先前所述(Elliott等，2011；(van den Berg，Elliott，Braam，Mummery，&Davis，2016)，以单层法来诱导分化为心脏谱系。简而言之，在分化前一天(第-1天)将25×103/cm2接种在用75μg/mL(生长因子降低的)基质胶(Corning)涂覆的板上。在第0天，通过将E8换成补充了细胞因子混合物(20ng/mL BMP4，R&D Systems；20ng/mL ACTIVIN A，MiltenyiBiotec；1.5μM GSK3抑制剂CHIR99021，Axon Medchem)的BPEL培养基(牛血清白蛋白[BSA]聚乙烯醇必需脂质；(Ng等人，2008))来诱导产生心脏的中胚层。3天后，去除细胞因子并加入Wnt抑制剂(5μM，XAV939，Tocris Bioscience)持续3天。BPEL介质每3-4天更新一次。
为了生成心脏组织，使用TryplE 1x来解离跳动心肌细胞10分钟，然后将其重悬在含10％血清的细胞培养基中(例如含10％胎牛血清的1x DMEM)。
将重悬后的细胞与2至5mg/ml牛纤维蛋白原(储备液：200mg/ml以上的抑肽酶0.5μg/mg的纤维蛋白原在NaCl 0.9％中，Sigma F4753)、100μl/ml基质胶(BD Bioscience356235)混合到终密度为5x106至20x106细胞/ml。按照1:300向最终混合物中添加凝血酶(100U/ml，Sigma Aldrich T7513)，使其良好地重悬，然后利用存在于阴模(04)上的入口将全部溶液移液到内部主体(07)和外部主体(06)之间的间隙中。如图1F所示，包括容器(05)加上模具的内部主体和外部主体以及细胞悬液的如上所形成的生物反应器在随后的过程中被保持在4摄氏度。用塞子封闭入口，并将生物反应器在冰箱中放置30分钟，以使纤维蛋白原聚合。
纤维蛋白原聚合后，将生物反应器转移到37摄氏度、5％CO2增湿的细胞培养温育箱中，以通过使明胶熔化来使内部主体(07)和外部主体(06)降解。明胶融化后，由细胞和纤维蛋白原组成的独立的组织被保留在生物反应器内部。用培养基以每分钟100ul的流速灌注组织内部10分钟。因此，通过用培养基冲洗组织的内部空腔来去除明胶。此外，组织的入口和出口是封闭的，并且经由容器(05)上存在的入口/出口套管以每小时100ul的流速来灌注培养基。在制成后3到4天，组织开始收缩。
尽管当前申请可以将特征描述为相同实施方案的一部分或不同实施方案的一部分，但是本发明的范围还包括这样的实施方案，其包含本文所述的全部或部分特征的任意组合。
如本文所使用的，术语“特别的”、“特别地”和“优选地”可互换使用。
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Claims (23)

1.一种模具，其用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏，包括：外部主体，其具有界定所述外部主体中的空腔的内表面；内部主体，其具有外表面，其中，所述内部主体定位于所述外部主体的空腔中，其中，所述外部主体的内表面和所述内部主体的外表面围成了在二者之间的用于在其中容纳细胞的培养室，所述模具特征在于：所述内部主体由变形材料制成为预定形状，从而使得所述内部主体能够在不显著影响所形成的细胞结构和/或细胞组织的完整性的情况下得以降解。
2.根据权利要求1所述的模具，其特征在于：所述内部主体和所述外部主体由变形材料制成。
3.根据权利要求2所述的模具，其特征在于：所述内部主体和所述外部主体由不同的变形材料形成。
4.根据权利要求3所述的模具，其特征在于：所述变形材料包括：明胶、特别是至少10％的明胶，和/或
Figure FDA0002753235350000011
F-127和/或聚乙烯醇(PVA)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的模具，其特征在于：所述变形材料适合于在以下情况下降解：在高于或低于温度阈值的情况下和/或在酶存在的情况下和/或在反应性的化合物存在的情况下和/或通过超声处理的情况下和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下。
6.根据权利要求5所述的模具，其特征在于：所述变形材料适合于在10至50摄氏度之间、更特别地在25至40摄氏度之间的温度下降解。
