CN110885782B - 一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法 - Google Patents

一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，该方法主要包括以下步骤：孔板修饰与人多能干细胞(hPSC)接种培养、细胞消化并接种于三维基质中、人羊膜腔发育模型的建立等步骤，本发明利用hPSC的自组装性质在三维基质材料中形成了具有近生理的三维空腔结构，这些空腔也具有了羊膜腔早期、中期功能的表达特点。该方法具有简单易操作、诱导效率高、重复性强等特点。该模型的建立可为探索人类羊膜发生在细胞水平和分子机制研究领域提供平台，在羊膜腔的形成与发育过程中的表观遗传学的研究中也具有极大的应用价值。

Description

一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法
技术领域
本发明涉及胚胎发育学，组织仿生以及细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法。
背景技术
上皮腔的形成，如囊肿和小管，是许多组织和器官正常发育的必要过程，包括内脏、肝脏、肾脏、血管、肺。在人胚胎发生过程中多能上皮细胞会形成囊胚腔，植入后形成具有极化的鳞状上皮的羊膜腔。尽管具有基本和临床意义，但由于对早期人类胚胎的研究太少，以及人类与其他常用的动物和细胞模型在形态发生方面存在明显分歧，这种胚胎外组织在人类体内的发育仍是一个谜。目前，体外研究人类胚胎发生的工作取得了一些进展，但胚胎外组织(如羊膜上皮细胞)的发育仍不甚清楚。
人多能干细胞(hPSCs)已被诱导成与胚胎中的上皮细胞类似的多能状态，已成功应用于人类胚胎发育模型。研究表明，hPSCs具有在细胞外基质(ECM)内形成腔的内在生物学特性。一个多能干细胞球能够自我组装成极化的上皮细胞。由于在哺乳动物早期发育中腔的形成是不可缺少的，因此hPSCs可以提出一个简单而有用的模型来探索这一过程。然而，囊状结构可以维持时间较短，5天内会内迅速形成单层细胞结构。在整个过程中，hPSCs多能干性基因的表达在大多数研究中仍然保持，短期培养可能限制体外hiPSC囊肿的形态发生。
现有文章的报道，羊膜腔的发育是一个静态的过程，而这与体内三维物理微环境是不相符合的，即体内羊膜腔的发育是依赖于母体血浆和羊水，是一个动态的物理环境。所以说，在体外研究羊膜腔的发育是需要考虑到流体条件的。器官芯片作为细胞培养载体，不仅可以实现通道结构尺寸的灵活设计，而且能在三维环境中模拟细胞微环境的关键因素，包括流体流动、信息交互、生化信号等等。流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换，减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象，为细胞培养提供良好的生存环境。结合微流控技术不仅能解决现有设备存在体系复杂和营养物质运输欠缺的问题，还可进行细胞的实时监测和观察。但是目前将微流控与羊膜腔发育相结合尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法。结合微流控灌流系统的优势通过三维细胞培养和流体控制等要素，模拟体内羊膜腔形成及发育的细胞微环境，不仅研究了3D基质中羊膜腔的发育情况，并实现长期培养，还保证了充分的营养物质和氧气的交换，并具有高通量、低成本、易操作、可原位示踪与监测的特点。这一方法构建的模型具有近生理的三维腔结构，包括极性与非极性羊膜腔结构。该模型可为探索人类羊膜发生和胚胎发生在细胞水平和分子机制研究中提供了一个技术支撑。
本发明提供了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：器官芯片的制备、孔板修饰与人多能干细胞接种培养、羊膜腔在器官芯片中的发育。
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口、左侧灌流通道、左侧培养液出口组成，右侧结构由右侧培养液入口、右侧灌流通道、右侧培养液出口组成，中间结构由灌3D基质入口和灌3D基质通道组成，其中灌3D基质通道由灌3D基质纵向通道和灌3D基质横向通道组成；
液体由左侧培养液入口进入后通过左侧灌流通道，再由左侧培养液出口流出，或者液体由右侧培养液入口进入后通过右侧灌流通道，再由右侧培养液出口流出，左侧灌流通道与右侧灌流通道通过灌3D基质横向通道相连通。
所述器官芯片左侧灌流通道(2)和右侧灌流通道(5)宽度范围为500μm-5mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质纵向通道宽度范围为1mm-10mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质横向通道宽范围均为100μm-800μm，灌3D基质横向通道间距范围为100μm-800μm，高度范围为500μm-1.3mm。
所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
本发明提供的一种器官芯片，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，60℃-95℃烘5-20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20-90s进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
本发明孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱4小时-7天，之后放入37°培养箱20-50min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心1-3min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1-4h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。
所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释500-1000倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱4小时-7天；
所述含Y27632的mTeSR1培养基中，Y27632的浓度范围为1-10mM。
本发明提供的羊膜在器官芯片中的发育，具体步骤为：
(1)细胞消化并接种于三维基质中
