CN109153958A - 细胞的立体结构体的制作装置及制作方法 - Google Patents

细胞的立体结构体的制作装置及制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞的立体结构体的制作装置及制作方法。通过不对细胞造成污染、损坏，并且对培养条件进行高精度调整，从而寻求制作一种用于形成具有所期望的大小、形状、结构的再生组织·再生脏器的立体结构体。本发明提供如下的装置以及使用了该装置的方法：基于从外部输入的与想要制作的立体结构体相关的信息，获取该立体结构体的制作条件，并基于该获取到的制作条件使细胞的培养容器产生磁场，并将磁化后的细胞提供给该产生了磁场的培养容器，对该被提供的细胞进行培养。

Description

细胞的立体结构体的制作装置及制作方法
技术领域
本发明涉及一种细胞的立体结构体的制作技术，特别涉及针对纳入了磁性体的球状(spheroid)细胞等的细胞，利用外部磁场进行细胞操作，从而制作细胞块等的任意形状的立体结构体的装置及方法。
背景技术
近年，伴随着再生医疗技术的发展，再生组织、再生脏器不仅用于研究用途，也寻求在临床中的治疗用途。
在专利文献1中说明了如下技术：对细胞(球状细胞等)进行操作，并在将球状细胞分别串刺于花插状针的状态下进行培养来形成任意形状的细胞块。
在专利文献2中说明了如下方法：使培养细胞的培养容器产生离心力，利用磁性粒子将细胞磁化，并从外部产生由磁体形成的磁力，从而将细胞间粘接以形成组织。
在专利文献3中说明了如下方法：将利用磁性粒子磁化后的细胞在通过磁体的磁力吸引于培养容器底面的状态下进行培养来形成多层化组织片。
现有技术文献
专利文献
专利文献1国际公开第2008/123614号
专利文献2日本专利特开2010－161954号公报
专利文献3国际公开第2004/083412号
发明内容
发明所要解决的技术问题
在利用从生物体处采集的细胞形成具有所期望的大小、形状、结构的再生组织·再生脏器的情况下，寻求不对细胞造成污染、损坏，并且能对培养条件进行高精度调整。
然而，在专利文献1的技术中，在细胞操作中，为了形成任意形状的细胞块，直接将细胞串刺于花插状的多个针，因此无法忽略对细胞造成损坏的影响，而且也有可能导致污染。
在专利文献2、3所记载的技术中，如上所述，利用来自外部的离心力、磁力来促进细胞和培养容器的粘接、细胞彼此间的粘接，因此无需直接接触细胞，从而能够降低污染、损坏的影响。但是，未考虑用于将再生组织·再生脏器形成为所期望的形状、大小的具体的培养方法。
本发明鉴于上述问题，涉及通过不对细胞造成污染、损坏，并且对培养条件进行高精度调整，从而实现形成具有所期望的大小、形状、结构的再生组织·再生脏器。
解决技术问题所采用的技术方案
作为用于解决上述问题的一个方式，提供一种装置以及使用该装置的方法，其特征在于，包括：培养容器，该培养容器配置有磁化后的细胞；磁场产生部，该磁场产生部使所述培养容器产生磁场；培养箱，该培养箱将所述培养容器收纳于内部，并使所述培养容器内保持在规定的温度；以及控制部，该控制部控制配置于所述培养容器内的细胞的培养条件，当由操作人员输入与想要制作的立体结构体相关的信息时，所述控制部基于该输入的信息，获取该立体结构体的制作条件，并基于该获取到的制作条件，进行控制以使所述磁场产生部产生磁场。
发明效果
根据上述的一个方式，通过不对细胞造成污染、损坏，并且对培养条件进行高精度调整，从而能够实现形成具有所期望的大小、形状、结构的再生组织·再生脏器。
附图说明
图1是表示本实施方式所涉及的制作细胞的立体结构体的装置的基本结构的图。
图2是表示本实施方式所涉及的磁场产生装置的基本结构的图。
图3是表示本实施方式(实施例1)所涉及的制作细胞的立体结构体的基本动作的流程图。
图4是表示本实施方式(实施例1)所涉及的磁场形成图案的示例的图。
图5是表示本实施方式(实施例1)所涉及的向培养容器投入细胞的动作的示例的图。
图6是表示本实施方式(实施例1)所涉及的单层细胞培养开始(定影前)时的状态(a)和培养后(定影)的状态(b)的情况的图。
图7是表示本实施方式(实施例1)所涉及的细胞多层化处理的情况的图。
图8是表示本实施方式(实施例2)所涉及的制作细胞的立体结构体的基本动作的流程图。
图9是表示本实施方式(实施例2)所涉及的向培养容器投入细胞的动作的图。
图10是表示本实施方式(实施例2)所涉及的使用摄像头确认细胞位置的示例的图。
图11是表示本实施方式(实施例2)所涉及的磁场形成图案的具体示例的图。
图12是表示本实施方式(实施例2)所涉及的单层或多层的细胞培养开始(定影前)时的状态(a)和培养后(定影)的状态(b)的情况的图。
图13是表示本实施方式(实施例3)所涉及的制作由直径不同的多个细胞构成的立体结构体的基本动作的流程图。
图14是表示本实施方式(实施例3)所涉及的细胞培养开始～定影的状态的情况的图。
