JP2016039806A - サイトカイン産生細胞シートとその利用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】血管新生を促進するサイトカインを産生する能力に優れ、及び／又は、血管内皮ネットワークが高密度に構築された細胞シート積層体の提供。
【解決手段】骨格筋筋芽細胞と線維芽細胞の相互作用により肝細胞増殖因子及び血管内皮細胞増殖因子の総産生量を高めるための細胞シートの製造方法であって、前記細胞シートを構成する細胞として骨格筋筋芽細胞７５〜４０％、少なくとも線維芽細胞２５〜６０％を含む細胞の混合物を得、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上でポリマーの上限臨界溶解温度以下又は下限溶解臨界温度以上の温度域で当該細胞シートを構成する細胞を培養し、その後培養液をポリマーの上限臨界溶解温度以上又は下限溶解臨界温度以下の温度に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離させる、前記細胞シートの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な血管新生に関与するサイトカインを産生する細胞シート、高密度の血管内皮細胞ネットワークが構築された細胞シート、その製造方法及びその利用方法に関するものである。本出願は、２０１１年２月２８日に提出された日本特許出願（特願２０１１−０４３１９８号）を基礎とする優先権主張出願である。

近年、損傷を受けた生体組織を再生するためにさまざまな再生医療技術が注目されている。このことは、心筋組織の再生を例にとっても、心筋組織へ心筋細胞、骨格筋筋芽細胞、間葉系幹細胞を直接注入し再生する方法、後述するように心筋組織細胞を特殊な温度応答性基材上で培養し温度変化させて低損傷な心筋組織細胞シートして移植して再生する方法（特許文献１参照。）等、多くの研究が進められており、一部の細胞ではヒトへの臨床研究も開始されている。

特許文献２では、心筋機能の改善、血管新生の促進、心筋組織の再生を目的として、心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞および骨格筋筋芽細胞から選択される細胞を移植片として利用する方法が記載されている。また、特許文献３では、心臓機能回復を目的として、骨格筋細胞組成物を移植片として利用する方法が記載されている。特許文献２および３によれば、動物実験の例において、上記の移植片を注入することにより、心機能の回復が認められ、その有効性が示されている。しかし、特許文献２および３に記載された細胞移植片は、いずれも細胞懸濁液を注入する方法であり、移植された細胞は、移植部位から流出し、移植場所の制御が困難であること、また、移植した細胞が壊死することにより効率的な移植ができないなどの課題を抱えており、さらなる改善が望まれていた。

上記問題を解決する一つの方法として、細胞シートを利用した移植法が開発されている。予め、移植片となる細胞をシート状に培養し、それらを機能が低下した生体組織に移植することにより、従来の細胞懸濁液注入法でみられていた、移植部位周辺への細胞の流出が最小限に抑えられ、再生医療の新たな技術として注目を集めている。

移植に利用される細胞シートの多くは、ヒト細胞を含め動物細胞の中でも特に付着依存性の細胞を用いて作成される。細胞シートを作成するには、動物細胞を生体外で培養し、それらを一度、基材表面上に付着させる必要がある。そして、培養した細胞をばらばらに剥離させず、その基材表面上で培養した形態を保持したまま剥離させる必要性がある。

細胞シートの作製方法として、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献４には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開を図れるようになってきた。

さらに、特許文献５では、温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で心筋組織の細胞を培養し、心筋様細胞シートを得、その後、培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、培養した細胞シート積層体をポリマー膜に密着させ、そのままポリマー膜と共に剥離させること、及びそれを所定の方法で３次元構造化させることにより、構造欠陥の少ない、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの心筋様組織として幾つかの機能を備えた細胞シート、及び３次元構造が構築されることを見出した。しかしながら、ここでの方法では細胞シートの積層化は無限に行えるものではなく、心筋様細胞シートでは３層程度、厚さにすると１００μｍ程度が限界であり、それ以上の厚さになると、培地や間質液の拡散のみでは細胞が生存できないという問題点があった。それ以上の厚さをもった細胞シートを作製するためには、３次元化された組織に酸素や栄養を行き渡らせることができる血管網を伴った細胞シートを作製する技術の開発が不可欠であり、再生医療分野の研究者ら共通の課題となっている。

