CN1788080A

CN1788080A - 细胞培养方法及培养的组织

Info

Publication number: CN1788080A
Application number: CNA2004800128546A
Authority: CN
Inventors: 本多裕之; 井藤彰; 小林猛; 上田实; 各务秀明; 畠贤一郎
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Priority date: 2003-05-14
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2006-06-14
Also published as: JP4322253B2; US20060121606A1; JPWO2004101774A1; EP1624054A4; WO2004101774A1; EP1624054A1

Abstract

一种细胞培养方法，包括在培养基材的培养面上制备第1细胞，第1细胞为单层或多层化的黏着依赖性细胞；将第2细胞接种到第1细胞上，第2细胞为黏着依赖性的通过保持磁性微粒子而被磁性化了的细胞；通过磁力将第2细胞诱导到第1细胞的指定位置，在通过磁场诱导步骤而得的细胞排列状态下培养第1细胞和第2细胞。按照该细胞培养方法，可在单独制备细胞片后，不需改变温度使之剥离，积层单层细胞片，就能使细胞多层化。

Description

细胞培养方法及培养的组织

技术领域

本发明涉及细胞培养方法以及所培养的组织。

背景技术

近年，随着组织步骤学的发展，许多培养组织可以体外再构建。例如，已知有由表皮细胞等单一细胞二维构成的组织结构比较单纯的培养组织，及以凝胶、海绵等为支架(Scaffold)保持软骨细胞、成纤维细胞而形成的培养软骨、培养表皮等具有三维结构的培养组织。

但是，通过组织步骤学技术构建具有复杂结构和功能的脏器，即心脏、肝脏、肾脏、脑等还仍有许多问题，目前盛行着各种研究。血管和脏器由多种不同的细胞构成，为了在体外构建，就有必要将多种不同的细胞放置到各自最适的位置。但是，有人指出在体外环境中，各种不同种类的细胞之间彼此之间不相互依附，也有表明其不能充分发挥其功能(Journal of Biomedical Materials Research，1999；45：p355-362(美国))。另一方面，有人设计出一种构建三维培养组织的方法，即应用铺设了温度感应性聚合体的培养容器，高密度培养细胞，使之形成细胞片，然后不用酶处理而通过改变环境温度获得细胞片，积层不同细胞种类的细胞片(Journal of Biomedical Materials Research，2002；62：p464-470(美国))。

发明内容

应用上述温度感应性聚合体的细胞片的多层化中，有必要在制备单层细胞后，通过变化温度而剥离之，积层单层细胞片，该方法非常复杂，而且作为多种不同三维培养组织的构建方法可操作性差。另外，通过变化温度获得细胞片费时又费力，而且单层细胞片的操作很困难。此外，在三维培养组织的构建当中，不仅细胞粘附而且其定位也重要。

鉴于上述问题，本发明的目的之一是提供一种可获得多层细胞的细胞培养方法，它不需要单独地制备、剥离细胞片或积层。另外，本发明的一个目的是提供一种不需要大大改变温度的细胞多层化的细胞培养方法。此外，本发明的目的之一是提供一种可简便构建三维形状的培养组织的细胞培养方法。再者，提供新型的培养组织也是本发明的目的之一。

为了至少实现一种上述目的，本发明采用了以下手段。也就是说，本发明提供一种细胞培养方法，包括：在培养基材的培养面上制备第1细胞的制备步骤，第1细胞为黏着依赖性细胞，单层或多层；将第2细胞接种到第1细胞上的接种步骤，第2细胞为黏着依赖性的磁性化细胞；通过磁力将第2细胞吸引到第1细胞指定位置的磁场诱导步骤；在通过磁场诱导步骤而得到的细胞排列状态下培养第1细胞和第2细胞的培养步骤。另外，本发明还提供一种细胞培养方法，包括：在培养基材的培养面上制备第1细胞的制备步骤，所述第1细胞为黏着依赖性细胞，单层或多层；将第2细胞接种到第1细胞上的接种步骤，所述第2细胞为黏着依赖性的磁性化细胞；通过磁力将第2细胞吸引到第1细胞指定位置的磁场诱导步骤。

其中，任何一种细胞培养方法中，优选第2细胞在单层或多层化的状态下接种；还优选在上述制备步骤中包括将第1细胞培养到形成单层或多层化的细胞片的培养步骤。另外，优选上述制备步骤中包括通过磁力将磁性化的第1细胞吸引到培养基材的培养面上的磁场诱导步骤；优选培养第1细胞和第2细胞的培养基材是盘状体、管状体、具有中空部的封套状体、柱状体、皿状体及球状体中的任一种。此外，优选培养基材的培养面是细胞非粘附性的。第1细胞和第2细胞，可以是不同种类细胞的组合，尤其是肝实质细胞与血管内皮细胞、成纤维细胞与上皮细胞、平滑肌细胞与血管内皮细胞、角膜实质细胞与角膜上皮细胞、角膜实质细胞与角膜内皮细胞等组合中的任一种。

这些培养方法中，可包括将磁场诱导步骤或培养步骤中获得的细胞培养体从培养基材释放出来的释放步骤，或也可包括收集所得细胞培养体的收集步骤。

此外，本发明提供有细胞多层体的培养组织，其中至少细胞多层体的一部分包括磁性化了的细胞。

附图简述

图1表示一例磁性微粒带正电荷的脂质体(MPCL)。

图2表示一例固化了抗体的磁性微粒脂质体(AML)。

图3表示一例本发明的细胞培养方法。

图4表示另外一例本发明的细胞培养方法。

图5表示用本发明的培养方法获得的三维培养组织的各种形态，图5(a)表示单一种类的细胞多层化而形成的片状培养组织；图5(b)表示不同种类的细胞多层化而形成的片状培养组织；图5(c)表示不同种类的细胞多层化而形成的管状培养组织；图5(d)表示不同种类的细胞多层化而形成的圆形盘状培养组织。

图6表示实施例1的概略，表示在磁力作用状态下共培养肝实质细胞与磁性化的肝非实质细胞(人血管内皮细胞)构建培养肝组织的步骤。

图7表示HAECs的细胞内铁浓度测定结果。

图8表示HAECs的活细胞数测定结果。

图9表示各种培养体系中白蛋白分泌量随时间的变化图。

图10表示实施例2的概略。

实施发明的最佳方案

以下，对实施本发明的最佳方式进行说明，对本发明的细胞培养方法进行说明，还对培养组织进行说明。本发明的细胞培养方法是至少将第1细胞和第2细胞多层化的培养方法；此外，还包括接种、培养第3及其后的细胞，积层第3及其后的细胞(多层化)。第3及其后细胞的培养按照第2细胞进行。因此，以下的说明中，也包含培养第3及其后的细胞，使之组织化。

