WO2014142161A1 - 細胞培養容器、細胞培養装置、及び細胞培養方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞培養装置、及び細胞培養方法 Download PDF

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WO2014142161A1
WO2014142161A1 PCT/JP2014/056460 JP2014056460W WO2014142161A1 WO 2014142161 A1 WO2014142161 A1 WO 2014142161A1 JP 2014056460 W JP2014056460 W JP 2014056460W WO 2014142161 A1 WO2014142161 A1 WO 2014142161A1
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cell
cell culture
cells
culture container
well
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PCT/JP2014/056460
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French (fr)
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成則 尾▲崎▼
慎一 五味
智瑛 倉員
大島　康弘
慎治 杉浦
琢 佐藤
公雄 須丸
敏幸 金森
Original Assignee
東京エレクトロン株式会社
独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture container, and a cell culture apparatus and a cell culture method using the same.
  • human ES cells human embryonic stem cells
  • human iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • Human organs are composed of tens of billions to hundreds of billions of cells, and are suitable from human pluripotent cells and human pluripotent cells such as human ES cells and human iPS cells for the purpose of regenerative medicine.
  • human pluripotent cells such as human ES cells and human iPS cells
  • ES cells ES cells
  • iPS cells human iPS cells
  • a human pluripotent cell culture method is a colony-forming culture in which cell culture is performed on embryonic fibroblasts used as feeder cells seeded on a dish coated with gelatin or the like to form colonies.
  • the law was adopted. In the process of culturing cells in large quantities, it is necessary to perform subculture over a long period of time. Therefore, in the colony-forming culture method, a colony having a certain size is crushed into a clamp of an appropriate size by an operation such as enzyme treatment or pipetting, and the cells are seeded again on the feeder cells. It was necessary to repeat the operation of forming.
  • feederless culture method for culturing human ES cells or human iPS cells without using feeder cells has also been adopted.
  • the feeder-less culturing method is extremely excellent in terms of safety and the like when considering application to regenerative medicine in that it is not necessary to prepare feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts at the time of culturing.
  • the state of the formed colony is largely related to the size of the clamp at the time of sowing. If there is a large variation in the size of the clamp, naturally there will be a large variation in the size of the adhered colonies, and there is a report that the difference in the size of the clamp affects the cell differentiation ability (see Non-Patent Document 3). Appropriate control of the size of cells is an important factor for growing cells while maintaining the undifferentiated state of the cells.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of culturing a large amount of cells while maintaining the undifferentiated state of the cells, as well as a cell culture apparatus and a cell culture using the same. It is an object to provide a method.
  • the present invention provides a cell culture container, a cell culture apparatus, and a cell culture method having the following characteristics.
  • a cell culture container comprising a plate provided with a well and a cell culture substrate having a cell adhesive surface on one surface, wherein the opening surface of the well and the cell adhesive surface face each other The cell culture container, wherein the plate and the cell culture substrate are arranged.
  • the shape of the well is an inverted pyramid type (square pyramid), an inverted polygonal pyramid, or an inverted conical shape.
  • a cell culture apparatus comprising the cell culture container of any one of (1) to (11).
  • the cell culture method according to any one of (13) to (16), wherein the cell is a human iPS cell or a human ES cell.
  • FIG. 1-1 is a front view as a schematic diagram showing an embodiment of the cell culture container of the present invention.
  • FIG. 1-2 is a side sectional view as a schematic view showing an embodiment of the cell culture container of the present invention.
  • FIG. 1-3 is an enlarged view as a schematic view showing an embodiment of the cell culture container of the present invention.
  • FIG. 2 is a side sectional view of the cell culture container of the present embodiment, which is shown upside down from the sectional view of FIG. 1-2.
  • FIG. 3-1 is a diagram showing a process from when cells introduced into a cell culture tank form a cell clump to proliferate and are collected.
  • FIG. 3-1 is a diagram showing a process from when cells introduced into a cell culture tank form a cell clump to proliferate and are collected.
  • FIG. 3-2 is a diagram showing a process until cells introduced into the cell culture tank are recovered after forming a cell clump and proliferating.
  • FIG. 3-3 is a diagram showing a process until cells introduced into the cell culture tank are recovered after forming a cell clump and proliferating.
  • FIG. 3-4 is a diagram showing a process from when a cell introduced into a cell culture tank forms a cell clump to proliferate and is collected.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an embodiment of the cell culture device of the present embodiment.
  • FIG. 5-1 is a phase difference image of the cell culture container in the example of the present invention.
  • FIG. 5-2 is a fluorescence image of a well-side cross section labeled with fluorescence.
  • FIG. 6A is a phase difference image of the cell culture container in the example, and shows a cell clump formed on the microwell.
  • FIG. 6-2 is a phase difference image of the cell culture container in the example, and shows the image after the cell clump is dropped on the surface of the cell culture substrate.
  • FIG. 6-3 is a phase difference image of the cell culture container in the example, and shows a state after culturing and proliferating the cell clump adhered on the surface of the cell culture substrate.
  • FIG. 7-1 shows the results of examining the influence of the number of cells seeded in a cell culture container on the size of a cell clump formed on a microwell in Example.
  • FIG. 7-2 shows the results of examining the effect on the number of cell clumps adhered on the cell culture substrate surface in Examples.
  • FIG. 7-3 is a result of examining the influence on the recovery rate (ratio of the number of collected cells to the number of seeded cells) in Examples.
  • FIG. 8-1 is a phase difference image of the cell culture container in the example. In Table 1, the image after forming the cell agglomeration on the microwell of # 1 hydrogel composition is shown.
  • FIG. 8-2 is a phase contrast image of the cell culture container in the example, and shows the result after cell agglomeration formation on the microwell of # 2 hydrogel composition in Table 1, and FIG. In Table 1, those after the formation of cell clumps on microwells having a hydrogel composition of # 3 are shown.
  • FIG. 8-3 is a phase difference image of the cell culture container in the example.
  • Table 1 the image after forming the cell agglomeration on the microwell having the hydrogel composition # 3 is shown.
  • FIG. 8-4 is a phase difference image of the cell culture container in the example.
  • Table 1 the image after forming the cell agglomeration on the microwell having the hydrogel composition of # 4 is shown.
  • FIG. 9-1 is a phase difference image of the cell culture container in the example. In Table 1, cell clumps formed under the conditions of # 1 were dropped on the cell culture substrate surface by mechanical impact. Show things.
  • FIG. 9-2 is a phase difference image of the cell culture vessel in the example. The cell clump formed under the conditions of # 2 in Table 1 was dropped on the cell culture substrate surface by mechanical impact.
  • FIG. 9-3 is a phase difference image of the cell culture vessel in the example.
  • the cell clump formed under the condition # 3 in Table 1 was dropped on the cell culture substrate surface by mechanical impact.
  • FIG. 9-4 is a phase difference image of the cell culture container in the example.
  • the cell clump formed under the condition # 4 in Table 1 was dropped on the surface of the cell culture substrate by mechanical impact. Show things.
  • the cell culture container of the present invention is a cell culture container comprising a plate provided with a well and a cell culture substrate having a cell adhesive surface on one side, the open surface of the well and the cell adhesion
  • the plate and the cell culture substrate are arranged so that the sexual surfaces face each other.
  • FIG. 1-1 to FIG. 1-3 are schematic views showing an embodiment of the cell culture container of the present invention
  • FIG. 1-1 is a front view
  • FIG. 1-2 is a side sectional view of FIG. 1-3 is an enlarged view of FIG. 1-2.
  • the dimensions and ratios of the respective constituent elements are appropriately changed.
  • the cell culture container 1 of the present embodiment includes a multiwell plate 2 in which a plurality of microwells 2a are arranged, and a cell adhesive surface 3a on one surface.
  • a multi-well plate 2 and the cell culture substrate 3 so that the opening surface of the microwell 2a and the cell adhesive surface 3a face each other. Has been placed.
  • FIG. 2 is a side cross-sectional view of the cell culture container of the present embodiment, which is reversed from the cross-sectional view of FIG. 1-2.
  • the multiwell plate 2 is not particularly limited as long as a plurality of microwells 2a are arranged, and may be a conventionally known multiplate for cell culture.
  • the multiwell plate 2 used in this embodiment includes a multiwell plate substrate 2b, a plurality of microwells 2a formed in the multiwell plate substrate 2b, and a multiwell plate.
  • the cell culture tank 2c which is the space in the base material 2b is provided.
  • the cell culture tank 2c is filled with a culture solution (liquid medium).
  • the microwell 2a is for forming a cell aggregate of a certain size from the dispersed cells.
  • the microwell 2a is formed of a material having a refractive index ratio with water of 0.9 to 1.1. It is preferable to form a hydrogel composed of a cell non-adhesive polymer. Even if the microwell 2a is non-cell-adherent, there is no possibility that the cells will undergo apoptosis due to lack of a scaffold if cultured for about one day.