图15是表示本实施方式(实施例4)所涉及的制作具有磁性颗粒去除步骤的细胞立体结构体的基本动作的流程图。
图16是表示本实施方式(实施例4)所涉及的制作具有磁性颗粒去除步骤的细胞立体结构体的基本动作的流程图。
图17是表示本实施方式(实施例4)所涉及的磁性颗粒去除步骤的详情的流程图。
图18是本实施方式所涉及的实施细胞立体结构体的制作条件的决定处理的功能框图。
图19是表示本实施方式所涉及的细胞立体结构体的制作图像的图。
图20是表示本实施方式(实施例1～3)所涉及的显示细胞立体结构体的信息的GUI画面的图。
图21是表示本实施方式(实施例4)所涉及的示出细胞立体结构体的信息的GUI画面的图。
具体实施方式
<装置的整体结构>
以下，针对本实施方式参照附图进行详细说明。另外，在全文中，用于说明本实施方式的各图中针对具有相同功能的各结构部分省略重复说明。
图1是表示本实施方式所涉及的制作细胞立体结构体的装置的基本结构的图。
本装置主要通过在培养箱101内包括培养容器103、臂部102、磁场产生装置104、摄像头105而构成。在培养箱101的外部由磁场处理引擎106、臂部处理引擎107、图像处理引擎108、数据总线109、控制部110、显示部111、输入部112构成。培养箱101能够调节内部的温度、氧浓度、二氧化碳浓度。摄像头105为了拍摄到清楚的图像，优选设置于培养箱101内，但是在内部的温度、氧浓度、二氧化碳浓度不适合于拍摄的情况下，或者为了降低污染的风险，也可设置于培养箱101外。
另外在全文中，控制部110对培养箱101内的环境条件的调整、臂部102的动作、由磁场产生装置104进行的磁场产生条件的调整、由摄像头105进行的拍摄动作、拍摄条件的调整等这些构成本装置的种种的各种机构的动作、条件设定·调整等实施控制。控制部110经由数据总线109与磁场处理引擎106、臂部处理引擎107、图像处理引擎108之间进行信息交换，从而能够向各种机构发送指令，获取从各种机构获得的信号、画像等数据。另外，获取·存储与细胞培养条件相关的各种数据、经由键盘、鼠标等的输入部112由操作人员输入的指示等的信息，并执行求出后文中阐述的细胞立体结构体的制作条件的运算处理，从而能够将这些信息显示于显示图形用户界面(GUI)等的显示部111上。另外，虽然在本图中控制部110与各个结构部相连接，并设为控制本装置整体，但也可以构成为对于每个结构部包括各自独立的控制部。
接着，针对上述的磁场产生装置104的结构使用图2进行更详细的说明。
图2是表示本实施方式所涉及的磁场产生装置的基本结构的图。施加磁场的方式有(2a)所示出的在确定的位置以束点施加磁场的方式、以及(2b)所示出的在整个规定的区域施加面状的磁场的方式。(2a)所示出的方式其特征在于，电磁体201中包括X轴可动调节机构202和Y轴可动调节机构203。利用X轴可动调节机构202和Y轴可动调节机构203，能够使得XY面内的电磁体201的位置自由地变化。(2b)方式中，通过在XY面内包括多个电磁体201，从而能够向配置于所期望的区域内的电磁体201施加磁力。这里，虽然对于电磁体201的尺寸并不限定，但是在(2a)所示出的方式和(2b)所示出的方式的任一方式中，利用电磁体201对纳入磁性体而磁化后的细胞(以下，有时仅称为磁化细胞)进行操作，因此为了提高细胞操作时的位置正确性，电磁体201的尺寸优选选择较小的。另外，至少电磁体201的直径比磁性体细胞的直径要小的话，其细胞操作时的位置正确性较高，从而能够提高细胞的立体结构体的再现度。
这里，图18是本实施方式所涉及的实施细胞的立体结构体的制作条件决定处理的功能框图。操作人员在如图1所示出的输入部112中从细胞立体结构信息输入部1801输入想要制作的所期望的立体结构体的信息(形状图像、大小、厚度等)时，制作条件获取部1802基于输入的信息、以及存储于数据库1807中的信息(与细胞种类相对应的粘接条件等的特性、到制作为止的时间限制、磁性颗粒的种类、其特性等的种种信息)来求出最合适的立体结构体的制作条件。此后，为了基于求出的条件开始制作动作，机构控制部1803向图像处理引擎1804、臂部处理引擎1805、磁场处理引擎1806发送指示信号。
这里，图19是表示本实施方式所涉及的细胞的立体结构体的制作图像的图。如本图所示，操作人员能够在视觉上确认显示部111的GUI中所显示的X－Z平面1901、Y－Z平面1902、X－Y平面1903、以及XYZ空间1904中的细胞的立体结构体的图像，另外，通过调节1901～1903的各平面中横轴、纵轴的长度从而能够设计出所期望的大小、厚度的立体结构体的图像。这里，在本实施方式中针对在X－Z平面1901、Y－Z平面1902、X－Y平面1903的所有的平面、以及XYZ空间1904中显示立体结构体的制作图像的情况进行了说明，但也能够有选择地显示上述中的任一个。
实施例1
接着，使用图3～图7、以及图20针对利用上述装置来制作细胞的立体结构体进行说明。