按照本发明实施方案之一的细胞培养方法，在单层或多层化的第1细胞上接种磁性化了的第2细胞，进行磁场诱导，使第2细胞在磁力作用下吸引到第1细胞的指定位置。其后，可在该状态下培养第1细胞和第2细胞。也就是说，通过磁力将第2细胞放置到第1细胞上，将第2细胞排列在指定的位置，多层化。再培养多层化了的细胞群，使这些细胞间相互接触。因此，可使细胞多层化，而不需要个别地制备、剥离细胞片或积层。另外，可不大大改变温度而使细胞多层化。此外，由于通过磁场诱导，在磁力作用下可将细胞吸引到指定位置，第2细胞可放置到所希望的位置，所以可构建希望的多层结构。因此，可简便构建三维形状的培养组织。另外，在构建的培养组织中，可通过磁力作用容易地构建、保持所希望的三维形状的培养组织。还可通过磁力进行转移或固定。

本发明的细胞培养方法中，所要培养的细胞，均为黏着依赖性细胞。所谓黏着依赖性细胞是指直接或间接接触培养面以后，其接触面积扩大，然后进行细胞分裂，也叫做锚定依赖性细胞。黏着依赖性细胞的例子包括，例如从人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、鸡、兔子、猪、绵羊、牛、马、狗、猫、猴子等暖血动物中分离出的各种动物细胞。暖血动物的细胞的例子包括，例如角化细胞、脾细胞、神经细胞、胶质细胞、胰腺β细胞、肾小球膜细胞、郎格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞(角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、羊膜上皮细胞等)、内皮细胞(包括血管内皮细胞、角膜内皮细胞等)、成纤维细胞、实质细胞(包括肝实质细胞、角膜实质细胞等)、包括血管平滑肌细胞等平滑肌细胞的肌细胞、脂肪细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、造骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞、骨膜来源的细胞或间质细胞，或者这些细胞的前体细胞，此外还包括胚胎干细胞(ESC)和间充质细胞干细胞(MSC)等干细胞和黏着依赖性的癌细胞。

本培养方法中，对多层化细胞的生物来源(同种、异种、同一个体)无特殊限定。即便是异种生物，也可在细胞水平共培养，所得培养组织也有用途。

这里所说的同种和异种分别指基于细胞来源(移植时的供体和受体等)的同种(Allogenic)和异种(Xenogenic)。另外，这些细胞既可以是相同种类的细胞也可以是不同种类的细胞。这里所说的相同种类和不同种类，不表示已经说明的同种(Allogenic)和异种(Xenogenic)，而表示相同类型(Same Type)和不同类型(DifferentType)的细胞。如上面提到的，本发明中，例如第1细胞和第2细胞的组合，包括同种动物的相同种类的细胞、同种动物的不同种类的细胞、异种动物的相同种类的细胞、异种动物的不同种类的细胞、同一个体的相同种类的细胞、同一个体的不同种类的细胞间的组合。

依照本发明，即便是不同种类的细胞，二者也能在磁力作用下很好的附着。应用相同种类的细胞时，优选构建心肌组织和皮肤组织(上皮层)这样的通过使单一细胞多层化，即可很好地表达其功能的组织，尤其对在常规的培养操作中不容易多层化的细胞种类特别有效。应用不同种类的细胞时，优选构建通过多种类的细胞相互作用而达成其功能的肝脏和肾脏、或者血管等器官。应用不同种类的细胞，也可以构建心肌和皮肤等器官。

应用不同种类的细胞的一个实例，例如，可用肝实质细胞作第1细胞，用血管内皮细胞作第2细胞。这种组合优选用于肝脏组织。另外，也可以成纤维细胞作第1细胞，以上皮细胞作第2细胞，这种组合优选用于皮肤组织；以平滑肌细胞作第1细胞，以血管内皮细胞作第2细胞，这种组合优选用于管状的血管组织(此时的顺序是以管状体的内表面作为培养表面)。需要指出的是，也可以血管内皮细胞作第1细胞，以平滑肌细胞作第2细胞，以成纤维细胞作第3细胞来构建血管组织(此时的顺序是以管状体的外表面作为培养表面)。另外，也可以角膜实质细胞作第1细胞，以角膜上皮细胞或角膜内皮细胞作第2细胞，该组合优选用于构建角膜组织。此时，也可选择角膜上皮细胞或角膜内皮细胞作第3细胞，可按角膜上皮细胞、角膜实质细胞、角膜内皮细胞的顺序多层化，该组合更优选用于构建角膜组织。需要指出的是，在包括这些具体组合在内的不同种类的细胞多层结构中，对第1细胞、第2细胞、第3及以后的细胞的顺序无限定。可按照组织、部位，或根据培养基材的形状而适当变更。例如，构建上述管状血管组织时，优选利用管状体(包括柱状体)，构建角膜组织时，优选利用盘状体，特别优选圆盘状体。

(制备步骤)

本发明的第1细胞的制备步骤中，在培养基材的培养面上制备单层化或多层化的第1细胞。单层或多层化，包括单层片及多层片，但并不总需要一直培养到第1细胞形成单层片或多层片。即便没形成细胞片，也可通过磁力将细胞诱导到培养面的指定部位，在此积聚，形成单层状或多层状的细胞体。例如，如后面所述，通过磁力将分散状态(细胞悬浮液)的磁性化的第1细胞吸引到培养基材的培养面上，由此可在培养面上制备大致的单层或多层化的细胞。细胞积聚体及细胞片的形状无特殊限定。可根据积聚或培养第1细胞的培养基材的培养表面的形状而采用各种形状。

应用具有细胞能在其上附着、培养的培养表面的培养基材保持、积聚或培养第1细胞。培养基材决定了作为有待多层化细胞体的基底层的第1细胞层的形状，但第1细胞层的平面形状最终由磁力作用的区域决定。通过本发明的方法而获得的培养组织，可按照目的最终从培养基材上分离出来。培养基材，可应用各种形态，但构建三维形状的培养组织时，优选应用盘状体、管状体、柱状体、具有中空部的封套状体、皿状体及球状体。应用盘状体时，适于各种平面形状的细胞片的多层化；应用管状体时，可以其内表面和/或外表面作培养面而得到管状的培养组织。另外，管状的培养组织，也可利用柱状体的外表面而获得。利用柱状体作为培养基材时，可应用其自身即为磁石的柱状体。利用具有中空部的封套状体时，可以其内表面和/或外表面作培养面而得到(封套状)袋状的培养组织。利用管状体作为培养基材时，在第1步的制备步骤中，可获得与其外表面或内表面相对应的管状的细胞积聚体或细胞片；应用封套状体时，可获得封套状的细胞积聚体或细胞片。应用碟状体时，可以培养基材的凹表面和/或凸表面作为培养表面而获得碟状的培养组织。另一方面，以球状体作培养基材时，可以球状体自身或球状体的中心为磁石，将第1细胞和第2细胞吸附到球状表面，通过微载体培养法可有效的提取细胞因子和蛋白质。此时，细胞不从培养基材上分离出来，而是与培养基材一起进行培养。