ラット心筋細胞シートをラット心筋梗塞モデルへ移植すると、虚血によって低下した心機能が改善することから、心筋への細胞シートの有効性が確認されている（非特許文献１）。また、臨床応用が可能な細胞として筋芽細胞シートや脂肪組織あるいは月経血由来の間葉系幹細胞シートによって心機能が改善することも確認されており、様々な細胞種由来の細胞シートの有効性が示されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。

筋芽細胞からなる細胞シートを疾患部位へ移植すると、細胞シートから血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）や肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）など、種々のサイトカインが安定かつ持続的に分泌され、それらが血管新生を促進し、また、Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆａｃｔｏｒ １（ＳＤＦ−１）等の分泌により、幹細胞が細胞シート移植部位周辺に動員されることにより、心機能が改善する可能性が示唆されている（パラクライン効果）。さらに、細胞シートから分泌されるサイトカインは、細胞シート積層体自身にも作用し、細胞シート積層体内部の血管網構築にも影響与えていると考えられている（オートクライン効果）。

このような背景のもと、非特許文献５では１００μｍ以上の厚さをもった細胞シート積層体を得る方法として、生体内で細胞シートを積層化し、細胞シート内に血管網が新生されたところでさらに細胞シートを積層化し、これを繰り返すことで、１ｍｍ厚の心筋シート積層体が得られることを報告している。その中で、厚みのある細胞シート積層体を得るためには、積層化された細胞シート内の各細胞へ栄養や酸素が供給されることが必須であることが示唆されている。非特許文献５に記載されている方法で血管網を付与した細胞シート積層体を作製するためには、生体内にて細胞シートを繰り返し積層化しなければならず、生体側から血管網を誘導する必要がある。細胞シートを積層する都度、移植部位を開口しなくてはならず、移植側に大きな負担を強いる方法である。

生体外で１００μｍを超える厚さを持った細胞シート積層体を作製するためには、生体外で血管網を付与する技術の開発が不可欠である。ラット心筋細胞と血管内皮細胞を共培養すると、細胞シート内に血管内皮細胞のネットワーク構造が形成された細胞シート積層体を得ることができる。得られた細胞シート積層体を生体内へ移植すると、移植部周辺に細胞シートの血管内皮細胞ネットワーク由来の毛細血管が誘導され、より厚い心筋組織の再生が可能となることが示されている（非特許文献６）。また、血管内皮細胞ネットワークを構築することで、厚さをもった細胞シート積層体が作製可能となるばかりでなく、形成される血管網を通して、各種サイトカインが移植部周辺組織に効率的に分泌されるようになり、移植後の治療効果の大幅な向上も期待できる。

上記のように、当業分野において、生体外で生体組織を模した組織を作製するためには、血管網を付与する技術が必要不可欠であり、さらなる改良が求められている。しかし、これまでのところ、細胞シート積層体を含む３次元生体組織を構築する試みにおいて、３次元生体組織内に構築された血管内皮細胞ネットワークを定量的かつ簡便に評価する方法が存在していなかった。そのため、最適な血管内皮ネットワークが構築される細胞シート積層体の設計方法について報告されていなかった。そこで、発明者らは、細胞シート積層体内に３次元構造として構築される血管内皮細胞ネットワークを、２次元の解析手法で評価する技術を開発した（特許文献６）。この技術を利用することにより、細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワークを簡易的に評価することが可能となった。予め高密度の血管内皮ネットワークを構築する細胞シート積層体を設計する方法が発明できれば、厚みをもった細胞シート積層体を生体外においても安定的に作製できるだけでなく、血管新生を促進し、良好な治療効果が期待できる細胞シート積層体を得られることができるようになるものと思われる。

特開平２−２１１８６５号公報 特表２００２−５１８００６ 特表２００３−５０５４７５ 特開平０５−１９２１３８号公報 再表２００２−００８３８７号公報 国際公開２０１０／１０１２２５号公報

Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８０、１５８６−１５９５、２００５ Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１３０、１３３３−１３４１（２００５） Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１２、４５９−４６５（２００６） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２６、１６９５−１７０４（２００８） ＦＡＳＥＢ．Ｊ．、２０（６）、７０８−７１０（２００６） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３４１、５７３−５８２（２００６）

