JP5407345B2 - 生体組織の作製方法 - Google Patents
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Description
培養容器に加えられた細胞に内底面方向への遠心力または磁力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
細胞培養工程において得られた組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含み、
細胞培養工程において磁力を作用させる場合には、細胞添加工程よりも前に行われる、細胞を磁性微粒子により磁性化する磁性化工程を更に含む、
組織の作製方法。
(3)作製しようとする組織の厚さ方向の細胞積層数に応じて培養液中の細胞数が調節されている、(1)または(2)の方法。
(4)培養容器の内底面に凹凸パターンが形成されている、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(6)凹凸パターンが、複数の島状の凸部と、該凸部の周囲に連続して形成された海状の凹部とを含み、
培養液中の細胞数が、作製される組織の厚さが前記凸部の高さを超えないように調節されている、(4)または(5)の方法。
(8)培養容器の内表面のうち細胞と接触する表面の全てが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である、(1)〜(7)のいずれかの方法。
(9)(1)〜(8)のいずれかの方法により製造された組織。
(11)厚さ方向に貫通した孔を有する、(10)の組織。
(12)細胞培養用の培養液と、細胞と、溶解または分散された状態の細胞外マトリクス成分とを含有する、組織を作製するための組成物。
(14)(12)または(13)の組成物と、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養容器とを要素として含む、組織作製用キット。
(15)培養容器の内表面のうち細胞と接触する表面の全てが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である、(14)のキット。
細胞からの組織培養では、細胞同士が密着し、細胞から分泌される細胞外マトリックスにより細胞同士が接着され、組織が形成される(図1)。細胞外マトリックスの培養細胞からの分泌には数時間〜数日の時間を要することが通常である。
細胞外マトリクスは細胞から調製される。細胞外マトリクスの調製に用いる細胞は、培養される細胞と同一の個体に由来する細胞であることが好ましい。最終的に製造される組織の生体成分が全て同一個体由来となるため、組織を移植するうえで安全性が高いためである。図2には本発明の方法で組織を作製し、患者に移植するまでの流れを示す。図2に示すように、一人の患者から細胞を採取して培養し、一方の培養物から細胞懸濁液を調製し、他方の培養物から細胞外マトリクス含有液を調製し、両者を用いて上述の細胞添加工程、細胞培養工程、および剥離工程を行って組織を作製し、得られた組織を上記患者に移植することが好ましい。
本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、MEM培地、BME培地、DME培地、αMEM培地、IMDM培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地およびRPMI1640培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」581頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清(ウシ胎児血清等)、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Gibco無血清培地(インビトロジェン社)等の市販の無血清培地等を用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養容器に、細胞と溶解または分散された状態の細胞外マトリクス成分とを含有する培養液を加える細胞添加工程と、
培養容器に加えられた細胞に内底面方向への遠心力または磁力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
細胞培養工程において得られた組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含み、
細胞培養工程において磁力を作用させる場合には、細胞添加工程よりも前に行われる、細胞を磁性微粒子により磁性化する磁性化工程を更に含むことを特徴とする。以下、上記各工程について説明する。