本发明中应用的培养基材的培养表面，优选是细胞非附着性的。这里“细胞非附着性的培养面”，只要是黏着依赖性的细胞不附着或难以附着性质的培养面，任何一种均可，包括以聚苯乙烯、聚丙烯、荧光树脂、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚酯等材质的培养容器的底面(也包括膜表面)，用琼脂糖、琼脂、明胶、胶原、纤维蛋白等包被的培养基材的培养面(也包括膜表面)，带阳性电荷的培养基材的培养面等。具有细胞非附着性培养面的培养基材的实例包括，例如Corning公司的超低附着性培养板(商品名)和Cell Seed公司的Hydro Cell(商品名)等。难以附着性质的培养面是指具有如下所述粘附性的培养面，除去磁力时，轻轻振荡培养基材，磁性化的细胞可从培养面分离出来。

应用具有细胞非附着性的培养面的培养基材时，可通过磁力将第1细胞吸引到磁性化的培养面，通过这样的磁场诱导，可将第1细胞附着到培养基材的培养面上进行培养，与此同时，最终从培养基材上分离出培养组织时，可仅通过减弱或除去磁场作用，将培养组织从培养面上释放、分离出来。因此，不使用酶和温度感应性聚合体，即可获得培养组织。结果，不变化温度即可容易地获得培养组织，其后的处理也变得容易。

(接种步骤)

本发明的接种步骤中，将磁性化的第2细胞供给第1细胞。对于细胞的磁性化，例如，可采用使细胞保持磁性微粒子的方法。这样的磁性化过程可以是，例如，将磁性微粒子与细胞接触一定时间的过程。使第2细胞磁性化的磁性微粒子没有特殊限定，只要是能被细胞保持，同时能赋予所述细胞磁性的任何一种磁性微粒子均可，例如，将磁铁等磁性微粒子封入脂质体中的、包含磁性微粒的正电荷脂质体(MPCL，Magentic particle cationic liposome)和在固定了抗体的脂质体中包含磁性颗粒的磁性脂质体(AML，Antibody-immobilizedmagnetoliposome)的磁性微粒子，第一化学制品社的MACS(MagneticCell Sorting and Separation of Biomolecules)内的磁性微珠和VERITAS公司的磁性纳米微粒(商品名EasySep)等。这些磁性微粒子中，象MPCL和AML这样包含脂质体的磁性微粒子，由于脂质体的存在，可被摄取到细胞内，一个细胞可摄取多个磁性微粒子，通过磁力，细胞可被吸引到培养基材的培养面方向(第1细胞的方向)，于是，细胞可容易地保持尽磁场诱导可能程度的磁性。所以，优选这样的磁性微粒子。

如图1中的一例所示，MPCL具有这样的结构，用脂质体封闭磁铁等磁性微粒子，脂质体中供给带正电荷的磷脂。由于多数细胞带负电荷，所以易于与持有正电荷的MPCL结合，另外，由于MPCL具有脂质体，所以易于被摄取到细胞内。因此，本发明中采用MPCL作为磁性微粒子时，可适于培养各种不同的细胞。MPCL的制备可参照，例如Jpn.J.Cance Res.第87卷，1179-1183，1996中记载的包含磁铁的正电荷脂质体(MCL，Magnetic cationic liposome)的制备方法。细胞磁性化步骤中采用MPCL时，MPCL中优选使用每1个细胞1～150pg的磁性微粒子，特别优选20～150pg。另外，磁性化步骤中，优选培养的细胞与MPCL开始接触0.5～8小时后，进入后面的步骤，特别优选3～5小时后进行。

如图2中的一例所示，AML具有这样的结构，用脂质体封闭磁铁等磁性微粒子，脂质体中供给抗体。作为抗体，选择与有待培养的特定细胞进行特异性结合的抗体。带有与抗体特异性结合部位的细胞易于与AML抗体结合，另外由于AML具有脂质体，所以易于被摄取到细胞内。AML的制备可参照，例如J.Chem.Eng.Jpn.，第34卷，66-72，2001中记载的制备方法。细胞磁性化步骤中采用AML时，AML中优选使用每1个细胞1～150pg的磁性微粒子，特别优选20～150pg。另外，磁性化步骤中，优选培养的细胞与AML开始接触0.5～8小时后，进入后面的步骤，特别优选3～5小时后进行。

本发明的接种步骤中，可根据细胞种类和目的培养组织的大小而确定适当的接种密度，但一般设定的接种密度为1×10³～1×10⁶个/cm²。

接种的第2细胞只要是磁性化的，接种时其细胞形式既可以如图3所示为分散状，也可如图4所示为单层或多层化状态。还可以是单层化细胞片，多层化细胞片。分散状的磁性化细胞可这样获得，即，让上述磁性微粒子与第2细胞接触一定时间。单层或多层化的磁性化细胞(包括各自的片状。下同。)的获得是，将临时磁性化了的第2细胞接种到适当的培养基材的培养面上，用磁力将磁性化细胞吸引到培养面上，边进行磁场诱导，边进行培养。另外，将第2细胞培养成单层或多层结构的片状体后，通过与磁性微粒子接触也可容易地获得单层或多层化的磁性化细胞。第2细胞的单层或多层结构可根据需要进行选择，采用与之相对应的培养基组成等培养条件即可。第2细胞的单层细胞片或多层细胞片，没必要与制备第1细胞的培养基材的培养面的三维形态一致。细胞片，不管是单层细胞片还是多层细胞片，由于具有充分的挠性，通过磁力可吸引到培养面，当培养面为通常的平面片状体时，虽然培养面有曲面，它也可充分跟随其培养面。另外，也可供给2枚以上第2细胞的单层细胞片或多层细胞片，以形成多层化结构，还可供给预先多层化的细胞片。

将磁性化的第2细胞供给第1细胞的方法，无特殊限定，若是分散状的细胞，可与通常的细胞悬液一样进行处理，但如图4所示，优选用磁力保持磁性化的第2细胞，移送到第1细胞的上面，其后除去磁力，接种到第1细胞。这样，可容易且确实地将第2细胞移送到目的地(第1细胞上的指定位置)。尤其是，当磁性化的第2细胞为单层化或多层化的脆弱的片状体时，不仅可容易操作，而且很容易维持其形态，此外，可容易地维持其平面形态进行移送。因此，通过磁力移送或接种，可有效回避第2细胞的损伤，同时是一种获得所希望的多层形态的有效方法。另外，由于第2细胞可按种到第1细胞的指定位置，所以可不打乱第1细胞的保持状态、积聚状态或层形态而接种第2细胞。因此，可以说是可避免第1细胞损伤的移送和接种方法。通过磁力进行移送时，可应用后述回收步骤中应用的悬架用支持膜。通过并行培养磁性化的第1、第2和第3细胞，制备成单层细胞片和多层细胞片后，通过磁场诱导进行多层化，使细胞片通过磁力从容器上方顺序吸引到磁力源，由此制备成本发明中的培养组织。