待hPSC细胞生长为70％-90％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r 1-3min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置20-40min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；
所述mTeSR1培养基成分均为：体积浓度79％的mTeSR1基础培养基、体积浓度19％的mTeSR1 5x Supplement、体积浓度0.002％的Plasmocin prophylactic、体积浓度0.998％的双抗、体积浓度1％的Gentamicin/Amphotericin B。
所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比范围为0：1-3:1，细胞接种密度范围为1×104-1×1010cells/ml。
(2)人羊膜腔发育模型的建立
接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，在灌流管内填充了mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体可从左侧培养液处口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节。细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。
所述灌流体系中流体流速为10-500μl/h；所述模型建立时间范围为10-25天。
所述该模型用于细胞功能的表征，包括hPSC细胞向羊膜细胞分化情况、羊膜早期及羊膜中期细胞等的表征。
本发明利用hPSC的自组装性质在三维基质材料中形成了具有近生理的三维空腔结构，这些空腔也具有了羊膜腔早期、中期功能的表达特点。该方法具有简单易操作、诱导效率高、重复性强等特点。该模型的建立可为探索人类羊膜发生在细胞水平和分子机制研究领域提供平台，在羊膜腔的形成与发育过程中的表观遗传学的研究中也具有极大的应用价值。
附图说明
图1是器官芯片结构示意图。其中：1为左侧培养液入口、2为左侧灌流通道、3为左侧培养液出口、4为右侧培养液入口、5为右侧灌流通道、6为右侧培养液出口、7为灌3D基质入口、8为灌3D基质通道、9为灌3D基质纵向通道、10为灌3D基质横向通道。
图2是本发明构建的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法示意图。其中，图a表示体内多功能外胚层在胚胎植入前和植入后羊膜腔的形成示意图。图b-图e表示在器官芯片上结合灌流体系的流体作用下，hPSC来源的羊膜腔的形成。其中图d和图e是图c中器官芯片白色虚线处的截面图。
图3是本发明hPSCs在三维基质中腔结构形成的明场跟踪图及结构表征图。其中，图a是羊膜腔形成的明场跟踪图，图b是同一羊膜腔的明场跟踪图，图c是随培养天数D1、D3、D5、D7、D9的增加腔体总体尺寸的变化统计图，图d是随培养天数D1、D3、D5、D7、D9的增加腔壁厚度尺寸的变化统计图，图e是细胞形态尺寸的变化统计图。图g是静态和灌流体系下D1、D5、D10细胞死活图。图h是与图g相对应的随培养时间的增加死细胞率的统计图。
图4是本发明hPSCs在三维基质形成的腔中hPSCs干性功能丧失的表征。其中，图a-c分别是hPSC干性基因OCT4和SOX2在D1、D5、D10的表达图，图d和图e分别是hPSC干性基因OCT4在D5和D10的表达图，f-g是OCT4、NANOG、CDH1、CLND6基因在D1、D5、D10的PCR结果图。
图5是本发明hPSCs在三维基质形成的腔中囊性上皮组织在分子水平的功能表征。其中，图a-d分别为ITGB6、VTCN1、MUC16、GABRP、POSTN、HAND1、KRT17、KRT24、AQP1基因在D1、D5、D10的PCR结果图。图e为羊膜早期在D10天marker基因GATA3基因的表达图。图f为CDX2基因在D2和D4天的免疫荧光图。图g为羊膜中期在D15和D20天marker基因KRT24基因的免疫荧光图。
图6是本发明hPSCs在三维基质形成的极性羊膜腔功能表征。其中，图a为D3天的极性结构明场图。图b为OCT4的表达结果图。图c为D15天极性羊膜腔结构羊膜早期marker基因GATA3基因的表达结果图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
器官芯片上羊膜腔发育模型建立。
本发明提供了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：器官芯片的制备、孔板修饰与人多能干细胞接种培养、羊膜腔在器官芯片中的发育。
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口1、左侧灌流通道2、左侧培养液出口3组成，右侧结构由右侧培养液入口4、右侧灌流通道5、右侧培养液出口6组成，中间结构由灌3D基质入口7和灌3D基质通道8组成，其中灌3D基质通道8由灌3D基质纵向通道9和灌3D基质横向通道10组成；
液体由左侧培养液入口1进入后通过左侧灌流通道2，再由左侧培养液出口3流出，或者液体由右侧培养液入口4进入后通过右侧灌流通道5，再由右侧培养液出口6流出，左侧灌流通道2与右侧灌流通道5通过灌3D基质横向通道10相连通。
所述器官芯片左侧灌流通道和右侧灌流通道宽度为1.2mm、高度为1mm，灌3D基质纵向通道宽度为1mm、高度为1mm，灌3D基质横向通道宽度为300μm，间距为300μm，高度为1mm。
所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
本发明提供的一种器官芯片，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，60℃烘20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用，以上所述器官芯片整体示意图如图1所示。
本发明孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱20min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心2min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。
所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释1000倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱4小时；