图3是表示本实施方式所涉及的制作细胞的立体结构体的基本动作的流程图，图4是表示本实施方式所涉及的磁场形成图案的示例的图。
首先，磁场产生装置104中，基于图4中的细胞块的目标形状(形状图案)402，施加设定为与该形状相近似的磁场施加图案403(步骤S301)。本实施方式中磁场产生装置104采用(2b)所示出的在整个规定区域施加面状的磁场的方式。
施加磁场时，仅对于与细胞块的目标形状(形状图案)402相近似地设定的磁场施加图案403的区域中包含的部分的电磁体201，经由磁场处理引擎106进行施加。该情况下的电磁体201优选为能够根据电流值来控制与面垂直的磁通的螺线管线圈。
接着，将纳入了磁性颗粒等磁性体的磁化细胞按单层细胞片的构成细胞数投入至培养容器103内(步骤S302)。这里，图5中示出向培养容器投入细胞的动作的示例。这里，如图5(a)所示，示出了将在孔板502内培养的各个球状细胞507经由臂部501向培养容器503内投入的方法。为了提高单层细胞片的再现性，优选在孔板502内培养的各个球状细胞507的细胞直径尽可能相同。此时，为了力图降低对细胞的损坏，也可将在孔板502内培养的各个球状细胞507逐个可靠地转移至培养容器503。另外，为了提高投入的效率，也可在喷嘴508的一次吸引动作中，将多个球状细胞507投入至培养容器503内。在步骤S302中，在球状细胞507中纳入了磁性体的情况下，也可将电磁体201设置于喷嘴508的前端，利用磁场对球状细胞507进行操作并投入至培养容器503内。或者如图5(b)所示，也可将所培养的球状细胞507按单层细胞片的构成细胞数收集至如离心管504那样的容器中，并使用离心管504所具备的管505和阀506将对于形成细胞块的目标形状402最合适的细胞数投入至培养容器503内。在此情况下，也可对于包含大量的球状细胞507的离心管504通过离心分离、或者在球状细胞507中纳入了磁性体的情况下通过外部磁场，使得球状细胞507凝集于离心管504的底部后进行投入处理，以使得在短时间内完成投入。
接着，对投入至培养容器103内的细胞进行培养并进行定影(步骤S303)。这里，图6表示本实施方式所涉及的单层细胞培养开始(定影前)时的状态(a)和培养后(定影)的状态(b)的情况。根据步骤S301中施加了的磁场图案403，将纳入了磁性体的细胞配置为单层状。若在培养箱101内施加最合适的温度、氧浓度、二氧化碳浓度，则如图6(a)所示配置为单层状的细胞601如图6(b)所示，各个球状细胞进行融合·定影，从而形成单层细胞片602。
接着，在步骤S304中，针对变换成单层的细胞片605，判断是否形成有为了制作目标的3维状的细胞块所需的所有片数(步骤S304)。这里，在未形成所需要的所有片数的情况下，再次重复步骤S301、S302，从而形成所需量的单层细胞片。
在形成了所需量的所有单层细胞片的情况下，接着进入多层化处理(步骤S305)。这里，图7表示本实施方式所涉及的细胞的多层化的处理的情况。如图7(a)所示，对所述步骤S304中形成的所有单层细胞片进行多层化配置709(步骤S701)，并在培养箱101内施加最适合的温度、氧浓度、二氧化碳浓度并进行培养(步骤S702)时，各个单层细胞片进行融合·定影，从而形成目标的细胞块710(步骤S703)。这里，多层化操作的方法有使用臂部501对各单层细胞片进行层叠的方法。另外，将所述步骤S304中形成的所有单层细胞片配置于准备了与单层细胞片的数量相当数量的独立的培养容器103、或一个培养容器103内的其他空间。因此，图7(a)的方法需要具有较大的面积或者体积的培养容器103，必然会导致制作装置的尺寸会变大。因此，有图7(b)的方法，其中作为最低限度，若存在与1枚单层细胞片相当的面积的培养容器103，则能够进行多层化。如图7(b)那样，在培养容器103内，在步骤S303中形成的单层细胞片712上，利用磁场产生装置104施加新层的磁场图案，并如图5所示对细胞进行投入，从而使新的细胞层磁场配置为单层细胞片状(步骤S704)。接着，若在培养箱101内施加最适合的温度、氧浓度、二氧化碳浓度并进行培养(步骤S705)，则第2层的细胞片进行融合·定影从而形成2层份的细胞块713(步骤S706)。重复上述步骤S704、S705、S706，从而能够以与利用图7(a)的方法所形成的细胞块相同的形状来形成。另外，图7(b)的方法中中，作为最低限度，若存在与1枚单层细胞片相当的面积的培养容器103，则能够多层化，因此能够进一步使制作装置小型化。
这里，图20是表示本实施方式所涉及的显示细胞的立体结构体的信息的GUI画面的图。形状图像显示部2001显示利用图19中所述的方法来设计的细胞的立体结构体的形状的图像。另外，操作人员能够从成形条件输入部2002输入与想要制作的立体结构体的目的、适用的组织相对应地决定的使用细胞名、成形方式(单层定影方式、单细胞定影方式等)、成形模式(短时间模式、形状高再现模式等)等的条件。并且，最优成形条件显示部2003中，显示通过图18中所述的制作条件获取部1802求出的最合适的条件，在根据该条件开始成形处理的情况下，操作人员能够通过表示为「以上述条件成形」的输入按钮指示处理的开始。