(磁场诱导步骤)

本发明的磁场诱导步骤中，只要是通过磁力作用能将磁性细胞吸引到期望的位置的磁力操作即可。对于将细胞吸引到培养面的磁力操作，可借助培养面，在非细胞培养侧(对向细胞的一侧，培养面夹在其间)设置磁石进行磁场诱导。当盘状培养基材的表面作培养面时，将磁石放置在里侧。另外，当用管状体的培养基材，以其外表面(外周面)作培养面时，将将磁石放置在管状体内部。

例如，通过设置在培养基材培养面对侧的磁石将磁性化细胞吸引到培养面时，根据磁性微粒子的种类、磁性微粒子摄取到细胞的量、培养基材培养面的材质、培养面的厚度等适当决定磁力。本发明的磁场诱导步骤中，伴随着通过磁力将细胞吸引到指定位置，也可通过磁力将细胞转移到指定位置。

本发明的磁场诱导步骤中，通过磁力可将第2细胞吸引(诱导)到对应于第1细胞的期望的位置。因此，可构建所期望的多层结构，结果可构建三维结构。

将第2细胞吸引到对应于第1细胞的位置，至少是与第1细胞群(细胞积聚体或细胞片)部分重叠。在该重叠部位第1细胞与第2细胞间彼此接触，通过培养，细胞彼此间结合，形成多层化。因此，第2细胞没必要在整个第1细胞群上多层化，部分即可。

上述制备步骤中，当制备的第1细胞是细胞积聚体或细胞片等形态时，可通过实施磁场诱导步骤，通过磁力，将通过保持磁性微粒子等预先磁化了的第1细胞吸引到培养基材的培养面。也就是说，与使第2细胞磁性化同样，使第1细胞磁性化，将磁化了的第1细胞在培养基材的培养面保持、积聚或培养。通过实施磁场诱导步骤保持、积聚或使第1细胞片化，可简便且短时间内制备单层化或多层化的第1细胞。另外，使用具有细胞非附着性培养面的培养基材时，构建培养组织后，可通过释放磁力而将培养组织从培养基材上容易地释放出来。

(培养步骤)

培养步骤中，在磁场诱导步骤中所得细胞配置状态下培养第1细胞和第2细胞。由此，从第1细胞和第2细胞产生细胞外基质，加强细胞间的粘附。为了维持在磁场诱导步骤中所得细胞排列[磁场诱导]状态，优选在培养步骤中进行磁场诱导，使磁力持续发挥作用。本培养步骤中，当第1细胞已经培养到产生接触抑制的时候，基本上是第2细胞增殖。本培养步骤中，当第1细胞未培养到该种情况时，或者仅保持、积聚了第1细胞且它们能增殖，或者未形成细胞外基质时，基本上是第1细胞和第2细胞均能增殖。第1细胞在制备的培养面上以层的形式增殖，第2细胞在被磁力吸引[诱导]到第1细胞层的部位增殖，多层化。

本发明的培养步骤中，对第1细胞和第2细胞的培养条件、培养到哪种增殖状态等无特殊限定，可培养到达到目的状态为止。第1细胞和第2细胞既可形成单层，亦可形成多层。

按照本发明的培养方法，由于通过磁力可将用于多层化的细胞放置、粘附到任意位置，所以可获得具有所期望的三维形状的培养组织。另外，通过将同种类型或异种类型的细胞多层化到所期望的状态，可容易地获得近似其原本组织形态的培养组织；由于可构建适于细胞发挥功能的环境，所以可获得良好的培养组织。

此外，本发明的培养方法中，如已经说明的那样，也可使第3及以后的细胞多层化。通过磁场诱导，用磁力将第3及以后的细胞吸引到其下位细胞(例如，对于第3细胞而言，是指第1细胞和/或第2细胞)的指定位置，可排列在接近或接触的位置，这样细胞间可容易地粘附。因此，第3细胞可与第1细胞接触、粘附。与第1细胞和第2细胞同样，优选第3及以后的细胞为细胞黏着依赖性。细胞形态既可是分散状，也可是单层化、多层化(包括片状体)。另外，可应用磁性微粒子等进行磁性化，通过磁力诱导进行排列、培养。

本培养步骤中，可根据作为培养对象的细胞的种类适当选择液体培养基的种类。例如，可选择众所周知的DMEM、α-MEM、M199等培养基。另外，也可适当添加以EGF和FGF为代表的生长因子等。

(回收步骤)

本发明的细胞培养方法，包括通过磁力回收达到既定状态的细胞的回收步骤。回收步骤中，在培养基材上放入悬置的支持膜，利用磁力将达到既定状态的培养组织吸引、附着到支持膜上，由此进行回收。这里的悬置的支持膜可以是任何一种能将达到既定状态的培养组织充分地原样悬架的支持膜，包括编织物、纺织物、无纺布、纸、树脂片等。例如，除无菌纱布、无菌日本纸、无菌滤纸、无菌无纺布之外，还包括PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)和PTFE膜(聚四氟乙烯膜)等亲水性膜(包括对表面进行亲水性处理的膜)，硅橡胶等柔软性高分子材料和聚乙二醇酸、多聚乳酸等生物分解性多聚体，琼脂培养基、胶原胶、明胶、纤维胶、藻酸盐胶、聚-N-异-丙烯酰胺等具有片层形状的水凝胶。可应用电磁石的磁力作为磁力，电磁石可通过通电、断电对产磁、消磁进行控制。这样的话，不仅回收达到既定状态的培养组织的作业能容易地自动化，而且其后移动、包装细胞的作业也能容易地自动化，非常便利。如前所述，回收培养组织之前，要除去或减弱作用于培养面的磁力，使培养组织从培养表面释放出来。除磁力之外，培养组织的回收可用镊子捏取悬置到悬置支持膜上的培养组织，或用口径较宽的吸管吸取。

本发明的细胞培养方法中可省略培养步骤。也就是说，在上述磁场诱导步骤中，通过用磁力将第2细胞吸引到第1细胞的指定位置，即使不对第1细胞和第2细胞进行培养，也可获得第1细胞和第2细胞在多层化状态下基本上一体化的多层组织。按照此方法，可简便地获得多层组织。例如，当第2细胞以单层化或多层化的片状体形式供给(接种)到第1细胞的过程中，可通过磁场诱导用磁力将细胞吸引到指定位置，容易地使第2细胞与第1细胞一体化。用2个以上的第2细胞片状体进行接种的情况更多。