  • the hydrogel means a hydrophilic polymer containing a large amount of water.
  • the component of the hydrogel used in the present embodiment is not particularly limited as long as it has cell non-adhesiveness.
  • cellulose such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • polyethylene glycol is preferable from the viewpoint of cell non-adhesiveness and good visibility of the resulting microwell.
  • Examples of the method for forming the microwell 2a using hydrogel include the following methods. After pouring a monomer such as polyethylene glycol into a multi-well plate substrate 2b made of polydimethylsiloxane (PDMS), a PDMS stamp separately prepared as a template is pressed, and the monomer is polymerized by UV irradiation, whereby the microwell 2a is formed. Molded.
  • a monomer such as polyethylene glycol
  • the microwell 2a is preferably formed by molding a hydrogel obtained by polymerizing polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, or a mixture thereof. It is more preferable to form a hydrogel obtained by polymerizing a mixture or a mixture of polyethylene glycol and polyacrylamide.
  • the shape of the microwell 2a is preferably an inverted pyramid type (square pyramid), an inverted polygonal pyramid, or an inverted cone type. Since iPS cells have lower motility than other cells, when the shape of the microwell 2a is a flat bottom shape, it is difficult for the cells settled in each microwell to gather to form a cell clump. .
  • the shape of the microwell 2a is an inverted pyramid type (quadrangular pyramid), an inverted polygonal pyramid, or an inverted conical shape, cells gather at one place using the inclined surface of the microwell 2a, and a cell agglomeration It becomes easy to form.
  • the pitch of the microwells 2a is preferably 1 mm to 3 mm.
  • the pitch of the microwells 2a refers to the length between the centers of the bottom surfaces of adjacent microwells.
  • the length represented by L is shown.
  • the well inclination angle is preferably 30 ° to 75 °, more preferably 40 ° to 70 °, and particularly preferably 50 ° to 65 °.
  • the well tilt angle is, for example, an angle represented by ⁇ in FIG.
  • the surface roughness of the microwell is preferably 20 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or less, and particularly preferably 5 ⁇ m or less.
  • the cell culture substrate 3 constituting the cell culture container 1 of the present embodiment serves as a lid of the multiwell plate 2. Furthermore, the cell culture substrate 3 has a cell adhesive surface 3 a on one surface corresponding to the inside of the cell culture container 1. That is, in the cell culture container 1, the multiwell plate 2 and the cell culture substrate 3 are arranged so that the opening surface of the microwell 2a and the cell adhesive surface 3a face each other. With this arrangement, when the cell culture container 1 is inverted upside down and placed so that the cell culture substrate 3 faces down, the cells (cell clumps) that have been cultured on the microwell 2a adhere to the cell. Adheres to the surface 3a and is cultured on the cell culture substrate 3.
  • the material of the cell culture substrate 3 is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known materials used for cell culture multiplates. Specifically, polyurethane, polyisoprene, polyethylene, polynorbornene, styrene-butadiene copolymer; epoxy resin, phenol resin, acrylic resin, polyester, melanin resin; polycaprolactone, polyvinyl chloride, polystyrene, polybutylene succinate, Examples thereof include polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, and polyphenylene sulfide. Polystyrene is preferable from the viewpoint of versatility.
  • the material constituting the cell adhesive surface 3a is preferably an extracellular matrix component from the viewpoint of maintaining the pluripotency of cells even in feederless culture.
  • extracellular matrix components include collagen, atelocollagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, glucosaminoglycan, fibronectin, laminin, vitronectin, or gelatin, or laminin, collagen IV, heparan sulfate proteoglycan, and entactin / nidogen 1, Matrigel containing 2 etc. as a main component is mentioned. Among these, matrigel, laminin, and vitronectin are more preferable.
  • Matrigel is a soluble basement membrane component extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma and is not suitable for cell culture for the purpose of transplantation to humans. Therefore, laminin or vitronectin is particularly preferable as the material constituting the cell adhesive surface 3a under xeno-free conditions that do not contain components derived from different species.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • the cell culture container 1 of the present embodiment is used for cell culture on the microwell 2a, then inverted, and used for cell culture on the cell adhesive surface 3a. If the medium is leaked from the cell culture container 1 due to inversion, contamination may occur, and therefore the cell culture container 1 preferably has a sealing property. Furthermore, when the cell culture container 1 has a sealing property, it is necessary to be able to exchange gas inside and outside the culture container. Therefore, the cell culture container 1 includes oxygen in the surface constituting the cell culture container 1. It is preferable that at least one surface having permeability is provided.
  • the cell culture container is provided with at least one communication port for taking out and introducing the cell suspension and the culture solution.
  • a connection portion 4 is provided on the surface opposite to the surface where the multiwell plate 2 contacts the cell culture substrate 3.
  • the cell culture container 1 is connected to a cell culture apparatus (not shown) via the connection unit 4.
  • the multiwell plate base material 2b and the connection part 4 have a communication port 4a for communicating the cell culture tank 2c and the automatic culture apparatus.
  • the communication port 4a is used to lead out and inject the cell suspension and the culture solution from the automatic culture apparatus, and the cell culture vessel 2c has the communication port 4a, so that the cell culture tank 2c is not exposed to the outside air.
  • the medium is appropriately replaced, and the cells cultured to a predetermined number are collected in a sterile state.
  • the cell culture method of the present invention comprises: (A) dispersing the cells obtained in the pre-culture; (B) The cell culture container of the present invention is placed so that the plate is on the bottom, the cells dispersed in the step (a) are introduced into the cell culture container, and cultured in the wells for cell collection. Obtaining a mass; (C) The cell culture container is inverted so that the cell culture substrate is facing down, the cell clump is dropped onto the cell adhesive surface, and the cells are placed on the cell adhesive surface. Culturing the agglomerates; (D) peeling and collecting the cell clump cultured in the step (c) from the cell adhesive surface.
  • the cell culture method of the present invention will be described. This embodiment is specifically described for better understanding of the gist of the invention, and does not limit the present invention unless otherwise specified.
  • Step (a) is a step of dispersing the cells obtained in the preculture.
  • the culture method of the present embodiment it is possible to culture a large amount of cells whose properties are easily changed depending on the culture environment without changing the properties. Therefore, as the cells to be subjected to the cell culture method of the present embodiment, human pluripotent cells that are difficult to culture are preferable, human iPS cells or human ES cells are more preferable, and human iPS cells are particularly preferable.
  • the culture method in the pre-culture is not particularly limited as long as it can cultivate cells of the number of cells necessary for seeding in the cell culture container in the step (b) described later. For example, the cells are cultured on feeder cells. A conventionally well-known culture method is mentioned. Moreover, you may use the cell obtained by postscript process (d) as a cell obtained by preculture.
  • the cell-extracellular matrix bond is cleaved at the time of passage, but the cells are maintained in an appropriately sized colony form without completely cleaving the cell-cell bond.
  • the method of sowing was taken.
  • Examples of the enzyme used in the step (a) include Accutase (trade name) (manufactured by Alternative Cell Technologies). Although it does not specifically limit as a liquid medium used for culture
  • Commercially available synthetic media include ReproFF2 (trade name) (manufactured by Reprocell), mTeSR1 (trade name) (manufactured by StemCell Technologies), TeSR2 (trade name) (manufactured by StemCell Technologies), StemPro hESC SFM (commercial product). Name) (manufactured by Life technologies), hESF-GRO (trade name) (manufactured by Cell Science Laboratory Co., Ltd.), and the like.
  • the above-described cell culture container 1 of the present embodiment is arranged so that the multiwell plate 2 faces down, and the cells dispersed in the step (a) are introduced into the cell culture container 1.
  • This is a step of obtaining a cell clump having a uniform size between the microwells (see FIG. 2).
  • the cells dispersed in the step (a) are introduced into the cell culture tank 2c constituting the cell culture vessel 1 from the communication port 4a.
  • FIG. 3A to FIG. 3D are diagrams showing steps until the cells introduced into the cell culture tank are collected after forming a cell clump.
  • the cells 10 after being introduced into the cell culture vessel 1 are uniformly dispersed in the cell culture tank 2c (see FIG. 3-1).
  • the shape of the microwell 2a is an inverted pyramid type (square pyramid), an inverted polygonal pyramid, or an inverted cone type. This shape is preferable, and the dispersed cells 10 are easily collected to form the cell mass 11.
  • the cell cluster 11 is preferably composed of 50 to 2000 cells 10, more preferably 100 to 500 cells 10.
  • the diameter of the cell clump is about 200 ⁇ m.