另外，通过本GUI画面进行的立体结构体的制作条件的输入和确认也能够适用于后文阐述的实施例2以及实施例3。
实施例2
上述实施例1中，针对细胞投入是向培养容器103一次投入单层细胞片的构成细胞数进行了说明(步骤S302)。接着，在本实施方式中，为了进一步提高单层细胞片的再现性，使用图8～图12针对利用了将细胞逐个投入至培养容器103的技术来制作细胞的立体结构体进行说明。
图8是表示本实施方式所涉及的制作细胞的立体结构体的基本动作的流程图。首先，向培养容器103逐个投入细胞(步骤S801)。此时，如上所述基于由操作人员输入的信息，为了制作所期望的立体结构体，控制部设定培养容器103中细胞要被配置的目标位置，并使细胞移动至该目标位置。本实施方式中磁场产生装置104使用X轴可动调节机构202、Y轴可动调节机构203使电磁体201向目标位置移动，并采用(2a)所示出的在确定的位置以束点施加磁场的方式。
这里，图9表示本实施方式所涉及的向培养容器投入细胞的动作。如图9(a)所示，存在有将在孔板902内培养的各个球状细胞904经由臂部901向培养容器903内投入的方法。
为了提高细胞块的再现性，优选在孔板902内培养的各个球状细胞904的细胞直径尽可能相同。在步骤S801的时刻，在使球状细胞904纳入了磁性体的情况下，也可将电磁体设置于喷嘴907的前端，利用磁场对球状细胞904进行操作并投入至培养容器903内。或者，如图9(b)所示，存在有将孔板902内培养的各个球状细胞904通过与孔板902相连接的管905和阀906投入至培养容器903的方法。在该方法中，将投入的细胞在为了制作立体结构体而要被配置的目的位置(目标位置)处进行定影，并利用摄像头105对其进行确认后，打开细胞的阀906，从而能够进行细胞投入。由此，在投入细胞时，由于没有如臂部901那样的接触物，因此能够使污染的风险成为最小限度地来进行细胞投入。
接着，掌握投入后的细胞的位置(步骤S802)。这里，图10表示本实施方式所涉及的使用摄像头对细胞的位置进行确认的示例。图10(a)所示的方法中，使用摄像头1001和照明板1002，通过利用摄像头1001对由照明板1002得到的反射光进行拍摄从而能够测定相对于培养容器1003的相对的细胞1009的位置。这里，为了使培养容器1003的面和摄像头1001间的晕光的影响成为最小限度，优选如图10(a)所示使用2枚照明板1002a、b。
另外，图10(b)所示出的方法中，为了掌握细胞位置，将细胞1009用荧光色素染色，并在培养容器1003内使用激光等的单色光源1007以作为激励光，通过利用可移动反射镜1004使激励光源在培养容器1003内扫描，从而能够利用摄像头1001测定发出荧光的细胞1009的位置。该方法中，通过可移动反射镜1004进行光源的三维扫描，因此通过使用适当的销孔1006和透镜1005使激励光源处于共焦系统对于掌握细胞位置是有效的。
在图10(a)、(b)所示出的方法中，由于需要在培养容器1003内的三维空间中检测出细胞位置，因此将摄像头1001设置于X、Y、Z方向等的3方向上对于更高精度的掌握细胞位置是有效的。另外，在摄像头1001和培养容器1003的相对位置变化时，通过进行相对位置的校准，从而能够使细胞位置的变动成为最小限度。具体而言，例如，在培养容器1003内在细胞培养的过程中使用以惰性物质来决定绝对位置的校准仪，基于与由该校准仪的摄像头1001得到的测定值的真值之间的偏离量来决定校正系数，从而能够进行摄像头1001的位置校准。
接着，通过施加磁场对细胞进行操作(步骤S803),利用摄像头1001对细胞位置进行测定(步骤S804)，并且对测定细胞的位置是否在目标位置存在有细胞进行判定(步骤S805)。
这里，图11中表示本实施方式所涉及的磁场形成图案的具体示例。图11(a)示出利用由培养容器1101外的磁场产生装置1102产生的磁场，用于将培养容器1101内的细胞1103移动至到达地点1104的操作的示例。一般而言，磁场产生装置1102使用可利用电流自由控制磁场的电磁体201，其中代表性的螺线管线圈所产生的磁场H能够以(1)式:H＝n·I(n:线圈匝数、I:电流值)来表示。接着，磁场H中，放置m[Wb]的磁极时产生的力F[N]能够表示为(2式)：F＝m·H。
若将上述2式进行组合，则能够表示为(3式)：F＝m·n·I，对于纳入了m[Wb]的磁性体的细胞能够用电流值施加外力。接着，若对质量M[kg]的物质作用F[N]的力，则加速度a[m/s＾2]能够表示为(4式)a＝F/M。并且，初速度为0以加速度a[m/s＾2]移动的物体的t[s]后的位移x能够表示为(5式)x＝(1/2)·a·(t)＾2，通过(3式)、(4式)、(5式)，能够以(6式)x＝(m·n/2M)·I·t＾2来表示。这里，通过(6式)，纳入了磁性体的细胞不仅能够利用电流值和施加时间来控制位移，而且能够计算出细胞至到达地点为止的最优电流值和最优施加时间。