不进行培养步骤，仅通过磁场诱导步骤使第1细胞和第2细胞附着时，其附着强度随细胞种类和第2细胞的接种形态而异。当第2细胞为片状体，附着强度比较高，整体的多层组织的强度也较强时，通过从培养面去除磁力，细胞培养体可从培养表面释放、回收。

另一方面，仅通过磁场诱导步骤而多层化的第1细胞和第2细胞的附着强度低，或者整体的强度低的时，可进行一体化步骤，即在通过上述磁场诱导步骤而得细胞排列状态下，用结合材料使第1细胞和第2细胞结合，使之一体化，回收细胞培养体。通过结合材料使之一体化，可增强细胞培养体的强度，细胞培养体可从培养表面释放、回收，而不破坏其一体化结构。作为结合材料，优选应用具有生物亲和性的凝胶材料，例如可应用胶原、明胶、琼脂糖、纤维蛋白、褐藻酸、聚乙烯醇水凝胶等，可单独应用也可2种以上混合使用。应用凝胶化材料时，细胞的结合及一体化靠凝胶化材料的凝胶化而达成。应用凝胶化材料，很容易地包埋要结合的细胞，所以可提高细胞的一体化，释放、回收时的操作容易。在磁场诱导步骤中所得细胞排列状态下一体化时，凝胶化要在继续维持磁场诱导步骤中所用磁力的作用下，通过结合材料作用于结合力。维持磁力的作用进行一体化时，细胞的诱导、固定状态得以维持，所以，当第1细胞和第2细胞确实放置在所期望的位置时，它们可被固定。一体化后，除去磁力后，即除去磁石后，可从培养表面回收细胞培养体。

上述一体化步骤应用于进行培养步骤的细胞培养体时，可容易地获得强度高的细胞培养体，同时可容易地从培养表面回收。此外，无论是在磁场诱导步骤后实施培养步骤细胞对培养表面的附着性提高时，还是用细胞非附着性的培养面进行培养时，上述一体化步骤均有利于从培养表面回收细胞培养体。

通过本培养方法而获得的培养组织，具有细胞的多层体，至少该多层体的一部分中有磁性化的细胞。优选，该培养组织几乎所有的细胞均磁性化。另外，该培养组织，由适于本发明的细胞培养方法的细胞组合构成。该培养组织具有磁性化细胞，所以可通过磁力进行培养组织的转移和固定等。此外，基于该培养组织具有磁力，也可实施三维结构的构建。因此，可提供便于应用的培养组织。除了基本上片状的培养组织之外，本发明的培养组织可提供管状体的培养组织、部分和全部构成球状面的培养组织。作为构成部分球状面的培养组织的例子有，例如角膜组织样的盘状体、圆盘状体；作为构成整个球状面的培养组织的例子有，例如适用于微载体培养法等的在球状的培养基材表面形成的培养组织。

所制备的培养组织可用作移植用修补物，修补、替换患者的缺损部位和病灶部，也可作为医药品和化妆品等筛选和毒性试验中使用的实验用组织等价物利用。此外，由于培养组织适用于提取、收集细胞产生的细胞因子和蛋白质的微载体培养法，所以期望与以往的培养单一种类的细胞进行提取的方法相比，通过提高各微载体能保持的细胞数(多层化)提高产量；通过将2种不同种类的细胞在微载体上多层化，可提高产量；提取出单一种类的细胞产生不出的细胞因子和蛋白质。这可从后面的图9所示，图中显示，与肝实质细胞单体相比，肝实质细胞与血管内皮细胞多层化的培养组织，产生的白蛋白增多。

图5表示用本发明的培养方法获得的各种三维形状的细胞培养体的横断面结构。图5(a)中表示同一种类的细胞(图中为心肌细胞)多层化而得到的片状培养组织。图5(b)中表示不同种类的细胞(图中为血管内皮细胞和肝细胞)多层化而得到的片状培养组织。图5(c)中表示在制备的管状血管内皮细胞的外周面使平滑肌细胞多层化而得到的管状培养组织。图5(c)中所示的培养组织，也可是以管状培养基材的内表面作为培养面，在该培养面上制备平滑肌细胞，将血管内皮细胞放置到对应于平滑肌细胞的位置，进行多层化。另外，平滑肌细胞的外周也可制备成纤维细胞。图5(d)中表示在角膜内皮细胞的圆盘状上面，角膜实质细胞、角膜上皮细胞顺序多层化而形成的圆形盘状培养组织。图5(d)中所示的培养组织，也可是以圆盘状培养基材的内表面作为培养面，在该培养面上制备角膜上皮细胞，将角膜实质细胞放置到对应于角膜上皮细胞的位置，再将角膜内皮细胞放置到对应于角膜实质细胞的位置，进行多层化。

(实施例1)

以下，应用实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。以下的实施例1中，对用肝实质细胞和血管内皮细胞构建培养肝组织时进行说明。本实施例的概要如图6所示。

(1)大鼠肝实质细胞的采集

用原位胶原酶灌流法从7～9周龄的Sprague-Dawley大鼠采取大鼠肝实质细胞(hepatocytes)。胶原酶灌流法在中村敏一初代培养肝实验法学会出版中心1987；5-17及Seglen PO.Preparation of isolatedrat liver cells，Meth.Cell.Biol 1976；13：29-83中有一般的描述。本实施例中，用以下方法进行。

(胶原酶灌流法)

首先，用吸入二乙醚和腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠。接着，将大鼠浸在37℃ 0.05％Osvan溶液中消毒，然后将大鼠固定到解剖台，顺次切开皮肤、腹肌，暴露腹腔。首先，将肠拉向右侧，充分暴露门脉，将缝合线通过门脉下，作环。在缝合线下游，用留置针插入门脉进行导管插入，然后拔掉留置针，顺肝脏方向插入套管的外套，用缝合线固定。血液从套管流出，放血30秒左右。

37℃的预灌注液以30ml/min从套管流入，1分钟左右肝脏膨胀，从肝脏下面切断下腔静脉。切断下腔静脉时，血液一下流出，进行放血。打开胸部，露出心脏后，用钳子夹住切断的下腔静脉，然后在横隔膜下的下腔静脉处用缝合线打环，进入右心房，用留置针，从右心房给打环了的下腔静脉同套管。还可顺肝脏方向插套管，用缝合线固定，从刺入右心房的套管流出预灌注液。预灌注液继续流，直到血液完全从流出的预灌注液中完全去除(大约25分钟左右)。