本発明は、血管新生を促進するサイトカインの産生能を有し、及び／または、高密度に血管内皮ネットワークを構築する細胞シート積層体の作製方法の確立を意図してなされたものである。すなわち、本発明は従来の方法に比べて、血管新生を促進するサイトカインを産生する能力に優れ、及び／または従来に比べ、血管内皮ネットワークが高密度に構築された細胞シート積層体を提供可能とする発明である。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、温度応答性培養基材を利用して得られた細胞シート積層体が生体内の構造に近い特殊な環境を作り出していることを見出した。さらにその細胞シート積層体を構成する細胞の種類、混在比、播種する細胞数を変えることで細胞シート積層体内の細胞の状態を変え、血管新生を促進するサイトカインの産生を最適化できることができ、また血管内皮ネットワーク構築を最適化できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成させたものである。

すなわち、本発明は、血管新生促進に関与するサイトカインの産生能を有する細胞シートであり、それが構成される細胞に少なくとも線維芽細胞が含まれ、かつ骨格筋筋芽細胞が１０％以上含まれ、及び／または血管内皮細胞ネットワークが構築されていることを特徴とする、細胞シートもしくはその積層体、並びにその利用方法を提供する。

本発明に記載される、血管新生促進に関与するサイトカインの産生能を有する細胞シート積層体、もしくは、血管新生に関与するサイトカインの産生能を有し、かつ血管内皮細胞ネットワークが構築されていることを特徴とする細胞シート積層体を作製する方法を用いると、従来提供されてきた細胞シートもしくは細胞シート積層体に比べ、血管新生に関与するサイトカインの産生能が高く、及び／または、生体外の環境においても、高密度に血管内皮ネットワークを構築した細胞シートもしくは細胞シート積層体を作製することが可能となる。また、本発明を利用することにより作製される細胞シートもしくは細胞シート積層体は、心機能回復能が高い移植材となり得る。