所述含Y27632的mTeSR1培养基中，Y27632的浓度为10mM。
本发明提供的羊膜腔在器官芯片中的发育，具体步骤为：
(1)细胞消化并接种于三维基质中
待hPSC细胞生长为85％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r2min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置20min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；
所述mTeSR1培养基成分均为：体积浓度79％的mTeSR1基础培养基、体积浓度19％的mTeSR1 5x Supplement、体积浓度0.002％的Plasmocin prophylactic、体积浓度0.998％的双抗、体积浓度1％的Gentamicin/Amphotericin B。
所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为0:1，细胞接种密度为1×106cells/ml。
(2)人羊膜腔发育模型的建立
接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，所述器官芯片集成了灌流体系，灌流管内填充了mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体可从左侧培养液处口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。
所述灌流体系中流体流速为20μl/h，所述模型建立时间为20天。按以模型建立的方法示意图如图2所示。图3是本案例hPSCs在三维基质中腔结构形成的明场跟踪图及结构表征图。从明场跟踪图a和图b以及图c-e可见是随培养天数D1、D3、D5、D7、D9的增加腔体总体尺寸与D1天的尺寸相比有显著增大的现象，腔壁厚度尺寸有明显变薄的现象，瞎报的形态在D1和D5发生了明显的排布变化，即细胞有明显拉伸生长。从图g显示随培养时间的增加灌流体系下死细胞率明显比静态条件下逆流体系能构建较好的细胞3D体系流体微环境。如图4所示本发明hPSCs在三维基质形成的腔中hPSCs干性功能逐渐丧失。从图5是可见羊膜早期、中期的基因在不同时间有所表达，说明在此3D基质中构建的人羊膜腔发育模型是成功的，且功能表达较好。
实施例2
器官芯片上羊膜腔发育模型中羊膜极性结构的表征。
本发明提供了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：器官芯片的制备、孔板修饰与人多能干细胞接种培养、羊膜腔在器官芯片中的发育。
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口1、左侧灌流通道2、左侧培养液出口3组成，右侧结构由右侧培养液入口4、右侧灌流通道5、右侧培养液出口6组成，中间结构由灌3D基质入口7和灌3D基质通道8组成，其中灌3D基质通道8由灌3D基质纵向通道9和灌3D基质横向通道10组成；
液体由左侧培养液入口1进入后通过左侧灌流通道2，再由左侧培养液出口3流出，或者液体由右侧培养液入口4进入后通过右侧灌流通道5，再由右侧培养液出口6流出，左侧灌流通道2与右侧灌流通道5通过灌3D基质横向通道10相连通。
所述器官芯片左侧灌流通道和右侧灌流通道宽度为1.2mm、高度为1mm，灌3D基质纵向通道宽度为1mm、高度为1mm，灌3D基质横向通道宽度为300μm，间距为300μm，高度为1mm。
所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
本发明提供的一种器官芯片，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，60℃烘20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用，以上所述器官芯片整体示意图如图1所示。
本发明孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱20min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心2min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。
所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释1000倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱4小时；
所述含Y27632的mTeSR1培养基中，Y27632的浓度为10mM。
本发明提供的羊膜腔在器官芯片中的发育，具体步骤为：
(1)细胞消化并接种于三维基质中
待hPSC细胞生长为85％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r2min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置20min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；
所述mTeSR1培养基成分均为：体积浓度79％的mTeSR1基础培养基、体积浓度19％的mTeSR1 5x Supplement、体积浓度0.002％的Plasmocin prophylactic、体积浓度0.998％的双抗、体积浓度1％的Gentamicin/Amphotericin B。
所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为0:1，细胞接种密度为1×106cells/ml。
(2)人羊膜腔发育模型的建立
接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，
所述器官芯片集成了灌流体系，灌流管内填充了mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体可从左侧培养液处口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节。