另外，如图11(b)所示，通过以脉冲方式施加电流，每隔一定的距离利用外部磁场对细胞进行控制(步骤S803)，并且利用摄像头1001确认细胞位置(步骤S804)，从而基于测定细胞位置，能够再次进行细胞操作(步骤S805)。另外，在步骤S804中，在根据摄像头1001的拍摄结果判断为相对于至到达地点1004为止的距离若采用该时刻之前所使用的电流值的每1个脉冲的移动距离则过大的情况下，调整条件以使得下次之后的细胞移动中的电流值下降，从而能够进一步减少每1个脉冲的移动距离来进行操作，能够可靠地移动至到达地点1004。
接着，在步骤S804中，如图11(c)所示，在判断为每1个脉冲的移动量超过了到达地点1004的情况下，通过在下一次的细胞操作中使流过螺线管线圈的电流值反转，从而能够使磁场的方向反转并使其移动至到达地点1004。如本实施方式，由于需要将纳入了磁性体的细胞1103在培养容器1101内进行三维操作，因此将磁场产生装置1102设置于X、Y、Z方向等的3个方向对于更高精度的细胞操作是优选的。
接着，对投入至培养容器103内的细胞进行培养并进行定影(步骤S806)。这里，图12表示本实施方式所涉及的单层或多层细胞培养开始(定影前)时的状态(a)和培养后(定影)的状态(b)的情况。本实施方式中，对细胞逐个进行操作，此时对于细胞块的目标形状1208，有如图12(a)示出的从端部开始使细胞进行定影的方法、以及如图12(b)示出的从中央开始使细胞进行定影的方法。
图12(a)所示出的方法中，对于虽然是单纯的组织但想要使形状最优先这样的再生组织的情况等是有用的。另外，图12(b)所示出的方法中，对于想要使脏器等的内部功能最优先这样的再生脏器的情况等是有用的。在图12(a)、(b)所示出的任意的方法中，细胞定影的顺序也可如实施例1中所述的那样按逐个细胞形成单层细胞片，接着形成上层的单层细胞片，或者也可从开始就形成三维状的细胞块并以该细胞块为核心，从而以核心为中心来形成。由此，优选对应于想要制作的细胞的立体结构体的条件来采用最合适的方法。
实施例3
上述的实施例1、2中示出了针对使用细胞的细胞直径相同的情况的制作细胞的立体结构体的示例。但是，为了提高由细胞的立体结构体所形成的脏器形状的再现性，需要使用直径不同的几个细胞。本实施方式中，针对由直径不同的多个细胞构成的立体结构体的制作，使用图13、图14进行说明。
图13是表示本实施方式所涉及的制作由不同直径的多个细胞组成的立体结构体的基本动作的流程图，图14是表示本实施方式所涉及的细胞的培养开始～定影状态的情况的图。
首先，在步骤S1401中，对培养容器103内(步骤S1301)进行拍摄，根据拍摄结果提取出细胞块的目标形状和前一步骤之前所定影的细胞块的图像。基于提取出的结果，计算出下一步骤中需要的细胞直径(步骤S1302)。
接着，在步骤S1402中，将在步骤S1302中所决定的细胞直径的细胞投入至培养容器103内。接着在步骤S1403中，对培养容器103内进行拍摄(步骤S1304)，与实施例2相同地重复进行利用摄像头1001的拍摄和细胞的磁场操作(步骤S1304、S1305、S1306)，通过在目标位置对细胞进行操作并进行定影从而形成细胞块。
根据本实施方式，能够在同种细胞中占据较大体积的部位通过使用较大直径的细胞从而大幅缩短形成细胞块所需的时间。另外，能够在复杂的形状部位通过使用较小直径的细胞从而提高细胞块的形状再现性。
实施例4
上述的实施方式中，对于磁化细胞，制作细胞的立体结构体而无需去除磁性体。根据细胞的种类、磁性体，由于细胞自身的代谢能够自然地将所纳入的磁性体排出，因此在这种情况下，考虑到即使不进行磁性体的去除处理，也没有由于磁性体而产生的影响。然而，由于细胞的种类、磁性体的种类、以及细胞的大小，有时磁性体的自然排出不充分。另外，根据细胞块的用途，在作为用于临床用等的体内移植来使用的情形下，有时需要可靠地去除磁性体。在这种情况下，需要利用外部操作来可靠地去除细胞内的磁性体。
在本实施方式中，上述的实施例1、实施例2中，针对包括了使用纳入了磁性体的细胞来形成立体结构体之后，去除细胞内磁性体的工序的方式使用图15～图17、以及图21进行说明。
图15、图16分别是示出实施例1、实施例2中上述的细胞的立体结构体的制作中，增加了本实施方式所涉及的磁性颗粒去除步骤的方式的基本动作的流程图。在图15的流程图中，在形成单层细胞片后(步骤S1503)，对磁性体进行去除操作(步骤S1504)。另外，在图16的流程图中，在对1个细胞进行定影后(步骤S1608)，对磁性体进行去除操作(步骤S1609)。
图17是表示本实施方式所涉及的磁性颗粒的去除步骤的详情的流程图。