実施例１または３で行った、血管ネットワーク形成の定量評価の方法を示している。緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分）で示されているのが血管内皮細胞である。 実施例１で行った、筋芽細胞の密度が細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した図である。緑（白黒図面では、薄い灰色の部分）で示されているのが血管内皮細胞である。１．１５×１０^５個／ｃｍ^２の播種密度の場合を示す。 実施例１で行った、筋芽細胞の密度が細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した図である。緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分）で示されているのが血管内皮細胞である。２．３×１０^５個／ｃｍ^２の播種密度の場合を示す。 実施例１で行った、筋芽細胞の密度が細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した図である。緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分）で示されているのが血管内皮細胞である。４．６×１０^５個／ｃｍ^２の播種密度の場合を示す。 実施例１で行った、筋芽細胞の密度が細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した図である。Ｚ軸方向における各細胞シート層に存在する血管内皮細胞の割合を示す。各グラフの１〜５までの下の数字は、最下層の細胞シートを１層目として時の層数である。ｄは細胞シート積層体の厚さを示す。 実施例２で行った、筋芽細胞の密度が血管新生を促進するサイトカイン産生能に与える影響について示した図である。培養開始４８時間目における１細胞・１日あたりのサイトカイン産生量（pg）を示す。 実施例２で行った、筋芽細胞シートの積層枚数が血管新生を促進するサイトカイン産生能に与える影響について示した図である。培養開始４８時間目における１細胞・１日あたりのサイトカイン産生量（pg）を示す。 実施例２で行った、筋芽細胞と線維芽細胞を混在させた培養を行った場合の、血管新生を促進するサイトカイン（ＶＥＧＦ、ＨＧＦ）の各時間（２４時間―４８時間、１４４時間―１６８時間）における１細胞・１日当たりの産生量を示している図である（a, b）。筋芽細胞を示すmyoの下に示された数字は、細胞播種時に混在させた筋芽細胞の割合を示す。 cおよびdは、aおよびbで得られた結果を、筋芽細胞の真の割合で補正しなおした結果である。 実施例２で行った筋芽細胞（myo）と線維芽細胞が混在した細胞シートおよび細胞シート積層体から産生されるサイトカイン（ＶＥＧＦ、ＨＧＦ）の１細胞・１日当たりの産生量を示している図である（a、 b）。筋芽細胞を示すmyoの下に示された数字は、細胞播種時に混在させた筋芽細胞の割合を示す。ａ及びｂ における赤丸（白黒図面では、棒グラフ中に記載された○印）は５層の細胞シート積層体における１細胞・１日当たりのサイトカイン産生量を示す。 cおよびdは、aおよびbで得られた結果を、筋芽細胞の真の割合で補正しなおした結果である。 実施例３で行った筋芽細胞と線維芽細胞の混在比が細胞シート積層体内の血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した概念図である。 実施例３で行った筋芽細胞と線維芽細胞の混在比が細胞シート内の内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した写真である。aは筋芽細胞のみの細胞シート内に構築された血管内皮ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示し、bは筋芽細胞を50％、線維芽細胞を50％含む細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示す写真である。 実施例３で行った筋芽細胞と線維芽細胞の混在比が５層の細胞シート積層体内において血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した写真である。aは筋芽細胞を81％、線維芽細胞を19％含む細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示し、bは筋芽細胞を61％、線維芽細胞を39％含む細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示し、cは筋芽細胞を41％、線維芽細胞を59％含む細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示し、dは線維芽細胞を100％含む細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））を示す写真である。 実施例３で行った筋芽細胞と線維芽細胞の混在比が５層の細胞シート積層体内において血管内皮細胞ネットワーク形成に与える影響について示した写真である。再上段の図はＸＹ軸方向の血管内皮ネットワーク（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））の様子を示す。２段目の図はＺ軸方向に存在する血管内皮細胞（緑（白黒図面では、薄い灰色の網状部分））の様子を示す。３段目のグラフは細胞シート各層に存在する血管内皮細胞の割合を示す。図は全て細胞シート積層完了後の培養開始９６時間後の血管内皮細胞ネットワークの様子を示している。左側の列ほど細胞シート作製時に播種した筋芽細胞の割合が多く、右側の列になるに従って線維芽細胞の割合が多い細胞シート積層体である（左から、筋芽細胞の割合：１００％、８０％、６０％、４０％、２０％、０％）。各グラフの１〜５までの下の数字は、最下層の細胞シートを１層目として時の層数である。ｈは細胞シート積層体の厚さを示している。 実施例３で行った筋芽細胞と線維芽細胞の混在した細胞シート積層体内にできる血管内皮細胞ネットワークの構築度について示したグラフである。Ｌは１ｍｍ^２あたりのネットワークの長さの合計を表し、Ｎ_Ｔは１ｍｍ^２あたりのネットワークの端点数を表し、Ｌ／Ｎ_ＴはＬをＮ_Ｔで除した値である。影をつけた領域は、筋芽細胞と線維芽細胞からなる細胞シート積層体における最適な血管内皮ネットワークが構築される混在比の範囲を示す。

本発明は、血管新生促進に関与するサイトカインを分泌し、及び／または、高密度の血管内皮細胞ネットワークを構築した細胞シートもしくはその積層体、およびその利用方法に関するものである。本発明により提供される細胞シート積層体は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）から選択される少なくとも１つの血管新生を促進するサイトカインが、従来の方法により作製する細胞シートに比べて高濃度に産生される。また、本発明により、血管新生促進に関与するサイトカインを高濃度に分泌し、及び／または、最適化した血管内皮細胞ネットワークを有する細胞シート積層体の提供が可能となる。

本発明により作製される細胞シート積層体内に構築された、高密度の血管内皮細胞ネットワークを評価する手法として、２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも一つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞シート積層体、標的細胞の２次元解析細胞評価システムを用いるのが好ましい（特許文献：国際公開２０１０／１０１２２５号公報参照）。その２次元解析装置とは、細胞を２次元の情報や平面の情報として得る手法であれば特に限定されるものではないが、例えばその装置としては、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、実体顕微鏡、レーザー顕微鏡、共焦点顕微鏡等の顕微鏡類、プレートリーダー装置類、その他マクロレンズを有する装置類等が挙げられる。観察は画像上で行ってもよく、顕微鏡視野で目視によって行ってもよい。また、その解析手法も上述した装置を利用する通常の方法であれば特に限定されないが、例えば細胞を試薬、蛋白質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色しその程度を上述した顕微鏡類等で観察する方法等が挙げられる。標識細胞とはこの蛍光染色及び/または色素染色された細胞を意味する。上記の評価方法を用い、本発明により作製した細胞シート積層体を評価することにより、血管新生を促進するサイトカインを大量に産生すること、及び／または最適な血管内皮ネットワークを構築することを特徴とする、細胞シートもしくは細胞シート積層体が、確実に製造できたことを確認することが出来、望ましい。