  • the cell culture container 1 is inverted so that the cell culture substrate 3 faces downward, the cell clump 11 is dropped on the cell adhesive surface 3a, and then on the cell adhesive surface 3a.
  • the cell mass 11 is cultured.
  • the cell clump 11 is formed in the microwell 2 a constituting the multiwell plate 2. Therefore, when the cell culture container 10 is inverted and arranged so that the cell culture substrate 3 faces down, the cell conglomerate 11 dropped from the multiwell plate 2 adheres to the cell adhesion according to the arrangement of the microwells 2a. Arranged on the surface 3a in an array (see FIG. 3-3).
  • the cell adhesive surface 3a is preferably composed of matrigel, laminin, vitronectin and the like, and the cell clump 11 adheres to the cell adhesive surface 3a and proliferates in a scaffold-dependent manner.
  • the medium is preferably perfused semi-continuously from the communication port 4a, and is preferably cultured for about 6 days.
  • a cell mass 12 having a diameter of about 1 mm to 2 mm is obtained (see FIG. 3-4).
  • the diameter of the cell clump 12 corresponds to the preferable pitch of the microwell 2a described above.
  • the cell agglomerate 12 When the cell agglomerate 12 has a diameter of about 1 mm to 2 mm, the cell agglomeration environment may change due to the cell agglomeration on the cell adhesive surface 3a being bonded to each other and piled up. In addition, there is no possibility that the growth of cell clumps is hindered due to lack of culture area and medium.
  • Step (d) is a step of separating and collecting the cell clumps 12 further cultured in the step (c) from the cell adhesive surface 3a.
  • the enzyme used to peel the cell clump 12 from the cell adhesive surface 3a include Accutase (trade name) (manufactured by Innovative Cell Technologies). As a peeling method using such an enzyme, a conventionally known method performed using trypsin or the like is applied.
  • the cell culture method of the present embodiment may further include a step (e).
  • the step (e) is a step of repeating the step (a) to the step (d) after the step (d). By this step (e), cells can be grown to the number of cells necessary for transplantation while maintaining the undifferentiated state of the cells.
  • the cell culture device of the present invention includes the cell culture container of the present invention.
  • the cell culture apparatus 20 of the present embodiment includes a cell culture container 1, a sample stage 21 that supports the cell culture container 1, a movable part 22 for inverting the cell culture container 1, an observation apparatus 23, Incubation device 24, container transport device 25, pump 31 for leading and exiting cell suspension and culture solution, culture solution storage tank 27, waste solution storage tank 28, perfusion substrate 29, and flow path 30 (Refer to FIG. 4).
  • the incubation device 24 is a device for culturing the cells in the cell culture vessel 1 and includes a temperature adjustment device, a humidity adjustment device, and a CO2 concentration control device (not shown).
  • the inside of the incubation device 24 is maintained, for example, in an atmosphere of a temperature of 37 ° C., a humidity of 90%, and a CO 2 concentration of 5%.
  • the incubation device 24 has a plurality of shelves, and the cell culture container 1 can be accommodated in each shelf.
  • the sample stage 21 is made of a translucent material and supports the cell culture container 1. Furthermore, the sample stage 21 includes a movable part 22 for inverting the cell culture container 1, and depending on the culture period of the cells, the cells are cultured on a microwell or on a cell adhesive surface. It is selected appropriately.
  • the perfusion substrate 29 is a substrate for connecting the cell culture container 1 to the culture solution storage tank 27 or the waste solution storage tank 28.
  • the cell culture container 1 and each tank are connected via the flow path 30, and the liquid culture medium in the cell culture container 1 is supplied and discharged through the communication port 4a.
  • the supply and discharge of the medium is controlled by the pump 31, and the liquid medium is perfused semi-continuously.
  • the observation device 23 is a device for observing cells in the cell culture container 1 supported by the sample stage 21, and includes a phase contrast microscope and an imaging device (not shown).
  • the container transport device 25 is a device for transporting the cell culture container 1 to each device. By using this container transport device 25, the cell culture method using the cell culture device 20 of this embodiment is automated.
  • the container transport device 25 takes out the cell culture container 1 from the incubation device 24 and places it on the sample stage 21. After the cells in the cell culture container 1 are imaged by the observation device 23, the cell culture container 1 is inverted by the movable part 22. After the inversion, the container transport device 25 stores the cell culture container 1 in the incubation device 24. After culturing for a predetermined period, the container transport device 25 takes out the cell culture container 1 from the incubation device 24 again and places it on the sample stage 21. The cells in the cell culture vessel 1 are collected after being imaged by the observation device 23.
  • a cell culture vessel has been found in which cells are arranged in an array, a cell clump is formed from the cells, and then inverted, and the cell clump can be cultured for adhesion.
  • the cell culture method of the present invention uses the cell culture container of the present invention, the cells can be cultured simply by an inversion operation without changing the cell culture environment.
  • the cell culture device of the present invention uses the cell culture container of the present invention, the cell culture can be automated. Therefore, according to the present invention, human ES cells and human iPS cells, which have required the skill of researchers, can be cultured easily while maintaining an undifferentiated state, and contribute to regenerative medicine. Can do.
  • Example 1 Preparation of microwell culture chip (cell culture container)> [Production of multi-well plate]
  • the polywellic plate substrate 2b made of polydimethylsiloxane (PDMS) shown in FIG. 2 contains 1% by weight of Irgacure 2959 (manufactured by BASF) and 0.01 weight of FITC-labeled dextran (molecular weight 1 million).
  • % Polyethylene glycol-diacrylate (molecular weight 1000) was poured, a PDMS stamp separately prepared as a mold was pressed, and polyethylene glycol was polymerized by UV irradiation to form a microwell 2a.
  • the PDMS stamp was peeled off from the microwell 2a, washed with ethanol, and washed overnight with sterilized PBS.
  • the PDMS stamp was formed by pouring a mixed solution in which a silicon elastomer base solution and a curing agent were mixed at a mass ratio of 10: 1 into a patterned silicon mold.
  • the multiwell plate thus prepared was observed using a fluorescence microscope.
  • FIG. FIG. 5-2 is a fluorescence image of a well-side cross section labeled with fluorescence.
  • FIG. 5-2 is a fluorescence image when the cell culture container is inverted so that the cell culture substrate is facing down, and it was confirmed that a microwell with a 1 mm pitch that was fluorescently labeled was formed. .
  • a hole was made in the PDMS multiwell plate substrate 2b, a tube was connected, and a multiwell plate with flow paths was obtained.
  • Example 2 After pouring an aqueous solution having the composition shown in # 4 of Table 1 into a polywellic plate substrate 2b made of polydimethylsiloxane (PDMS) shown in FIG. 2, a pitch length of 2.5 mm separately prepared as a mold was used.
  • a microwell 2a was formed by pressing a PDMS stamp and polymerizing polyethylene glycol by UV irradiation. The PDMS stamp was peeled off from the microwell 2a, washed with ethanol, and washed overnight with sterilized PBS. Thereafter, a PDMS multiwell plate was processed as described in Example 1, and this was superposed on the cell culture substrate 3 coated with Matrigel to obtain a microwell culture chip.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • iPS cells were introduced into the microwell culture chip such that the microwell side of the microwell culture chip was placed at the bottom, and the number of cells settled in each microwell was 2000. After introduction, the cells were cultured with intermittent tapping for 4 hours and collected at the bottom of the microwell. After further standing for 16 hours and culturing, a predetermined number of iPS cells settled in the microwells to form cell clumps.
  • a phase difference image of this microwell culture chip is shown in FIG. In FIG. 6-1, a cell cluster is indicated by an arrow, and a line represents 1000 ⁇ m. Thereafter, the microwell culture chip was placed upside down, and the cell clump was allowed to settle on the surface of the cell culture substrate.
  • FIG. 6B A phase difference image of this microwell culture chip is shown in FIG.
  • the cell cluster is indicated by an arrow, and the line represents 1000 ⁇ m.
  • the number of sedimented cell clumps decreased to less than half, it was confirmed that the cell clumps were seeded on the surface of the cell culture substrate.
  • a liquid medium ReproFF2 (trade name) (manufactured by Reprocell Co., Ltd.) was perfused on a microwell culture chip semi-continuously for 5 days, and cell clumps were adhered and cultured on the surface of the cell culture substrate.
  • the cells were grown on the cell culture substrate surface while maintaining an array arrangement.
  • FIG. 6-3 A phase difference image of this microwell culture chip is shown in FIG. 6-3. In FIG.
  • the line represents 1000 ⁇ m.
  • the seeded iPS cells form a cell clump having a uniform size in each microwell.
  • the cell clump is arranged in the arrangement of the microwells.
  • the cells were arranged in an array on the cell adhesive surface and confirmed to be proliferating.