首先，通过摄像头1001来测定细胞片的厚度或者细胞的直径。这里，在运用实施例1的情况下对细胞片的厚度进行测定，在运用实施例2的情况下对细胞直径进行测定(步骤S1701)。在去除磁性体的操作中，在使用于促进磁性体排出的代谢活性因子等作用于细胞时，若细胞片的厚度或细胞直径较大则这些活性因子难以到达至中心部的细胞。因此，本步骤中通过获取这些信息，从而能够使用于使活性因子可靠地到达中心部的各种条件(温度、时间等)设定最优化。
接着，基于在步骤1701中所测定的细胞直径或细胞片的厚度的信息，考虑细胞种类、磁性体的种类，求出用于去除磁性体的条件(温度、时间等)(步骤S1702)。
接着利用在步骤S1702中所决定的磁性体去除条件，使代谢活性因子等作用于细胞并去除磁性体(步骤S1703)。
此后，在步骤1704中，对是否通过步骤1703的去除处理可靠地去除了磁性体进行判断(步骤S1704)。这里，具体而言，预先在培养容器103内配置几个单细胞以作为控制，相对于该控制通过摄像头1001测定利用磁场产生装置104产生外部磁场时的细胞位置，从而能够判定是否去除了磁性粒子。通过进行以上的去除操作，从而能够可靠地去除磁性体，在任何情况下都能够制作保证了高安全性的立体结构体。
这里，图21是表示本实施方式所涉及的示出细胞的立体结构体的信息的GUI画面的图。
本图中，形状图像显示部2101、成形条件输入部2102、最优成形条件显示部2103分别与图20中所述的结构相同，本实施方式中由于包含了去除磁性体的工序，因此还包括：磁性颗粒条件输入部2012-1，该磁性颗粒条件输入部2012-1输入为了设定此时的去除条件所需要的信息；以及脱磁性颗粒条件显示部2103-1，该脱磁性颗粒条件显示部2103-1显示基于所输入的信息求出的去除的条件。
由此，根据上述的本实施方式，能够通过不对细胞造成污染、损坏，并且对培养条件进行高精度调整，从而实现形成具有所期望的大小、形状、结构的再生组织·再生脏器。
另外，本发明并不限于上述的实施方式，还包含各种各样的变形例。例如，所述的实施方式是为了便于理解本发明而进行的详细说明，并不一定限于要具备所说明的所有结构。另外，可以将某个实施方式的结构的一部分替换成其它实施方式的结构，此外，还可以对某个实施方式的结构增加其他实施方式的结构。另外，关于各实施方式结构的一部分，也可以进行其它结构的增加、删除、替换。
标号说明
101 培养箱
102 臂部
103 培养容器
104 磁场产生装置
105 摄像头
106 磁场处理引擎
107 臂部处理引擎
108 图像处理引擎
109 数据总线
110 控制部
111 显示部
112 输入部
201 电磁体
202 X轴可动调节机构
203 Y轴可动调节机构
401 外部磁场产生装置
402 细胞块的目标形状(形状图案)
403 磁场施加图案
501 臂部
502 孔板
503 培养容器
504 离心管
505 管
506 阀
507 细胞
508 喷嘴
601 配置为单层状的细胞
602 培养后形成的细胞片
709 多层化配置的单层细胞片
710 培养后形成的细胞块
711 单层片上配置了磁场的细胞层
712 单层细胞片
713 2层份的细胞片
901 臂部
902 孔板
903 培养容器
904 细胞
905 管
906 阀
907 喷嘴
1001 摄像头
1002 照明板
1003 培养容器
1004 可移动反射镜
1005 透镜
1006 销孔
1007 单色光源
1008 彩色滤光片
1009 细胞
1010 激励光光线
1011 荧光光线
1101 培养容器
1102 磁场产生装置
1103 纳入了磁性体的细胞
1104 细胞操作的到达地点
1206 纳入了磁性体的细胞
1207 细胞操作的到达地点
1208 细胞块的目标形状
1209 形成的细胞块
1801 细胞立体结构信息输入部
1802 制作条件获取部
1803 机构控制部
1804 图像处理引擎
1805 臂部处理引擎
1806 磁场处理引擎
1807 数据库
1901 X-Z平面中的输入形状图像
1902 Y-Z平面中的输入形状图像
1903 X-Y平面中的输入形状图像
1904 XYZ空间中的输入形状图像
2001、2101 形状图像显示部
2002、2102 成形条件输入部
2102－1 磁性颗粒条件输入部
2003、2103 最优成形条件显示部
2103－1 脱磁性颗粒条件显示部

Claims (14)

1.一种立体结构体制作装置，制作细胞的立体结构体，包括：
培养容器，该培养容器配置有磁化后的细胞；
磁场产生部，该磁场产生部使所述培养容器产生磁场；
培养箱，该培养箱将所述培养容器收纳于内部，并使所述培养容器内保持在规定的温度；以及
控制部，该控制部控制配置于所述培养容器内的细胞的培养条件，
所述立体结构体制作装置的特征在于，
包括输入部，该输入部由操作人员输入与想要制作的立体结构体相关的信息，
所述控制部
基于该输入的信息，获取该立体结构体的制作条件，
基于该获取到的制作条件，进行控制以使所述磁场产生部产生磁场。