本発明で使用する培養容器は、細胞含有培養液を収容する容器部分の内表面のうち少なくとも内底面が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であればよいが、特に、細胞含有培養液を収容する容器部分の内表面のうち、細胞と接触する表面の全て(例えば容器の内底面および内側面)が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であることが好ましい。
細胞添加工程は、上記培養容器に、細胞と溶解または分散された状態の細胞外マトリクス成分とを含む培養液を加える工程である。培養容器への細胞外マトリクス成分と細胞の添加順序等は問わない。
細胞培養工程は、培養容器に加えられた細胞に内底面方向への遠心力または磁力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する工程である。図3Bがこの工程に対応する。本工程では、遠心力または磁力により細胞が内底面の形状に応じて内底面に密着した状態で、細胞同士が接着し、組織が形成される。このとき、人為的に添加された細胞外マトリクス成分の働きにより細胞間接着が更に加速される。
剥離工程は、遠心操作終了後または磁力解除後に、得られた組織を培養容器の内底面から剥離し回収する工程である。例えばピペッティング操作などの物理的な操作よって細胞を剥離することができる。培養容器の内底面が細胞非接着性表面であればこの操作は容易である。培養容器の内底面が刺激応答性高分子などの、細胞非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境(例えば下限臨界温度以下の温度)において剥離操作を行う。
培養容器の内底面には凹凸パターンが形成されていることが好ましい。この実施形態によれば、凹凸パターンを鋳型とした所望の三次元形状を有する生体組織が作製される(図5A〜C)。
1.遠心力による細胞シート作製
1−1.遠心力による細胞シート作製及び回収
底面の直径が2cmのガラスの容器の内表面の全体にポリエチレングリコールを化学的に付与することで内表面の全体を細胞非接着性にしておき、10%ウシ胎児血清入りDMEM培地で懸濁したマウス繊維芽細胞を4×106個含む細胞懸濁液2mlをその容器に播種し、遠心により底面方向に720Gの遠心力を作用させながら温度が37℃でCO2濃度が5%の環境で3時間培養した(図8A)。培養後に、遠心を止めてピペッティング等の物理的な力により組織構造を壊すことなく細胞シートを基材から容易かつ速やかに剥離回収することができた(図8B)。一方、遠心力をまったく作用させずにそれ以外は同じ培養を行ったところ細胞シートは作製できず、ピペッティングにより細胞同士が剥がれ組織構造が壊れてしまった。
1−1で回収した細胞シートを観察用の培養皿に移動させ観察したところ、細胞シートの直径は2cmで容器と同じ形状の細胞シートが得られていた(図9)。また細胞をカルセインにより染色し共焦点顕微鏡により断面観察したところ細胞シートの厚みは細胞3,4層程度であった(図10)。得られた細胞シートの細胞生存の有無を調べるために、細胞シートをトリプシン及びEDTAで処理することで細胞を分散させた後に、細胞生死アッセイキット(製品名:細胞二重染色キット、メーカー:同仁化学、製品番号:CS01)により細胞生存率を測定したところ、1−1で遠心力を作用する前の細胞生存率は90%であったのに対し、得られた細胞シートの細胞生存率も90%であった。この結果から、1−1の操作により細胞が死ぬことはほとんどないことが裏付けられた。
2−1.細胞外マトリクス含有液の作製
10cmポリスチレンシャーレに10%ウシ胎児血清入りDMEM培地を添加しマウス繊維芽細胞を培養し、細胞増殖させコンフルエントにすることで細胞に細胞外マトリクスを産生させた。続いて、増殖した細胞をセルスクレイパーによりすり潰し超音波処理により細胞を完全に破砕し、破砕物を遠心分離し、上澄みを回収した。上澄み液を細胞外マトリクス含有液として以下に使用した。
底面の直径が2cmのガラスの容器の内表面の全体にポリエチレングリコールを化学的に付与することで内表面の全体を細胞非接着性にしておき、2−1で作製した細胞外マトリクス含有液で懸濁したマウス繊維芽細胞を4×106個含む細胞懸濁液2mlをその容器に播種し、遠心により底面方向に720Gの遠心力を作用させながら温度が37℃でCO2濃度が5%の環境で1時間培養した(図11A)。培養後に、遠心を止めてピペッティング等の物理的な力により組織構造を壊すことなく細胞シートを基材から容易かつ速やかに剥離回収することができた(図11B)。一方、2−1で作製した細胞外マトリクス含有液の代わりに10%ウシ胎児血清入りDMEM培地を用いそれ以外は同じ手順により培養を行ったところ細胞シートは作製できず、ピペッティングにより細胞同士が剥がれ細胞シートが破れるなど組織構造が壊れた。
3−1.細胞非接着性で且つ凹凸形状の底面を有する培養容器