  • Example 3 The microwell culture chip obtained in the same manner as in Example 2 was placed with the microwell side as the bottom, and the number of cells settled in each microwell was 31, 125, 500, 2000, IPS cells were introduced into a microwell culture chip.
  • a predetermined number of iPS cells settled in the microwells to form cell clusters.
  • the diameter of each cell clump is shown in FIG. As shown in FIG. 7A, the diameter of each cell clump is 70 ⁇ m, 130 ⁇ m, 160 ⁇ m, and 250 ⁇ m, respectively, confirming the formation of a cell clump having a size corresponding to the number of cells that have settled in the microwell. It was.
  • FIG. 7-2 shows the adhesion rate of the cell clumps cultured for 2 days after inversion and settled on the surface of the cell culture substrate. The adhesion rate was calculated from the number of adhered colonies and the number of settled cell clumps. As shown in FIG. 7-2, it was confirmed that a cell clump having a high adhesion rate can be obtained under the condition that the cells are seeded so that the number of cells settled in each microwell is 500 or more. .
  • the cells were cultured for 5 days, and the cell clumps were treated with Accutase (trade name) and collected.
  • the ratio of the number of collected cells to the number of seeded cells was calculated as the production rate. The results are shown in Fig. 7-3. It was confirmed that the production rate was 180% under the condition that the cells were seeded so that the number of cells settled in each microwell was 31. It was confirmed that the production rate was 210% under the conditions in which the cells were seeded so that the number of cells settled in each microwell was 125, 500, and 2000.
  • Example 4 Preparation of microwell culture chip (cell culture container)> [Production of multi-well plate]
  • a polywellic plate base material 2b made of polydimethylsiloxane (PDMS) shown in FIG. 2 contains 0.5% by weight of Irgacure 2959 (manufactured by BASF), polyethylene glycol-diacrylate (PEGDA; molecular weight 1000), After pouring an aqueous solution containing vinylpyrrolidone (VP), acrylamide (AAm), sodium acrylate (AANa), or polyethylene glycol-methacrylate (PEGMA) in the composition shown in Table 1, a separately prepared PDMS stamp was pressed as a mold.
  • Irgacure 2959 manufactured by BASF
  • PEGDA polyethylene glycol-diacrylate
  • VP vinylpyrrolidone
  • AAm acrylamide
  • AANa sodium acrylate
  • PEGMA polyethylene glycol-methacrylate
  • the microwell 2a was formed by polymerization by UV irradiation (90 mJ / cm 2, 1000 sec).
  • the PDMS stamp was peeled off from the microwell 2a, washed with ethanol, and washed overnight with sterilized PBS. Thereafter, PDMS multiwell plates were processed and matrigel coated as described in Examples 1 and 2 to obtain microwell culture chips.
  • a cell suspension having a concentration of 2000 cells / microwell was introduced into the chamber and allowed to stand in an incubator until 24 hours after introduction.
  • FIG. 8 shows a microscopic observation image 24 hours after introduction. The cell aggregation of the system into which VP and AAm were introduced was good.
  • FIG. 9 shows a microscope observation image after the release treatment.
  • the number of released pellets is listed in Table 1.
  • the hydrogel mainly composed of VP and AAm examined this time was good in both cell aggregation and pellet release. From the viewpoint of transparency and handleability, it is considered industrially most useful to use a VP-based hydrogel.
  • SYMBOLS 1 ... Cell culture container, 2 ... Multiwell plate, 2a ... Microwell, 3 ... Cell culture substrate, 3a ... Cell adhesive surface, 4 ... Connection part, 4a ... Communication port, 10 ... Cell, 11, 12 ... Cell Aggregation, 20 ... cell culture device, 21 ... sample stage, 22 ... movable part, 23 ... observation device, 24 ... incubation device, 25 ... container transport device, 26 ... pump, 27 ... culture medium storage tank, 28 ... waste liquid storage Tank, 29 ... substrate for perfusion, 30 ... flow path, 31 ... pump

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Abstract

　本発明の細胞培養容器は、ウェルを備えたプレートと、一方の面に細胞接着性表面を有する細胞培養基材と、を備えた細胞培養容器であって、前記ウェルの開口面と前記細胞接着性表面が、対向するように、前記プレートと、前記細胞培養基材が配置されていることを特徴とする。

Description

細胞培養容器、細胞培養装置、及び細胞培養方法
　本発明は、細胞培養容器、並びに、これを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。
　近年、再生医療の分野において、ヒト胚性幹細胞（以下、ヒトＥＳ細胞という）やヒト人工多能性幹細胞（以下、ヒトｉＰＳ細胞という）を用いた医療への応用研究が注目を集めている。
　ヒトの臓器は、数百億から数千億単位数の細胞から構成されており、再生医療を目的として、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性細胞やヒト多能性細胞から適切に分化誘導された目的の細胞をヒトに移植するためには、移植に必要な細胞数の細胞を増殖させる培養システムの確立が必要である。
　従来、ヒト多能性細胞の培養方法としては、ゼラチン等でコートされたディッシュ上に播種されたフィーダー細胞として用いられる胚性繊維芽細胞上で細胞培養を行い、コロニーを形成させるコロニー形成型培養法が採用されていた。細胞を大量に培養するプロセスにおいては、長期に亘って継代培養を行う必要がある。そのため、コロニー形成型培養法においては、一定の大きさになったコロニーを酵素処理、乃至はピペッティングなどの操作によって適切なサイズのクランプに砕き、再度フィーダー細胞上に細胞を播種し、コロニーを形成させる操作を繰り返す必要があった。
　しかし、コロニー形成型培養法では、コロニーの内側と外側の細胞が生存する微小環境が異なるため、未分化維持因子がコロニー中心部まで浸透し難くなり、コロニーを構成する各細胞間に不均一性が生じることが報告されている（非特許文献１～２参照）。
　このように不均一性を有している細胞を継代し、繰り返しコロニーを形成させることにより、細胞間の不均一性が増大することとなるため、コロニー形成型培養法では、細胞の未分化状態を維持するという点において改良の余地がある。
　更に、コロニー形成型培養法においては、形成されたコロニーが、細胞の未分化状態を維持した良質のものであるかどうかの判断は研究者の技量に委ねられており、均質な細胞を大量に培養するには、ある程度の熟練度が要求されていた。
　これに対して、近年では、フィーダー細胞を用いずに、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞を培養するフィーダーレス培養方法も採用されている。フィーダーレス培養方法は、培養の際に、マウス胚性繊維芽細胞等のフィーダー細胞を用意する必要がない点で、再生医療への適用を考えると安全性などの面で非常に優れている。
　形成されるコロニーの状態は、播種時のクランプのサイズに大きく関係するものである。クランプのサイズにばらつきが大きければ、当然接着したコロニーの大きさにもばらつきが大きくなり、クランプのサイズの違いが細胞の分化能に影響を与えるという報告もあり（非特許文献３参照）、クランプのサイズを適切にコントロールすることは、細胞の未分化状態を維持したまま細胞を増殖させるための重要な要素となっている。
　このように、ヒト多能性細胞の培養は、樹立した細胞株を培養する場合と比較して、非常に不安定であり、依然として、熟練した技術が必要とされている。
Davey　RE,　et　al.,　Stem　Cells,　(2006)　vol.24,pp2538-2548. Singh　AM,　et　al.,　Stem　Cells,　(2007)　vol.25,pp2534-2542. Hwang　YS,　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA,　(2009)　vol.106,　pp.16978-1070. Fukuda　J,　et　al.,　Biomaterials,　(2006)　vol.27,　pp.1061-16983.