2.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
所述磁场产生部通过配置多个电磁体而构成，
所述控制部
基于该输入的信息，获取该立体结构体的形状图案，
基于该获取到的形状图案，进行控制以使该磁场产生部中的多个电磁体中配置于规定区域内的电磁体选择性地产生磁场。
3.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
所述磁场产生部具有产生磁场的电磁体、以及使所述电磁体的位置移动的移动机构，
所述控制部
基于该输入的信息，设定要配置磁化后的细胞的目标位置，
基于该设定的目标位置，进行控制以使得移动所述电磁体的位置。
4.如权利要求3所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
具有拍摄部，该拍摄部对配置于所述培养容器内的细胞进行拍摄，
所述控制部基于由所述拍摄部拍摄到的信息，对所述电磁体的位置的移动进行控制以使得所述细胞的位置接近所述目标位置。
5.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
包括显示部，该显示部显示由该控制部获取到的制作条件。
6.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
所述控制部基于该输入的信息，获取要制作的立体结构体的形状图像，
包括显示部，该显示部显示由该控制部获取到的形状图像。
7.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
所述输入部能够输入与该磁化后的细胞所使用的磁性体相关的信息，
所述控制部基于该输入的与磁性体相关的信息，获取在该立体结构体的制作中与磁性体的去除相关的条件。
8.如权利要求1所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
包括臂部，该臂部将磁化后的细胞投入至所述培养容器内，
所述控制部基于该获取到的制作条件，对所述臂部的动作进行控制以使得对所述细胞进行投入。
9.如权利要求6所述的立体结构体制作装置，其特征在于，
所述显示部将所述要制作的立体结构体的形状图像在X-Y平面、X-Z平面、Y-Z平面、以及XYZ空间中的至少任一个中进行显示。
10.一种立体结构体制作方法，是细胞的立体结构体制作方法，其特征在于，具有：
基于从外部输入的与想要制作的立体结构体相关的信息，获取该立体结构体的制作条件的步骤；
基于该获取到的制作条件，使细胞的培养容器产生磁场的步骤；
将磁化后的细胞提供给该产生了磁场的培养容器的步骤；以及
对该被提供的细胞进行培养的步骤。
11.如权利要求10所述的立体结构体制作方法，其特征在于，
该立体结构体的制作条件包含该立体结构体的形状图案，
基于该获取到的形状图案，使细胞的培养容器中的规定的区域选择性地产生磁场。
12.如权利要求10所述的立体结构体制作方法，其特征在于，
该立体结构体的制作条件包含所述培养容器中要配置该被提供的磁化后的细胞的目标位置，
基于该获取到的目标位置，可移动地设定所述培养容器中磁场的产生位置。
13.如权利要求12所述的立体结构体制作方法，其特征在于，
具有对配置于该培养容器内的细胞进行拍摄的步骤，
基于该拍摄到的信息，使所述磁场的产生位置进行移动以使得所述细胞的位置接近所述目标位置。
14.如权利要求10所述的立体结构体制作方法，其特征在于，
所述与想要制作的立体结构体相关的信息包含与该磁化后的细胞所使用的磁性体相关的信息，
具有基于与该磁性体相关的信息，获取该立体结构体的制作过程中与磁性体的去除相关的条件，并基于该获取到的条件来去除磁性体的步骤。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109070044B (zh) * 2016-07-21 2021-07-30 宝生物工程（美国)有限公司 使用多孔装置进行的多z平面成像和分配
EP3534834A4 (en) 2016-11-03 2020-05-13 Arizona Board of Regents on behalf of the University of Arizona Encapsulation device systems with oxygen sensors with or without exogenous oxygen supply
AU2017396754B2 (en) * 2016-11-03 2021-08-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods and systems for real-time assessment of cells in encapsulation devices pre-and post-transplantation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259568A (zh) * 1998-11-05 2000-07-12 华西医科大学附属第一医院 复合场三维细胞培养装置