细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。所述灌流体系中流体流速为20μl/h，所述模型建立时间为20天。按以模型建立的方法示意图如图2所示。羊膜腔非极性结构的功能表征结果与实施例1中结果相同，对于极性结构的表征，如图6，从图a可见细胞排布出现极性腔的结构，通过常规的免疫荧光步骤表征后发现D5天hPSC干性基因OCT4出现部分表达的结果，其中外环为不表达内细胞团为阳性表达，或者单细胞侧OCT4不表达，多细胞侧为阳性表达，这些都能说明羊膜腔的形成中出现的近生理的极性结构。进一步对羊膜早期GATA3基因的表达检测得出在D15天极性结构中单细胞侧GATA3部分表达，而多细胞侧细胞不表达，说明但细胞侧细胞分化较另一侧成熟。
在这里，我们采用了一种工程的方法，允许hiPSC在matrigel三维支架内以高通量方式自组装，从细胞聚集到极化的鳞状上皮细胞的形成。这些3D囊肿具有伸长分化的细胞和妊娠期间羊膜腔的marker基因的表达。故，此发明有望应用于人类羊膜发育和胚胎发生的基础研究，以及预测和治疗妊娠疾病。
实施例3
器官芯片制备。
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口1、左侧灌流通道2、左侧培养液出口3组成，右侧结构由右侧培养液入口4、右侧灌流通道5、右侧培养液出口6组成，中间结构由灌3D基质入口7和灌3D基质通道8组成，其中灌3D基质通道8由灌3D基质纵向通道9和灌3D基质横向通道10组成；
液体由左侧培养液入口1进入后通过左侧灌流通道2，再由左侧培养液出口3流出，或者液体由右侧培养液入口4进入后通过右侧灌流通道5，再由右侧培养液出口6流出，左侧灌流通道2与右侧灌流通道5通过灌3D基质横向通道10相连通。
所述器官芯片左侧灌流通道和右侧灌流通道宽度为5mm、高度为500μm，灌3D基质纵向通道宽度为5mm、高度为500μm，灌3D基质横向通道宽度为800μm，间距为300μm，高度为500μm。
所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
本发明提供的一种器官芯片，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，75℃烘20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理60s进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
实施例4
器官芯片上羊膜腔发育模型建立。
本发明提供了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：器官芯片的制备、孔板修饰与人多能干细胞接种培养、羊膜腔在器官芯片中的发育。
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口1、左侧灌流通道2、左侧培养液出口3组成，右侧结构由右侧培养液入口4、右侧灌流通道5、右侧培养液出口6组成，中间结构由灌3D基质入口7和灌3D基质通道8组成，其中灌3D基质通道8由灌3D基质纵向通道9和灌3D基质横向通道10组成；
液体由左侧培养液入口1进入后通过左侧灌流通道2，再由左侧培养液出口3流出，或者液体由右侧培养液入口4进入后通过右侧灌流通道5，再由右侧培养液出口6流出，左侧灌流通道2与右侧灌流通道5通过灌3D基质横向通道10相连通。
所述器官芯片左侧灌流通道和右侧灌流通道宽度为500μm、高度为700μm，灌3D基质纵向通道宽度为8mm、高度为700μm，灌3D基质横向通道宽度为800μm，间距为800μm，高度为700μm
所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
本发明提供的一种器官芯片，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，95℃烘5min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理90s进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
本发明孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱50min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心3min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养4h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。
所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释800倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱7天；
所述含Y27632的mTeSR1培养基中，Y27632的浓度为1mM。
本发明提供的羊膜腔在器官芯片中的发育，具体步骤为：
(1)细胞消化并接种于三维基质中
待hPSC细胞生长为80％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r3min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置40min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；
所述mTeSR1培养基成分均为：体积浓度79％的mTeSR1基础培养基、体积浓度19％的mTeSR1 5x Supplement、体积浓度0.002％的Plasmocin prophylactic、体积浓度0.998％的双抗、体积浓度1％的Gentamicin/Amphotericin B。
所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为1:1，细胞接种密度为1×1010cells/ml。
(2)人羊膜腔发育模型的建立
接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，
所述器官芯片集成了灌流体系，灌流管内填充了mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体可从左侧培养液处口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节。
细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。