　このような状況において、細胞培養容器の改良が求められている。細胞培養容器におけるクランプの取扱によっては、不均一なクランプが分布することになり、培養方法を最適化しても再現性が取れないおそれがある。細胞培養容器としては、平底形状を有するミクロ加工された単純なマルチウェルプレート又はディッシュが用いられているのが現状であり（非特許文献３～４参照）、未だ改良の余地がある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞の未分化状態を維持したまま細胞を大量に培養することのできる細胞培養容器、並びに、これを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決すべく、本発明は、下記の特徴を有する細胞培養容器、細胞培養装置、及び細胞培養方法を提供するものである。
（１）ウェルを備えたプレートと、一方の面に細胞接着性表面を有する細胞培養基材と、を備えた細胞培養容器であって、前記ウェルの開口面と前記細胞接着性表面が、対向するように、前記プレートと、前記細胞培養基材が配置されていることを特徴とする細胞培養容器。
（２）前記ウェルは、水との屈折率比が０．９～１．１の材料より形成されてなる（１）の細胞培養容器。
（３）前記ウェルは、細胞非接着性の高分子からなるハイドロゲルを成形してなる（１）又は（２）の細胞培養容器。
（４）前記ウェルは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、若しくはポリアクリルアミド、又はこれらの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなる（１）～（３）のいずれか一つの細胞培養容器。
（５）前記ウェルは、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンの混合物、又は、ポリエチレングリコール及びポリアクリルアミドの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなる（１）～（４）のいずれか一つの細胞培養容器。
（６）前記ウェルの形状は、逆ピラミッド型（四角錐）、逆多角錐、又は逆円錐型である（１）～（５）のいずれか一つの細胞培養容器。
（７）前記ウェルのピッチは、１ｍｍ～３ｍｍである（１）～（６）のいずれか一つの細胞培養容器。
（８）前記ウェルの表面粗さは、２０μｍ以下である（１）～（７）のいずれか一つの細胞培養容器。
（９）前記ウェルの傾斜角が、３０°～７５°である（１）～（８）のいずれか一つの細胞培養容器。
（１０）酸素透過性を有する面を少なくとも一つ備えた（１）～（９）のいずれか一つの細胞培養容器。
（１１）細胞懸濁液及び培養液を導出入するための連通口を少なくとも一つ備えた（１）～（１０）のいずれか一つの細胞培養容器。
（１２）（１）～（１１）のいずれか一つの細胞培養容器を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
（１３）（ａ）前培養で得られた細胞を分散させる工程と、
（ｂ）（１）～（１０）のいずれか一つの細胞培養容器を、前記プレートが下になるように配置し、前記工程（ａ）で分散させた細胞を前記細胞培養容器内に導入し、前記ウェル内で培養して細胞集塊を得る工程と、
（ｃ）前記細胞培養容器を前記細胞培養基材が下になるように反転させて配置し、前記細胞集塊を前記細胞接着性表面上に落下させて、該細胞接着性表面上で前記細胞集塊を更に培養する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で更に培養した前記細胞集塊を前記細胞接着性表面から剥離して回収する工程と、を有することを特徴とする細胞培養方法。
（１４）更に、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記工程（ａ）～前記工程（ｄ）を繰り返す工程を有する（１３）の細胞培養方法。
（１５）前記工程（ａ）において、細胞－細胞間結合及び細胞－細胞外マトリクス間結合を切断する酵素溶液を用いて細胞を分散させる（１３）又は（１４）の細胞培養方法。
（１６）前記工程（ｂ）において、前記均一な大きさの細胞集塊は、１００細胞～５００細胞からなる（１３）～（１５）のいずれか一つの細胞培養方法。
（１７）前記細胞は、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である（１３）～（１６）のいずれか一つの細胞培養方法。
　本発明によれば、細胞の未分化状態を維持したまま細胞を大量に培養することができる。
図１－１は、本発明の細胞培養容器の実施形態を示す概略図としての正面図である。 図１－２は、本発明の細胞培養容器の実施形態を示す概略図としての側断面図である。 図１－３は、本発明の細胞培養容器の実施形態を示す概略図としての拡大図である。 図２は、本実施形態の細胞培養容器の側断面図を示し、図１－２の断面図と天地逆に示したものである。 図３－１は、細胞培養槽に導入された細胞が、細胞集塊を形成して増殖後、回収されるまでの工程を示した図である。 図３－２は、細胞培養槽に導入された細胞が、細胞集塊を形成して増殖後、回収されるまでの工程を示した図である。 図３－３は、細胞培養槽に導入された細胞が、細胞集塊を形成して増殖後、回収されるまでの工程を示した図である。 図３－４は、細胞培養槽に導入された細胞が、細胞集塊を形成して増殖後、回収されるまでの工程を示した図である。 図４は、本実施形態の細胞培養装置の実施形態を示す概略図である。 図５－１は、本発明の実施例における細胞培養容器の位相差画像である。 図５－２は、蛍光標識したウェル側断面の蛍光画像である。 図６－１は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、マイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示す。 図６－２は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、細胞培養基材表面上に細胞集塊を落下させた後のものを示す。 図６－３は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、細胞培養基材表面上に接着させた細胞集塊を培養し、増殖させた後のものを示す。 図７－１は、実施例において、細胞培養容器に播種した細胞数が、マイクロウェル上に形成した細胞集塊の大きさに与える影響について検討した結果を示す。 図７－２は、実施例において、細胞培養基材表面上に接着した細胞集塊の数に与える影響について検討した結果を示す。 図７－３は、実施例において、回収率（播種した細胞数に対する回収した細胞数の割合）に与える影響について検討した結果である。 図８－１は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯１のハイドロゲル組成のマイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示す。 図８－２は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯２のハイドロゲル組成のマイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示し、図８－３は、表１中、♯３のハイドロゲル組成のマイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示す。 図８－３は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯３のハイドロゲル組成のマイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示す。 図８－４は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯４のハイドロゲル組成のマイクロウェル上に細胞集塊形成後のものを示す。 図９－１は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯１の条件で形成させた細胞集塊を機械的衝撃により、細胞培養基材表面上に落下させたものを示す。 図９－２は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯２の条件で形成させた細胞集塊を機械的衝撃により、細胞培養基材表面上に落下させたものを示す。 図９－３は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯３の条件で形成させた細胞集塊を機械的衝撃により、細胞培養基材表面上に落下させたものを示す。 図９－４は、実施例における細胞培養容器の位相差画像であり、表１中、♯４の条件で形成させた細胞集塊を機械的衝撃により、細胞培養基材表面上に落下させたものを示す。
［細胞培養容器］
　本発明の細胞培養容器は、ウェルを備えたプレートと、一方の面に細胞接着性表面を有する細胞培養基材と、を備えた細胞培養容器であって、前記ウェルの開口面と前記細胞接着性表面が、対向するように、前記プレートと、前記細胞培養基材が配置されている。
　以下、本発明の細胞培養容器の実施の形態について説明する。
　なお、この実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
　図１－１～図１－３は、本発明の細胞培養容器の実施形態を示す概略図であり、図１－１は正面図、図１－２は図１－１の側断面図、図１－３は図１－２の拡大図である。なお、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。
　図１－１～図１－３に示すように、本実施形態の細胞培養容器１は、複数のマイクロウェル２ａが配列されてなるマルチウェルプレート２と、一方の面に細胞接着性表面３ａを有する細胞培養基材３と、を備えた細胞培養容器であって、マイクロウェル２ａの開口面と細胞接着性表面３ａとが、対向するように、マルチウェルプレート２と、細胞培養基材３が配置されている。
　図２は、本実施形態の細胞培養容器の側断面図を、図１－２の断面図と天地逆に示したものである。マルチウェルプレート２は、複数のマイクロウェル２ａが配列されてなるものであれば、特に限定されず、細胞培養用の従来公知のマルチプレートであってもよい。