シリコンウェハ上にレジスト(商品名:SU-8、メーカー:MicroChem)を厚み200μmでコートし光リソグラフィーにより凹凸形状の鋳型を作り、その上部に3%アガロース溶液を流しゲル化させて鋳型から剥離することで200μm角の4角形部位が200μmピッチで高さ200μmで隆起している凹凸形状のアガロースゲルを作製した。作製されたアガロースゲルの凹凸パターンを図6に示す。このゲルを凹凸形状の面が上方に向くように、1−1で作製した内表面の全体が細胞非接着性の容器底面に設置することで、細胞非接着性で且つ凹凸形状の底面を有する培養容器を作製した(図12)。
10cmポリスチレンシャーレに10%ウシ胎児血清入りDMEM培地を添加しマウス繊維芽細胞を培養し、細胞増殖させコンフルエントにすることで細胞に細胞外マトリクスを産生させた後に、セルスクレイパーにより細胞をすり潰し超音波処理により細胞を完全に破砕し、破砕物を遠心分離し、上澄みを回収した。上澄み液を細胞外マトリクス含有液として以下に使用した。
3−1で作製した容器に、3−2で作製した細胞外マトリクス含有液で懸濁したマウス繊維芽細胞を10×106個含む細胞懸濁液2mlをその容器に播種し、遠心により底面方向に720Gの遠心力を作用させながら温度が37℃でCO2濃度が5%の環境で3時間培養した後に、遠心を止めてピペッティング等の物理的な力により組織構造を壊すことなく形状を維持したまま孔を有する細胞シートを基材から容易かつ速やかに剥離回収することができた(図13)。
3−3により作製した正方形200μm角で200μmピッチの孔を有する細胞シートを細胞培養用のポリスチレンディッシュに移し4日培養した後に、細胞シートをトリプシン及びEDTAで処理することで細胞を分散させ、細胞生死アッセイキット(製品名:細胞二重染色キット、メーカー:同仁化学、製品番号:CS01)により細胞生存率を測定したところ86%であった。また3−3において底面が平らな形状を有する培養容器を用いることで孔を有さない細胞シートを作製し、同様に4日培養した後に細胞生存率を測定すると70%であった。
上記3−1と同様の手順により、厚さ50μmのレジストの凹凸からなる鋳型を用いて、300μmピッチで、50μmの高さに隆起している幅200μmのラインが平行に複数形成された底面を有する容器を製造した。こうして製造された容器を用い、ラインパターンの凹溝部だけでなく凸条部天面も細胞に被覆されるように細胞密度を調整する点を除いて3−3と同じ方法により細胞シートを作製し、パターン形状を有する細胞シートを作製した(図14)。
Claims (12)
- 細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養容器に、細胞と溶解または分散された状態の細胞外マトリクス成分とを含有する培養液を加える細胞添加工程と、
培養容器に加えられた細胞に内底面方向への遠心力または磁力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する細胞培養工程と、
細胞培養工程において得られた組織を前記内底面から剥離し回収する剥離工程と
を含み、
細胞培養工程において磁力を作用させる場合には、細胞添加工程よりも前に行われる、細胞を磁性微粒子により磁性化する磁性化工程を更に含む、
組織の作製方法。 - 前記細胞外マトリクス成分が、培養される細胞と同一の個体に由来する細胞から調製された細胞外マトリクス成分である、請求項1の方法。
- 作製しようとする組織の厚さ方向の細胞積層数に応じて培養液中の細胞数が調節されている、請求項1または2の方法。
- 細胞培養工程が、培養容器に加えられた細胞に内底面方向への遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する工程である、請求項1〜3のいずれかの方法。
- 培養容器の内表面のうち細胞と接触する表面の全てが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である、請求項1〜4のいずれかの方法。
- 細胞添加工程の前に、増殖させた接着性動物細胞を破砕する工程を更に含み、
得られた破砕物と細胞とを含有する培養液を、細胞添加工程において加える、請求項1〜5のいずれかの方法。 - 請求項1〜6のいずれかの方法により製造された組織。
- 厚さ方向に複数の細胞が積層されている、請求項7の組織。
- 厚さ方向に貫通した孔を有する、請求項8の組織。
- 細胞培養用の培養液と、細胞と、溶解または分散された状態の細胞外マトリクス成分とを含有する、組織を作製するための組成物と、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する培養容器と、
を要素として含む、組織作製用キット。 - 培養容器の内表面のうち細胞と接触する表面の全てが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である、請求項10のキット。
- 前記細胞外マトリクス成分が、培養される細胞と同一の個体に由来する細胞から調製された細胞外マトリクス成分である、請求項10または11のキット。
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