7.根据前述权利要求中任一项所述的模具，其特征在于：所述变形材料在低于10摄氏度时基本上是固态的，并且适合于在高于10摄氏度时融化和/或液化，特别是在10至42摄氏度之间的温度下融化和/或液化。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的模具，其特征在于：所述变形材料在高于15摄氏度时基本上是固态的，并且适合于在低于15摄氏度时融化和/或液化。
9.根据前述权利要求中任一项所述的模具，其特征在于：所述内部主体被制成不规则形状和/或任何其他所需的形状，特别是心室状或心房状或心状的形状。
10.根据前述权利要求中任一项所述的模具，其特征在于：所述外部主体包括至少一个与所述空腔流体连通的开口。
11.根据权利要求10所述的模具，其特征在于：所述外部主体包括：第一开口，其通过用于将流体引导至所述空腔的第一导管与用于容纳的所述空腔间流体连通；以及第二开口，其通过将流体引导离开所述空腔的第二导管与用于容纳的所述空腔间流体连通。
12.根据权利要求11所述的模具，其特征在于：所述外部主体包括入口壁，所述第一开口和第二开口均设置在所述入口壁中。
13.一种方法，其用于制备中空3D细胞组织结构如类器官、特别是人类仿真心脏，其包括以下步骤、特别是如下连续步骤：
-制备外部主体，所述外部主体具有界定所述外部主体中的空腔的内表面；
-制备内部主体，所述内部主体为变形材质、呈预定形状并具有外表面；
-将所述内部主体放置在所述外部主体的所述空腔内，其中，所述内表面和所述外表面围成了在二者之间的培养室；
-提供细胞，特别是干细胞、祖细胞、心肌细胞和/或其他心脏细胞，到所述培养室中；
-在所述内部主体的外表面周围的培养室中，将所述细胞置于温育条件下一段时间以促进支承细胞结构的形成，和/或将所述细胞置于温育条件下以促进细胞组织的形成；
-将所述变形材质的内部主体置于使该变形材料反应的条件下从而使所述内部主体降解，以从所述空腔中除去所述内部主体，而不显著影响在培养室中形成的支承细胞结构或细胞组织的完整性，并保持所述支承细胞结构或细胞组织的功能。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述将所述内部主体置于使所述变形材料反应的条件下的步骤包括：通过温度变化来使所述内部主体液化和/或融化，特别是包括通过将温度从低于10摄氏度的起始温度升高到10至40摄氏度间的降解温度来使所述内部主体融化。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，通过向所述内部主体供应液化剂或融化剂来使所述内部主体液化和/或融化。
16.根据权利要求15的方法，其中，所述液化剂或融化剂包括酶或化合物或组合物。
17.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，通过超声处理和/或在波长大于或小于阈值的光存在的情况下使所述内部主体液化和/或融化。
18.根据权利要求13至17中的任一项所述的方法，其中，所述提供细胞到所述培养室中的步骤包括：将细胞提供到所述外部主体的空腔中，然后将所述内部主体放置在所述外部主体的空腔内，从而将所述细胞置于在所述培养室中。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中，所述外部主体的制备包括：制备所述外部主体的第一部分，其包括所述空腔的第一区；制备所述外部主体的单独的第二部分，其包括所述空腔的第二区；将所述第一部分和所述第二部分彼此耦接，使得所述空腔的第一区和所述空腔的第二区彼此连通，从而形成所述空腔。
20.根据权利要求1至12中任一项所述的模具在制备中空3D细胞组织结构、优选为具有空腔的类器官中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述类器官为心脏类器官，优选为人类心脏类器官。
22.一种生物反应器，其包括：
-根据权利要求1至12中任一项所述的模具；和
-细胞，其存在于所述模具中位于外部主体的内表面与内部主体的外表面之间的培养室中。
23.通过根据权利要求13至19中任一项所述的方法能够获得的中空3D细胞组织结构。
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