　図２に示されるように、本実施形態に用いられるマルチウェルプレート２は、マルチウェルプレート基材２ｂと、このマルチウェルプレート基材２ｂ内に形成される複数のマイクロウェル２ａと、マルチウェルプレート基材２ｂ内の空間である細胞培養槽２ｃを備えている。細胞培養槽２ｃは、培養液（液体培地）で満たされている。
　本実施形態において、マイクロウェル２ａは、分散した細胞から一定の大きさの細胞集塊を形成させるためのものである。後述する細胞培養方法において、形成した細胞集塊をマイクロウェル２ａから速やかに脱離させる観点から、マイクロウェル２ａは、水との屈折率比が０．９～１．１の材料より形成されてなることが好ましく、細胞非接着性の高分子からなるハイドロゲルを成形してなるものであることが好ましい。マイクロウェル２ａが細胞非接着性であっても、１日程度の培養であれば足場がないことにより細胞がアポトーシス（ａｎｏｉｋｉｓ）を起こすおそれもない。
　本実施形態において、ハイドロゲルとは、水を多量に含む親水性ポリマーを意味する。本実施形態に用いられるハイドロゲルの構成成分としては、細胞非接着性を有するものであれば特に限定されず、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド、ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類；及びこれらの誘導体等が挙げられる。
　中でも、細胞非接着性を有し、かつ、得られるマイクロウェルの視認性がよいという観点から、ポリエチレングリコールが好ましい。
　ハイドロゲルを用いたマイクロウェル２ａの成形方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のマルチウェルプレート基材２ｂにポリエチレングリコール等のモノマーを流し込んだ後、鋳型として別途作製されたＰＤＭＳスタンプを押し付け、ＵＶ照射によりモノマーを重合させることにより、マイクロウェル２ａが成形される。
　また、本実施形態においてマイクロウェル２ａは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、若しくはポリアクリルアミド、又はこれらの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなるものであることが好ましく、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンの混合物、又は、ポリエチレングリコール及びポリアクリルアミドの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなることがより好ましい。
　本実施形態の細胞培養容器１がｉＰＳ細胞の培養に用いられる場合、マイクロウェル２ａの形状は、逆ピラミッド型（四角錐）、逆多角錐、又は逆円錐型であることが好ましい。ｉＰＳ細胞は、他の細胞と比較して運動性が低いため、マイクロウェル２ａの形状が平底形状の場合には、各マイクロウェルに沈降した細胞が、集まって細胞集塊を形成することが難しい。一方、マイクロウェル２ａの形状が、逆ピラミッド型（四角錐）、逆多角錐、又は逆円錐型である場合には、細胞がマイクロウェル２ａの斜面を利用して一箇所に集まり、細胞集塊を形成しやすくなる。
　更に、細胞集塊を直径１ｍｍ～２ｍｍの大きさにまで培養する場合には、マイクロウェル２ａのピッチは、１ｍｍ～３ｍｍであることが好ましい。ここで、マイクロウェル２ａのピッチとは、隣接するマイクロウェルにおける底面の中心間の長さをいう。例えば、図２において、Ｌで表される長さを示す。
　また、細胞集塊の形成しやすさの観点から、ウェルの傾斜角は、３０°～７５°が好ましく、４０°～７０°がより好ましく、５０°～６５°が特に好ましい。ウェルの傾斜角とは、例えば、図２において、θで表される角度を示す。
　また、細胞を効率的にマイクロウェル内に落下させるためには、マイクロウェルの表面粗さは、２０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以下が特に好ましい。
　図２に示されるように、本実施形態の細胞培養容器１を構成する細胞培養基材３は、マルチウェルプレート２の蓋部としての役割を果たす。更に、細胞培養基材３は、細胞培養容器１の内側に相当する一方の面に細胞接着性表面３ａを有する。即ち、細胞培養容器１において、マイクロウェル２ａの開口面と細胞接着性表面３ａが、対向するように、マルチウェルプレート２と、前記細胞培養基材３が配置されている。
　係る配置により、細胞培養容器１を天地逆に反転させて、細胞培養基材３が下になるように設置した場合に、マイクロウェル２ａ上で培養されてきた細胞（細胞集塊）は細胞接着性表面３ａに付着し、細胞培養基材３上で培養される。
　細胞培養基材３の材質としては、特に限定されず、細胞培養用マルチプレートに用いられる従来公知の材質が挙げられる。具体的には、ポリウレタン、ポリイソプレン、ポリエチレン、ポリノルボルネン、スチレン－ブタジエン共重合体；エポキシ樹脂、フェノール樹脂、アクリル樹脂、ポリエステル、メラニン樹脂；ポリカプロラクトン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンサルファイド；等のポリマーが挙げられ、汎用性の観点からポリスチレンが好ましい。
　細胞接着性表面３ａを構成する材質としては、フィーダーレス培養においても、細胞の分化多能性の維持できる観点から、細胞外マトリックス成分が好ましい。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、又は、ゼラチン、或いは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチン／ニドジェン１，２等を主成分として含有するマトリゲルが挙げられる。　これらの中でも、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチンがより好ましい。
　また、マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜成分であるため、ヒトへの移植を目的として細胞培養を行う場合には適していない。
　従って、異種由来の成分を含まないゼノフリー条件下において、細胞接着性表面３ａを構成する材質としては、ラミニン又はビトロネクチンが特に好ましい。
　本実施形態の細胞培養容器１は、マイクロウェル２ａ上での細胞培養に用いられた後、反転され、細胞接着性表面３ａ上での細胞培養に用いられる。反転することにより細胞培養容器１から培地が漏洩するとコンタミネーションを生じるおそれがあるため、細胞培養容器１は、密封性を有していることが好ましい。
　更に、細胞培養容器１が密封性を有する場合には、培養容器内外でガス交換ができるようにする必要があることから、細胞培養容器１は、細胞培養容器１を構成する表面の内、酸素透過性を有する表面を少なくとも一つ備えていることが好ましい。
　また、研究者の技量に依存せずに、均質な細胞を大量に培養するには、細胞培養は、極力自動化されることが好ましい。そのため、細胞培養容器は、細胞懸濁液及び培養液を導出入するための連通口を少なくとも一つ備えていることがより好ましい。
　本実施形態の細胞培養容器１は、マルチウェルプレート２が細胞培養基材３と接する面とは反対の面に接続部４が備え付けられている。細胞培養容器１は、接続部４を介して、図示略の細胞培養装置と接続される。マルチウェルプレート基材２ｂ及び接続部４は、細胞培養槽２ｃと、自動培養装置とを、連通するための連通口４ａを有する。連通口４ａは、自動培養装置から細胞懸濁液及び培養液を導出入するためのものであり、細胞培養容器１が連通口４ａを有することにより、細胞培養槽２ｃは、外気に触れることなく適宜培地交換され、所定数まで培養された細胞は、無菌状態で回収される。
［細胞培養方法］
　本発明の細胞培養方法は、
（ａ）前培養で得られた細胞を分散させる工程と、
（ｂ）本発明の細胞培養容器を前記プレートが下になるように配置し、前記工程（ａ）で分散させた細胞を前記細胞培養容器内に導入し、前記ウェル内で培養して細胞集塊を得る工程と、
（ｃ）前記細胞培養容器を前記細胞培養基材が下になるように反転させて配置し、前記細胞集塊を前記細胞接着性表面上に落下させて、該細胞接着性表面上で前記細胞集塊を培養する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で培養した前記細胞集塊を前記細胞接着性表面から剥離して回収する工程と、を有する。
　以下、本発明の細胞培養方法の実施の形態について説明する。
　なお、この実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
　工程（ａ）は、前培養で得られた細胞を分散させる工程である。本実施形態の培養方法によれば、培養環境によって性質の変わりやすい細胞を、その性質を変えることなく、大量に培養することが可能である。従って、本実施形態の細胞培養方法の対象となる細胞としては、培養の難しいヒト多能性細胞が好ましく、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞がより好ましく、ヒトｉＰＳ細胞が特に好ましい。
　前培養における培養方法は、後記工程（ｂ）において、細胞培養容器に播種するために必要な細胞数の細胞を培養できるものであれば特に限定されず、例えば、フィーダー細胞上で細胞を培養する従来公知の培養法が挙げられる。また、後記工程（ｄ）で得られる細胞を前培養で得られた細胞として用いてもよい。
　従来の培養方法においては、継代の際、細胞－細胞外マトリクス間結合を切断するが、細胞－細胞間結合を完全に切断することなく、細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法が採られていた。
　しかし、本実施形態の工程（ａ）において、細胞－細胞間結合及び細胞－細胞外マトリクス間結合を切断する酵素溶液を用いて細胞を分散させることが好ましい。即ち、細胞を１～１０個の細胞集塊にまで分散させることが好ましく、単細胞ごとに分散させることがより好ましい。これにより、細胞数をカウントすることが可能となり、任意に設定された条件の再凝集塊を得ることができるため、播種時の条件を均一化でき、均一な性質を有する細胞を大量に培養することができる。
　工程（ａ）に用いられる酵素としては、例えばＡｃｃｕｔａｓｅ（商品名）（イノベーティブ　セル　テクノロジーズ社製）が挙げられる。