将预灌注液换成胶原酶溶液，以30ml/min灌流5分钟，其后降低流速。通过胶原酶处理，肝脏顺次被消化，肝小叶浮出，胶原酶溶液从表面流出。胶原酶处理共计10分钟后，停止灌流。其后，切断肝脏、横膈膜及血管的结合部，用镊子摘取肝脏，用剪刀剪去与其它组织的结合部，移到10mm培养皿中，培养皿中放入了足够的含5％FCS的MEM溶液。用剪刀剪碎肝脏，振荡培养皿使细胞渗出。使细胞充分分散后，在100mm金属网上铺3层纱布，过滤细胞悬浮液。用洗涤用缓冲液将所得细胞悬液50×g，离心1分钟，处理4次，分离肝实质细胞与非肝实质细胞。经过该处理后，沉降的细胞为肝实质细胞，将该沉降部分作为肝实质细胞进行采集。

对所得细胞用台盼兰判断死活的方法进行细胞计数，只有活细胞率达80％或以上的细胞才用于实验。将细胞以6×10⁴细胞/cm²的密度接种到包被了I型胶原的培养皿(Asahi techno glass)上，在肝实质细胞培养液中培养。预灌流液、胶原酶溶液、洗涤用缓冲液、肝实质细胞培养液的各组成成分如表1～4所示。

表1预灌流液的组成(单位：g/L)

NaCl 8

KCl 0.1

NaH₂PO₄·2H₂O 0.1014

Na₂HPO₄ 0.06

HEPES 2.38

酚红 0.006

EGTA 0.19

NaHCO₃ 0.35

葡萄糖 0.9

(各个成分均为和光纯药公司产品)

表2胶原酶溶液(pH7.5)的组成(单位：g/L)

NaCl 8

KCl 0.1

NaH₂PO₄·2H₂O 0.1014

Na₂HPO₄ 0.06

HEPES 2.38

酚红 0.006

CaCl₂ 0.19

NaHCO₃ 0.35

胶原酶 0.5

(各个成分均为和光纯药公司)

表3洗涤用缓冲液的组成

最小培养基^*1

含有以下浓度的下列成分。

FBS 5％

非必需氨基酸^*1 10mM

抗生素^*1

硫酸链霉素 0.1mg/ml

青霉素G纳 100U/ml

*1均为Invitrogen的产品。

表4肝实质细胞培养液的的组成

Williams培养基^*2

含有以下浓度的下列成分。

CuSO₄·5H₂O^*2 0.1μM

Na₂SeO₃ ^*2 25nM

ZnSO₄·7H₂O^*2 1.0μM

胰岛素^*2 0.1μM

地塞米松^*3 1.0μM

EGF^*2 20μg/l

硫酸庆大霉素^*3 48mg/l

氯霉素^*3 100mg/l

*2：Sigma

*3：和光纯药

(2)人大动脉血管内皮细胞(非肝实质细胞)的采集

用人大动脉血管内皮细胞(human aortic endothelial cells：HAECs，三光纯药)作为肝非实质细胞。用第1～6代的细胞。当细胞达到80％汇合时进行传代，接种1/4的细胞数。用含有下述成分的血管内皮细胞用培养基(EGM-2，三光纯药的商品名)作为培养基。

(所含成分)氢化可的松、hFGF-B、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、肝素、FBS、hEGF、庆大霉素/两性霉素B

(3)封入磁铁的正电荷脂质体(magnetite cationicliposome：MCL)的制备

作为磁性微粒子磁铁(Fe₃O₄)，用户田工业株式会社粒径10nm的微粒。用去离子水洗涤磁铁，充分去除多余的离子成分后，通过超声波处理，得到分散到水中的分散磁铁液。作为磷脂，应用N-(a-三甲基铵基-乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG：N-(α-trimethylammonio-acetyl)-didodecyl-D-gulutamate chloride)(相互药工社)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC：Dilaurolyphosphatidylcholide)(Sigma Chemical)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE：Dioleoylphosphatidylethanolamine)(Sigma Chemical)三种，将它们溶解到氯仿中，摩尔比为1∶2∶2(TMAG∶DLPC∶DOPE)的组成，装入到nasu型烧瓶中，用旋转蒸发仪边转动边吸气，除去溶剂，在内壁上形成脂质膜，向脂质膜中加入2ml前述的分散的磁铁液(10mg/ml)，旋涡搅拌，膜膨胀。将膨胀的膜与磁性微粒子超声波处理(28W)15分钟，其后，加入10倍浓度的磷酸缓冲液(PBS：Phosphatebuffered saline)，分散到PBS中。再进行15分钟的超声波处理(28W)，获得MCL。

(4)MCL对人大动脉血管内皮细胞(HAECs)的毒性

将1.5×10⁵HAECs细胞接种到100mm培养皿中，向培养基中添加MCL，使铁浓度达100pg/细胞，添加1、2、4、8、24、48小时后，测定活细胞数及细胞内铁浓度。细胞中铁浓度的测定结果如图7所示，活细胞数测定结果如图8所示。如图7所示，当HAECs细胞以磁铁浓度100pg/细胞摄取MCL时，添加MCL8小时，细胞内铁浓度最大(大约65pg/细胞)。另外，如图8所示，摄取最大细胞内铁浓度的MCL的细胞增殖与未摄取MCL的细胞相比没变化，因此，未观察该最大浓度下MCL对HAECs的毒性。

(5)在应用磁石的大鼠肝实质细胞上培养人大动脉血管内皮细胞，测定白蛋白的含量

用Williams培养基，将肝实质细胞接种到包被了I型胶原的24孔培养板(Asahi Techno Glass公司制)上。培养开始2天后，给HAECs摄取MCL，将HAECs接种到各孔使其细胞数达2×10⁵细胞/孔。在各孔中放置直径1mm的磁石(钕磁石，表面磁束密度：0.45T)，将HAECs吸引到各孔的底面进行培养。作为对照，应用摄取了MCL的HAECs与肝实质细胞一起在没有磁石的条件下共培养，未摄取MCL的HAECs与肝实质细胞一起在没有磁石的条件下共培养，不用磁石仅静置培养肝细胞。

(分泌白蛋白量的测定)

共培养开始一天后，用Williams培养基、EGM-2培养基1∶1混合了的培养基0.5ml交换培养基。其后每24小时收集培养上清，分别在-40℃冻存，测定白蛋白的分泌量。白蛋白的测定是通过ELISA法测定收集的培养上清中的白蛋白含量。作为ELISA法，应用以下的方法。

(ELISA法)