CN1697876A (zh) * 2002-01-15 2005-11-16 奥古斯丁纳斯·巴德 用于在箱式容器内培植或培养细胞的装置
CN1788080A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 株式会社日本组织工程 细胞培养方法及培养的组织
CN104403923A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 南京卡迪奥密生物技术有限公司 三维组织器官培养模型及其高通量自动化立体图像分析平台及其应用
CN104726332A (zh) * 2015-03-05 2015-06-24 西安交通大学 一种类脑组织体外打印培养系统及方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285412B2 (en) * 2001-07-27 2007-10-23 Surface Logix Inc. Device for magnetic immobilization of cells
WO2005003332A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-13 University Of South Florida Diamagnetically stabilised three-dimensional cell culture
WO2007116594A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-18 National University Corporation Nagoya University 細胞構造体の形成方法
WO2008123614A1 (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Kyushu University, National University Corporation 細胞の立体構造体の製造方法
ES2707852T3 (es) * 2008-09-25 2019-04-05 Univ Texas Sistemas y métodos para el guiado magnético y diseño (patterning) de células y materiales
WO2013019212A1 (en) * 2011-08-02 2013-02-07 Nano3D Biosciences, Inc. Hardware for magnetic 3d culture
JP5407345B2 (ja) * 2009-01-13 2014-02-05 大日本印刷株式会社 生体組織の作製方法
WO2011091233A1 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 Global Cell Solutions, Llc Culture vessel and method of growing cells in culture vessel
WO2013145283A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 株式会社日立製作所 細胞培養装置、制御装置、及び方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259568A (zh) * 1998-11-05 2000-07-12 华西医科大学附属第一医院 复合场三维细胞培养装置
CN1697876A (zh) * 2002-01-15 2005-11-16 奥古斯丁纳斯·巴德 用于在箱式容器内培植或培养细胞的装置
CN1788080A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 株式会社日本组织工程 细胞培养方法及培养的组织
CN104403923A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 南京卡迪奥密生物技术有限公司 三维组织器官培养模型及其高通量自动化立体图像分析平台及其应用
CN104726332A (zh) * 2015-03-05 2015-06-24 西安交通大学 一种类脑组织体外打印培养系统及方法

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