所述灌流体系中流体流速为200μl/h，所述模型建立时间范围为10天。对hPSCs在三维基质中腔结构形成的明场跟踪图及结构表征图与实例1中相类似。对羊膜腔D25天的功能的表征结果与实例1中类似。在以上条件下，均能建立人羊膜腔发育模型。

Claims (11)

1.一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,该模型的构建方法的主要步骤为：
(1)器官芯片的制备；
(2)孔板修饰与人多能干细胞接种培养；
(3)羊膜腔在器官芯片中的发育；
所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口(1)、左侧灌流通道(2)、左侧培养液出口(3)组成，右侧结构由右侧培养液入口(4)、右侧灌流通道(5)、右侧培养液出口(6)组成，中间结构由灌3D基质入口(7)和灌3D基质通道(8)组成，其中灌3D基质通道(8)由灌3D基质纵向通道(9)和灌3D基质横向通道(10)组成；
液体由左侧培养液入口(1)进入后通过左侧灌流通道(2)，再由左侧培养液出口(3)流出，或者液体由右侧培养液入口(4)进入后通过右侧灌流通道(5)，再由右侧培养液出口(6)流出，左侧灌流通道(2)与右侧灌流通道(5)通过灌3D基质横向通道(10)相连通；
所述器官芯片左侧灌流通道(2)和右侧灌流通道(5)宽度范围为500μm-5mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质纵向通道(9)宽度范围为1mm-10mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质横向通道(10)宽范围均为100μm-800μm，灌3D基质横向通道(10)间距范围为100μm-800μm，高度范围为500μm-1.3mm；
步骤(3)羊膜腔在器官芯片中的发育，具体步骤为：
(1)细胞消化并接种于三维基质中
待hPSC细胞生长为70％-90％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1-3min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置20-40min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；
(2)人羊膜腔发育模型的建立
接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，将灌流管内填充mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体从左侧培养液出口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节；细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。
2.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
3.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(1)器官芯片的制备，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，60℃-95℃烘5-20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20-90s进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
4.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(2)孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱4小时-7天，之后放入37°培养箱20-50min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心1-3min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1-4h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。
5.按照权利要求4所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(2)所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释500-1000倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱4小时-7天。
6.按照权利要求4所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(2)所述含Y27632的mTeSR1培养基中，Y27632的浓度范围为1-10mM。
7.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于步骤(1)所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比范围为0-3:1，细胞接种密度范围为1×104-1×1010cells/ml。
8.按照权利要求1或4所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于所述mTeSR1培养基成分为：体积浓度79％的mTeSR1基础培养基、体积浓度19％的mTeSR1 5x Supplement、体积浓度0.002％的Plasmocin prophylactic、体积浓度0.998％的双抗、体积浓度1％的Gentamicin/Amphotericin B。
9.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于步骤(2)所述灌流体系中流体流速为10-500μl/h。
10.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于步骤(2)所述模型建立时间范围为10-25天。
11.按照权利要求1所建立的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型的应用，其特征在于：该模型可用于细胞功能的表征，包括hPSC细胞向羊膜细胞分化情况、羊膜早期及羊膜中期细胞等的表征。
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