将用PBS调整为10mg/ml的一抗(羊抗大鼠白蛋白IgG，Cappel)以100ml/孔添加到ELISA用的96孔培养板(Corning)，4℃培养一晚，使之不干燥。其后，用200ml/孔的洗涤液洗涤3次。添加测定样品100ml/孔，37℃培养30分钟。其后，用200ml/孔的洗涤液洗涤3次。添加用洗涤液调整的二抗(抗大鼠白蛋白结合过氧化物酶兔IgG，Cappel)200ml/孔，室温孵育1小时。用200ml/孔的洗涤液洗涤4次，添加底物溶液200ml/ml。室温孵育10～30分钟后，添加终止付与液50ml/ml。用分光光度计测定波长490nm(对照波长655nm)的吸光度，测定上清中的白蛋白量。结果如图9所示。

如图9所示将摄取了MCL的HAECs接种在肝实质细胞上用磁石共培养时(图9中用黑圈表示)，产生最大的白蛋白分泌量。且，8日后还能看到分泌。

与此相对，仅肝实质细胞的对照(图9中，用白三角表示)中，培养初期能分泌与共培养同种程度的白蛋白，但其后急剧下降，7日后，几乎检测不到。另外，即便在摄取了MCL的共培养体系中，不使用磁石时(图9中，用黑三角表示)，应用未摄取MCL的HAECs时(图9中，用圆圈表示)，伴随着自然沉降HAECs附着到肝细胞，轻微提高、延长了白蛋白的分泌量。另外，在这两种情况下，针对白蛋白分泌量亢进的效果没有变化。但是，与二者用磁石共培养组相比，白蛋白的分泌量较少。

将摄取了MCL的HAECs接种到在皮氏培养皿中培养的肝实质细胞上，用磁石(直径1mm，表面磁束密度：0.45T)开始培养2日后观察细胞的状态，可以确认HAECs附着到肝实质细胞上，肝实质细胞存在的区域HAECs存在，肝实质细胞不存在的区域HAECs不存在。

(6)应用磁石在大鼠肝实质细胞上培养人大动脉血管内皮细胞，用组织染色进行观察

将肝实质细胞接种到经胶原包被处理的皮氏培养皿中。培养开始2日后，让HAECs摄取MCL，接种到肝实质细胞上，在皮氏培养皿下放置直径3mm的磁石(钕磁石，表面磁束密度：4000T)，用通用的混合器振荡10分钟后，静置培养。其后，放置磁石继续培养2天。接种摄取了MCL的细胞2天后，用10％福尔马林固定，然后制备组织切片，用HE和抗大鼠白蛋白抗体(抗大鼠白蛋白兔IgG，Cappel)染色，观察培养断面。

从组织染色后的断面观察显示，通过应用磁石，HAECs积聚在磁石上。另外，在培养断面显示了一种状态，即摄取了MCL的HAECs在肝实质细胞上附着、多层化的状态。再者，用抗白蛋白抗体对成为肝功能指标的白蛋白进行染色时，最下层的细胞层能染色，而其上的细胞层(HAECs层)几乎不能染色。另外，当磁石不存在时，培养断面上几乎看不到HAECs。这些结果表明，通过设置磁石，通过磁力将HAECs放置到肝实质细胞上进行培养时，HAECs可在肝实质细胞上多层培养，通过肝非实质细胞HAECs相对于肝实质细胞的多层化，可促进肝实质细胞产生白蛋白。

(实施例2)

以下的实施例1中，对应用成纤维细胞与血管平滑肌细胞与血管内皮细胞构建培养血管组织时进行说明。本实施例中，血管内皮细胞为第1细胞，血管平滑肌细胞为第2细胞，成纤维细胞为第3细胞。本实施例的概要如图10所示。

(1)血管内皮细胞

血管内皮细胞用人大动脉血管内皮细胞(human aortic endothelialcells：HAECs，三光纯药)。应用传代第2～4代的细胞。当细胞达到80％汇合时进行传代，接种1/4的细胞数。用含有下述成分的血管内皮细胞用培养基(EGM-2，三光纯药)作为培养基。(所含成分)0.04％氢化可的松、0.4％hFGF-B、0.1％VEGF、0.1％R3-IGF-1、0.1％抗坏血酸、0.1％肝素、2％FBS、0.1％hEGF、0.1％庆大霉素/两性霉素B。

(2)血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞用人大动脉血管平滑肌细胞(human aortic smoothmuscle cells：SMCs，三光纯药)。应用传代第2～4代的细胞。当细胞达到80％汇合时进行传代，接种1/8的细胞数。用含有0.1％hEGF、0.1％胰岛素、0.2％hFGF-B、5％FBS、0.1％GA-1000的血管平滑肌细胞用培养基(SmGM-2，三光纯药)作为培养基。

(3)成纤维细胞

成纤维细胞用小鼠来源的NIH/3T3细胞，培养基用添加了10％FBS和100U/ml青霉素/0.1mg/ml链霉素、1％非必需氨基酸的cMEM。

(4)培养基材及磁石

培养基材应用具有细胞附着性的通常的培养皿和24孔板超低附着性培养皿(Coastor)。通常的培养皿可在各细胞(血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞)的传代培养及摄取MCL时使用。另一方面，超低附着性培养皿在血管平滑肌细胞片(SMC片)及成纤维细胞片(3T3片)的制备中使用。该超低附着性培养皿是在培养皿的表面结合了在电场中中性的亲水性胶。因此，由于疏水性相互作用和电场的相互作用，表面吸附的蛋白质和其它生物分子不能吸附到该培养皿表面。换句话说，细胞粘附因子不能吸附到培养皿，与之相伴的就是抑制细胞粘附。另外，用直径30mm，表面磁束密度0.45T的圆柱状钕磁石(As One)培养这些细胞片。另外，制备血管组织时应用直径3mm，长度10mm，表面磁束密度0.28T的棒状钕磁石。该棒状磁石，在其纵向方向的两端分别被磁化成S极和N极。

(5)片(SMC片)及成纤维细胞片(3T3片)的制备

培养皿中培养的各细胞(血管平滑肌细胞、成纤维细胞)达到80％汇合状态时，进行细胞计数，把握细胞数后，向培养皿中添加浓度达100pg/细胞的MCL，培养4小时。用与传代培养中相同的胰酶/EDTA溶液处理，收集细胞，1000rpm离心5分钟后，用上述的各培养基悬浮。向24孔培养板超低附着性培养皿中每孔接种2×10⁶个细胞，该细胞数是汇合时的细胞数的5倍。其后，在孔下面放置外径30mm的钕磁石，使孔成为钕磁石的中心。1天后，收集细胞作为细胞片。撤去磁石后，轻轻敲打培养皿的边缘，使细胞片浮上来。用预先将口径阔宽的吸管收集细胞片。

(6)血管内皮细胞的制备

当培养皿中培养的血管内皮细胞达到80％汇合状态时，进行细胞计数，把握细胞数后，向培养皿中添加浓度达200pg/细胞的MCL，培养4小时，使细胞磁性化。用与传代培养中相同的胰酶/EDTA溶液处理，收集细胞，1000rpm离心5分钟后，用培养基悬浮，使细胞浓度为4×10⁶细胞/ml。血管内皮细胞(HAECs)不能形成细胞片，下面的实验中使用悬浮状态的细胞。