　培養に用いられる液体培地としては、特に限定されないが、合成培地が好ましく、異種成分を含まない（ゼノフリー）合成培地がより好ましい。市販されている合成培地としては、ＲｅｐｒｏＦＦ２（商品名）（株式会社リプロセル製）、ｍＴｅＳＲ１（商品名）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ２（商品名）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ　ｈＥＳＣ　ＳＦＭ（商品名）（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社製）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ（商品名）（株式会社細胞科学研究所製）等が挙げられる。
　工程（ｂ）は、上述した本実施形態の細胞培養容器１を、マルチウェルプレート２が下になるように配置し、前記工程（ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１内に導入し、各マイクロウェル間で均一な大きさの細胞集塊を得る工程である（図２参照。）。
　工程（ａ）において分散させた細胞は、連通口４ａから、細胞培養容器１を構成する細胞培養槽２ｃ内に導入される。
　図３－１～図３－４は、細胞培養槽に導入された細胞が、細胞集塊を形成して回収されるまでの工程を示した図である。以下、図３を参照しながら説明する。
　細胞培養容器１に導入後の細胞１０は、細胞培養槽２ｃ内を均一に分散する（図３－１参照）。各マイクロウェル２ａ中に同数の細胞１０を沈降させるためには、細胞導入後、１日静置培養することが好ましい。
　上述した様に、ｉＰＳ細胞を培養する場合には、他の細胞と比較して運動性が低いため、マイクロウェル２ａの形状が、逆ピラミッド型（四角錐）、逆多角錐、又は逆円錐型であることが好ましく、係る形状により、分散した細胞１０が集まって細胞集塊１１を形成しやすくなる。
　１日静置培養後、各マイクロウェル２ａ間で均一な大きさの細胞集塊１１が得られる（図３－２参照）。細胞集塊１１は、５０個～２０００個の細胞１０からなることが好ましく、１００個～５００個の細胞１０からなることがより好ましい。例えば、細胞集塊が５００個の細胞からなる場合、その細胞集塊の直径は、約２００μｍである。
　細胞集塊１１が係る個数の細胞１０からなることにより、細胞の回収率（回収した細胞総数を、細胞培養槽に導入された細胞数で割った値）が高いものとなる。
　工程（ｃ）は、細胞培養容器１を細胞培養基材３が下になるように反転させて配置し、細胞集塊１１を細胞接着性表面３ａ上に落下させて、細胞接着性表面３ａ上で細胞集塊１１を培養する工程である。
　工程（ｂ）において細胞集塊１１は、マルチウェルプレート２を構成するマイクロウェル２ａ中で形成されたものである。そのため、細胞培養基材３が下になるように細胞培養容器１０を反転させて配置した場合には、マルチウェルプレート２から落下した細胞集塊１１は、マイクロウェル２ａの配置に従って、細胞接着性表面３ａ上にアレイ状に配置される（図３－３参照）。
　上述した様に、細胞接着性表面３ａは、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン等から構成されるものであることが好ましく、細胞集塊１１は、細胞接着性表面３ａに接着し、足場依存的に増殖する。工程（ｃ）において、培地は連通口４ａから半連続的にかん流されることが好ましく、６日程度培養することが好ましい。工程（ｃ）を経ることにより、直径１ｍｍ～２ｍｍ程度の細胞集塊１２が得られる（図３－４参照）。係る細胞集塊１２の直径は、上述したマイクロウェル２ａの好ましいピッチに対応する。細胞集塊１２の直径が、１ｍｍ～２ｍｍ程度の場合には、細胞接着性表面３ａ上の細胞集塊同士が結合して、細胞がパイルアップすることにより、細胞の培養環境が変化するおそれがなく、培養面積及び培地が不足して細胞集塊の増殖が妨げられるおそれもない。
　工程（ｄ）は、前記工程（ｃ）で更に培養した細胞集塊１２を細胞接着性表面３ａから剥離して回収する工程である。
　細胞集塊１２を細胞接着性表面３ａから剥離するために用いられる酵素としては、例えばＡｃｃｕｔａｓｅ（商品名）（イノベーティブ　セル　テクノロジーズ社製）が挙げられる。係る酵素を用いた剥離方法としては、トリプシン等を用いて行う従来公知の方法が適用される。
　本実施形態の細胞培養方法は、更に工程（ｅ）を有していてもよい。工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）の後、前記工程（ａ）～前記工程（ｄ）を繰り返す工程である。係る工程（ｅ）により、細胞の未分化状態を維持したまま、移植に必要な細胞数まで細胞を増殖させることができる。
［細胞培養装置］
　本発明の細胞培養装置は、本発明の細胞培養容器を備えたものである。一例として、本実施形態の細胞培養装置２０は、細胞培養容器１と、細胞培養容器１を支持する試料台２１と、細胞培養容器１を反転させるための可動部分２２と、観察装置２３と、インキュベーション装置２４と、容器搬送装置２５と、細胞懸濁液及び培養液を導出入するためのポンプ３１と、培養液貯蔵タンク２７と、廃液貯蔵タンク２８、灌流用基板２９と、流路３０と、を備えている（図４参照）。
　インキュベーション装置２４は、細胞培養容器１中の細胞を培養するための装置であり、図示略の温度調整装置、湿度調整装置、及びＣＯ２濃度制御装置を備えている。インキュベーション装置２４内は、例えば、温度３７℃、湿度９０％、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下に維持されている。
　また、インキュベーション装置２４は、複数の棚を有しており、細胞培養容器１を、各々の棚に収容することができる。
　試料台２１は、透光性の材質で構成されており、細胞培養容器１を支持している。更に、試料台２１は、細胞培養容器１を反転させるための可動部分２２を備えており、細胞の培養時期によって、細胞をマイクロウェル上で培養するか、細胞接着性表面上で培養するか、適宜選択される。
　灌流用基板２９は、細胞培養容器１と、培養液貯蔵タンク２７又は廃液貯蔵タンク２８と、をそれぞれ繋ぐための基板である。細胞培養容器１と各タンクは、流路３０を介して接続され、細胞培養容器１内の液体培地は、連通口４ａを通って供給及び排出される。この培地の供給及び排出は、ポンプ３１によって制御され、液体培地は、半連続的に灌流される。
　観察装置２３は、試料台２１に支持された細胞培養容器１内の細胞を観察するための装置であり、図示略の位相差顕微鏡、及び撮像装置を備えている。
　容器搬送装置２５は、細胞培養容器１を各装置に搬送するための装置である。この容器搬送装置２５を用いることにより、本実施形態の細胞培養装置２０を用いた細胞培養方法は自動化される。自動細胞培養方法の一例を挙げると、容器搬送装置２５は、細胞培養容器１をインキュベーション装置２４から取り出し、試料台２１に載置する。細胞培養容器１中の細胞は、観察装置２３によって撮像された後、細胞培養容器１は可動部分２２によって反転される。反転後、容器搬送装置２５は、細胞培養容器１をインキュベーション装置２４に格納する。所定期間培養後、容器搬送装置２５は、細胞培養容器１を再度インキュベーション装置２４から取り出し、試料台２１に載置する。細胞培養容器１中の細胞は、観察装置２３によって撮像された後、回収される。
　本発明において、アレイ状に細胞を配列させ、この細胞から細胞集塊を形成させた後、反転して、細胞集塊を接着培養することのできる細胞培養容器が見出された。本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養容器を用いたものであるため、細胞の培養環境を変えることなく、反転という操作だけで、簡便に細胞を培養することができる。
　更に、本発明の細胞培養装置は、本発明の細胞培養容器を用いたものであるため、細胞培養の自動化を可能とするものである。
　従って、本発明によれば、研究者の熟練を要していたヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を、誰もが簡便に未分化状態を維持したまま培養することができ、再生医療に貢献することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
≪実施例１≫
＜マイクロウェル培養チップ（細胞培養容器）の作製＞
［マルチウェルプレートの作製］
　図２に示されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のマルチウェルプレート基材２ｂに、イルガキュア２９５９（ＢＡＳＦ社製）を１重量％含有し、ＦＩＴＣラベルされたデキストラン（分子量１００万）を０．０１重量％含有したポリエチレングリコール－ジアクリレート（分子量１０００）を流し込んだ後、鋳型として別途作製されたＰＤＭＳスタンプを押し付け、ＵＶ照射によりポリエチレングリコールを重合させることにより、マイクロウェル２ａを成形した。ＰＤＭＳスタンプをマイクロウェル２ａから剥がした後、エタノールで洗浄した後、滅菌済みのＰＢＳで一晩洗浄した。
　尚、ＰＤＭＳスタンプは、シリコンエラストマーベースソリューションとキュアリング剤を１０：１の質量比で混合した混合液をパターン化したシリコン鋳型に流し込み成形した。
　このようにして作製したマルチウェルプレートを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図５－２に示す。図５－２は、蛍光標識したウェル側断面の蛍光画像である。図５－２は、細胞培養基材が下になるように細胞培養容器を反転させたときの蛍光画像であり、蛍光標識された１ｍｍのピッチのマイクロウェルが成形されていることが確認された。
　ＰＤＭＳマルチウェルプレート基材２ｂに穴をあけ、チューブを接続し、流路付きマルチウェルプレートを得た。
［細胞培養基材の作製］
　マトリゲル（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＤＭＥＭで４０倍に希釈した溶液を、ポリスチレン製基板上に滴下し、図２に示される細胞培養基材３を得た。
　作製したマルチウェルプレートと細胞培養基材を重ね合わせマイクロウェル培養チップを得た（図５－１参照）。
≪実施例２≫
　図２に示されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のマルチウェルプレート基材２ｂに、表１の＃４に示される組成を有する水溶液を流し込んだ後、鋳型として別途作製されたピッチ長２．５ｍｍのＰＤＭＳスタンプを押し付け、ＵＶ照射によりポリエチレングリコールを重合させることにより、マイクロウェル２ａを成形した。ＰＤＭＳスタンプをマイクロウェル２ａから剥がした後、エタノールで洗浄した後、滅菌済みのＰＢＳで一晩洗浄した。