(7)通过磁场诱导形成多层结构

将直径3mm，长度10mm的上述磁石棒放置到内径3mm、外径5mm、长度20mm的硅胶管中。该硅胶管的外侧顺序卷着血管内皮细胞(HAECs)、血管平滑肌细胞片(SMC片)及成纤维细胞片(3T3片)。如图10所示，首先，将500μl血管内皮细胞的悬浮液(浓度4×10⁶细胞/ml)滴到10cmφ的培养皿中，制作成直径15mm的水池。水平转动装入磁石的硅胶管，使细胞均一的粘附到硅胶管上。再将制备的SMC片铺到另一个10cmφ的培养皿中，在SMC片上转动血管内皮细胞吸引到其表面的装入磁石的硅胶管，将SMC片卷到硅胶管上。为了覆盖完整的一周，要卷3-4片SMC片。按与SMC片同样的顺序卷3-4片3T3片到其上面。这样通过吸引可使这些细胞形成多层化，血管平滑肌细胞附着到血管内皮细胞，成纤维细胞附着到血管平滑肌细胞上，形成有多层组织的血管组织，即获得细胞培养体(组织结构体)。

(8)通过胶原胶一体化

用胶原(Cellmatrix Type 1-A(新田明胶))作为凝胶化材料。在冰上制备胶原胶溶液，按8∶1∶l将Cellmatrix Type 1-A、含10％FBS和青霉素/链霉素的不添加NaHCO₃的DMEM培养基(Dulbecco氏改良Eagle培养基)10倍浓缩的溶液、胶原胶再重建用缓冲液混合。将制备的细胞培养体放入到有两处切断的2.5ml注射器(TERUMO)的圆柱(长度50mm)中，其内径(9mm)比上述硅胶棒的外径稍大，再罐入凝胶溶液，孵育30分钟，使凝胶化。

(9)回收细胞培养体

凝胶化后，将细胞培养体与胶原胶一起从圆柱中取出，再从硅胶棒中拔出磁石，从细胞培养体中拔出硅胶棒，由此可回收用胶原胶固定了的管状细胞培养体。用显微镜观察所得细胞培养体的断面结构，可以确认从内层开始顺次为血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞一体化的断面结构。

需要指出的是，实施例1中使用肝实质细胞作第1细胞，使用大动脉血管内皮细胞作第2细胞，实施例2中使用血管内皮细胞作第1细胞，使用血管平滑肌细胞作第2细胞，使用成纤维细胞作第3细胞，每一示例中均使用不同种类的细胞。对于细胞来源的关系而言，实施例1中使用来源于大鼠和来源于人类的细胞，实施例2中使用来源于人类和来源于小鼠的细胞，均为异种(Xenogenic)细胞。如此，这些实施例中通过异种(Xenogenic)对本发明进行了说明，但根据目的，本发明也可构成同种(Allogenic)和自体(Autogenous)多层化的细胞。

Claims

1.一种细胞培养方法，包括：在培养基材的培养面上制备第1细胞的制备步骤，所述第1细胞为单层或多层化黏着依赖性细胞；将第2细胞接种到第1细胞上的接种步骤，所述第2细胞为磁性化的黏着依赖性细胞；通过磁力将第2细胞吸引到第1细胞指定位置的磁场诱导步骤；在通过磁场诱导步骤而得到的细胞排列状态下培养第1细胞和第2细胞的培养步骤。

2.权利要求1的细胞培养方法，其中第2细胞在单层或多层化状态下进行接种。

3.权利要求1或2的细胞培养方法，其中制备步骤包括培养步骤，即将第1细胞培养到形成单层或多层化的细胞片。

4.权利要求1～3任一项的细胞培养方法，其中制备步骤包括磁场诱导步骤，即通过磁力将磁性化的第1细胞吸引到培养基材的培养面上。

5.权利要求1～4任一项的细胞培养方法，其中培养第1细胞和第2细胞的培养基材是盘状体、管状体、具有中空部的封套状体、柱状体、皿状体及球状体中的任一种。

6.权利要求1～5任一项的细胞培养方法，其中培养基材的培养面是细胞非粘附性的。

7.权利要求1～6任一项的细胞培养方法，其中第1细胞和第2细胞是不同种类细胞的组合。

8.权利要求1～7任一项的细胞培养方法，其中第1细胞和第2细胞是肝实质细胞与血管内皮细胞、成纤维细胞与上皮细胞、平滑肌细胞与血管内皮细胞、角膜实质细胞与角膜上皮细胞、角膜实质细胞与角膜内皮细胞等组合中的任一种。

9.权利要求1～8任一项的细胞培养方法，包括将在培养步骤中获得的细胞培养体从培养基材释放出来的释放步骤。

10.权利要求1～9任一项的细胞培养方法，包括收集所得细胞培养体的回收步骤。

11.一种细胞培养方法，包括：在培养基材的培养面上制备第1细胞的制备步骤，所述第1细胞为单层或多层化的黏着依赖性细胞；将第2细胞接种到第1细胞上的接种步骤，所述第2细胞为磁性化的黏着依赖性细胞；通过磁力将第2细胞吸引到第1细胞指定位置的磁场诱导步骤。

12.权利要求11的细胞培养方法，其中第2细胞在单层或多层化状态下接种。

13.权利要求11或12的细胞培养方法，还包括一体化步骤，即在磁场诱导步骤所得细胞排列状态下，通过结合材料使第1细胞和第2细胞一体化。

14.权利要求13的细胞培养方法，其中结合材料是凝胶化材料，通过该凝胶化材料的凝胶化可使第1细胞和第2细胞整合为一体。

15.一种培养组织，它是通过权利要求1～14任一项的细胞培养方法而得到的、具有三维形状的培养组织。

16.一种培养组织，它具有细胞多层体，其中至少所述细胞多层体的一部分包括磁性化了的细胞。

17.权利要求16的培养组织，其中细胞多层体是不同种类的细胞多层化形成的。

18.权利要求16或17的培养组织，其中细胞多层体是肝实质细胞与血管内皮细胞、成纤维细胞与上皮细胞、平滑肌细胞与血管内皮细胞、角膜实质细胞与角膜上皮细胞、角膜实质细胞与角膜内皮细胞等任一组合中的不同种类的细胞多层化形成的。

19.权利要求16～18任一项的培养组织，其是基本上为片状的培养组织。

20.权利要求16～18任一项的培养组织，其是管状的培养组织。

21.权利要求16～18任一项的培养组织，其是构成部分或整个球状面的培养组织。