　その後、実施例１に記述されているようにＰＤＭＳマルチウェルプレートを加工し、これとマトリゲルコートした細胞培養基材３を重ね合わせマイクロウェル培養チップを得た。
　そして、マイクロウェル培養チップのマイクロウェル側を底にして配置し、各マイクロウェルに沈降する細胞数が、２０００個になるように、マイクロウェル培養チップにｉＰＳ細胞を導入した。導入後、細胞を４時間断続的にタッピングしながら培養し、ミクロウェルの底に集めた。さらに１６時間静置して培養したところ、所定数のｉＰＳ細胞はマイクロウェルに沈降し、細胞集塊を形成した。このマイクロウェル培養チップの位相差画像を図６－１に示す。図６－１中、細胞集塊を矢印で示し、線は１０００μｍを表す。
　その後、マイクロウェル培養チップを反転させて配置し、細胞集塊を細胞培養基材表面上に沈降させた。このマイクロウェル培養チップの位相差画像を図６－２に示す。図６－２中、細胞集塊を矢印で示し、線は１０００μｍを表す。沈降した細胞集塊の数は半分以下に減少したが、細胞集塊が細胞培養基材表面上に播かれたことが確認された。
　その後、マイクロウェル培養チップに、５日間、半連続的に液体培地ＲｅｐｒｏＦＦ２(商品名)（株式会社リプロセル社製）を灌流し、細胞培養基材表面上で、細胞集塊を接着培養した。細胞は、アレイ状の配置を維持したまま細胞培養基材表面上で増殖した。このマイクロウェル培養チップの位相差画像を図６－３に示す。図６－３中、線は１０００μｍを表す。
　図６－１に示すように、播種したｉＰＳ細胞は、各マイクロウェル中に均一な大きさの細胞集塊を形成し、図６－３に示すように、細胞集塊は、マイクロウェルの配置に従って、細胞接着性表面上にアレイ状に配置し、増殖していることが確認された。
≪実施例３≫　
　実施例２と同様にして得たマイクロウェル培養チップのマイクロウェル側を底にして配置し、各マイクロウェルに沈降する細胞数が、３１個、１２５個、５００個、２０００個になるように、マイクロウェル培養チップにｉＰＳ細胞を導入した。導入後、１日静置培養したところ、所定数のｉＰＳ細胞はマイクロウェルに沈降し、細胞集塊を形成した。各細胞集塊の直径を図７－１に示す。図７－１に示すように、各細胞集塊の直径は、それぞれ７０μｍ、１３０μｍ、１６０μｍ、２５０μｍであり、マイクロウェルに沈降した細胞の数に応じた大きさの細胞集塊の形成が確認された。
　その後、マイクロウェル培養チップを反転させて配置し、細胞集塊を細胞培養基材表面上に沈降させた。マイクロウェル培養チップに、６日間、半連続的に培地を灌流し、細胞培養基材表面上で、細胞集塊を接着培養した。
　反転後２日間培養し、細胞培養基材表面上に沈降した細胞集塊の接着率を図７－２に示す。接着率は、接着したコロニーの数及び沈降した細胞集塊の数から算出した。図７－２に示すように、各マイクロウェルに沈降する細胞数が、５００個以上となるように細胞を播種した条件であれば、細胞集塊の高い接着率が得られることが確認された。
　反転後５日間培養し、細胞集塊をＡｃｃｕｔａｓｅ（商品名）で処理し、回収した。各マイクロウェル培養チップにおいて、播種した細胞数に対する回収した細胞数の割合を生産率として算出した。結果を図７－３に示す。各マイクロウェルに沈降する細胞数が、３１個となるように細胞を播種した条件で生産率が１８０％であることが確認された。各マイクロウェルに沈降する細胞数が、１２５個、５００個、２０００個になるように、細胞を播種した条件では、生産率が２１０％であることが確認された。
≪実施例４≫　
＜マイクロウェル培養チップ（細胞培養容器）の作製＞
［マルチウェルプレートの作製］
　図２に示されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のマルチウェルプレート基材２ｂに、イルガキュア２９５９（ＢＡＳＦ社製）を０．５重量％含有し、ポリエチレングリコール－ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ；分子量１０００）と、ビニルピロリドン（ＶＰ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、ソジウムアクリレート（ＡＡＮａ）、又はポリエチレングリコール－メタアクリレート（ＰＥＧＭＡ）を表１の組成で含む水溶液を流し込んだ後、鋳型として別途作製されたＰＤＭＳスタンプを押し付け、ＵＶ照射（９０ｍＪ／ｃｍ２、１０００　ｓｅｃ）により重合させることにより、マイクロウェル２ａを成形した。ＰＤＭＳスタンプをマイクロウェル２ａから剥がした後、エタノールで洗浄した後、滅菌済みのＰＢＳで一晩洗浄した。
　その後、実施例１、２に記述されているようにＰＤＭＳマルチウェルプレートを加工し、マトリゲルコートし、マイクロウェル培養チップを得た。
　濃度２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｉｃｒｏｗｅｌｌの細胞懸濁液をチャンバーに導入し、導入２４時間後までインキュベータ内で静置した。図８に導入２４時間後の顕微鏡観察像を示す。ＶＰおよびＡＡｍを導入した系の細胞集合性は良好であった。その後、チャンバーに培地を充填した状態でプレートの上下を反転し、プレート上方より機械的衝撃を負荷した。図９に遊離処理後の顕微鏡観察像を示す。遊離したペレット数を表１に記載した。今回検討したＶＰおよびＡＡｍを主成分としたハイドロゲルは細胞集合性、ペレット遊離性ともに良好であった。透明性および取扱性からＶＰ主成分のハイドロゲルを利用することが産業上最も有用であると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果から、本発明によれば、細胞の未分化状態を維持したまま細胞を大量に培養することができることが明らかである。
　１…細胞培養容器、２…マルチウェルプレート、２ａ…マイクロウェル、３…細胞培養基材、３ａ…細胞接着性表面、４…接続部、４ａ…連通口、１０…細胞、１１，１２…細胞集塊、２０…細胞培養装置、２１…試料台、２２…可動部分、２３…観察装置、２４…インキュベーション装置、２５…容器搬送装置、２６…ポンプ、２７…培養液貯蔵タンク、２８…廃液貯蔵タンク、２９…灌流用基板、３０…流路、３１…ポンプ

Claims (17)

  1. 　ウェルを備えたプレートと、一方の面に細胞接着性表面を有する細胞培養基材と、を備えた細胞培養容器であって、
    　前記ウェルの開口面と前記細胞接着性表面が、対向するように、前記プレートと、前記細胞培養基材が配置されていることを特徴とする細胞培養容器。
  2. 　前記ウェルは、水との屈折率比が０．９～１．１の材料より形成されてなる請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記ウェルは、細胞非接着性の高分子からなるハイドロゲルを成形してなる請求項１に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記ウェルは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、若しくはポリアクリルアミド、又はこれらの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなる請求項１に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記ウェルは、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンの混合物、又は、ポリエチレングリコール及びポリアクリルアミドの混合物を重合してなるハイドロゲルを成形してなる請求項１に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記ウェルの形状は、逆ピラミッド型（四角錐）、逆多角錐、又は逆円錐型である請求項１に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記ウェルのピッチは、１ｍｍ～３ｍｍである請求項１に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記ウェルの表面粗さは、２０μｍ以下である請求項１に記載の細胞培養容器。
  9. 　前記ウェルの傾斜角が、３０°～７５°である請求項１に記載の細胞培養容器。
  10. 　酸素透過性を有する面を少なくとも一つ備えた請求項１に記載の細胞培養容器。
  11. 　細胞懸濁液及び培養液を導出入するための連通口を少なくとも一つ備えた請求項１に記載の細胞培養容器。
  12. 　請求項１に記載の細胞培養容器を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
  13. （ａ）前培養で得られた細胞を分散させる工程と、
    （ｂ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養容器を、前記プレートが下になるように配置し、前記工程（ａ）で分散させた細胞を前記細胞培養容器内に導入し、前記ウェル内で培養して細胞集塊を得る工程と、
    （ｃ）前記細胞培養容器を前記細胞培養基材が下になるように反転させて配置し、前記細胞集塊を前記細胞接着性表面上に落下させて、該細胞接着性表面上で前記細胞集塊を得る工程と、
    （ｄ）前記工程（ｃ）で培養した前記細胞集塊を前記細胞接着性表面から剥離して回収する工程と、を有することを特徴とする細胞培養方法。
  14. 　更に、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、前記工程（ａ）～前記工程（ｄ）を繰り返す工程を有する請求項１３に記載の細胞培養方法。
  15. 　前記工程（ａ）において、細胞－細胞間結合及び細胞－細胞外マトリクス間結合を切断する酵素溶液を用いて細胞を分散させる請求項１３に記載の細胞培養方法。
  16. 　前記工程（ｂ）において、前記均一な大きさの細胞集塊は、１００～５００細胞からなる請求項１３に記載の細胞培養方法。
  17. 　前記細胞は、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である請求項１３に記載の細胞培養方法。
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