本発明による細胞シート積層体を作製するには温度応答性基材が必要となる。この基材とは、特定の表面を持った細胞培養基材に電子線照射において温度応答性ポリマーをグラフト化させたものである。基材の材質とは、特に限定されるものではないが、細胞付着表面としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのいずれか、若しくは２以上を組み合わせたものである。この中で特にポリスチレンは細胞培養用基材で通常使われており好適である。基材の被覆に用いられる温度応答性ポリマーは、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度０℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜５０℃を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。

本発明に用いる温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。

本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ^２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ^２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ^２である。１．１μｇ／ｃｍ^２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ^２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ^２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ^２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ^２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。

本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用してもよい。

以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。

被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。

本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。

さらに温度応答性ポリマーの培養基材への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。

本発明で提供する細胞シート積層体は、細胞シートが単独若しくは別の細胞からなるシートと組み合わされた状態で積層化されたものでも良い。その際、２種以上の異なる細胞を利用すると異なる細胞間で相互作用し合い、細胞の流動性が変化した細胞シートが得られたり、血管新生を促進するサイトカイン産生が高い細胞シートが得られたりし、好ましい。本発明で利用される細胞は特に限定されないが、細胞シートもしくは細胞シート積層体内の流動性が、血管内皮細胞ネットワーク構築の成熟度に影響することから、流動性の高い細胞と流動性の低い細胞との組み合わせから成る細胞シートもしくは細胞シート積層体が望ましい。流動性が高い細胞としては骨格筋筋芽細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、さらに心筋細胞、表皮基底膜細胞等が挙げられるが特に限定さるものではない。また、流動性が低い細胞としては、線維芽細胞、分化した表皮角化細胞が挙げられるが特に限定さるものではない。流動性の高い細胞と流動性の低い細胞を混合することで、さまざまな流動性を有する細胞シート積層体を作製することが可能となる。流動性の高い細胞と流動性の低い細胞の組み合わせとしては、例えば、筋組織の細胞と線維芽細胞からなる組み合わせでも良く、具体的には、骨格筋筋芽細胞と線維芽細胞の組み合わせでも良く、あるいは心筋細胞と線維芽細胞の組み合わせでも良い。筋組織の細胞と線維芽細胞の組み合わせからなる細胞シートを作製する際、それぞれの細胞を混在させる割合としては、筋組織の細胞を９０％〜２５％の割合で含み、残りの割合に線維芽細胞を含む細胞シートを作製するのが良く、好ましくは、筋組織の細胞を７５％〜２５％の割合で含み、残りの割合に線維芽細胞を含む細胞シートを作製するのが良く、最も好ましくは、筋組織の細胞を６０％〜４０％の割合で含み、残りの割合に線維芽細胞を含む細胞シートを作製するのが良い。本発明により、最適な細胞の混在比により作製された細胞シートは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）から選択される少なくとも１つの血管新生を促進するサイトカインを高濃度に産生し、また、血管内皮細胞ネットワークが構築される場として最適な流動性を有する細胞シートとなり、好ましい。

ＶＥＧＦとは血管内皮細胞増殖因子と呼ばれ、一般に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体 (ＶＥＧＦＲ) にリガンドとして結合する糖タンパクである。増殖、遊走、分化を刺激したり、プラスミノーゲンアクチベーターやコラゲナーゼといったプロテアーゼ活性、およびコラーゲンゲルの中での血管様構造形成の、いわゆる血管新生の全てのステップを促進し、ｉｎ ｖｉｖｏでも血管新生を促進する因子として知られる。ＶＥＧＦは微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きをもつが、その他単球・マクロファージの活性化にも関与する。本発明の例の場合、主に骨格筋筋芽細胞から分泌され、骨格筋筋芽細胞および線維芽細胞からなる細胞シートでは、骨格筋筋芽細胞の割合に応じて、１細胞あたりのＶＥＧＦの産生量が多い細胞シートが作製される。細胞シートもしくは細胞シート積層体から産生されるＶＥＧＦは、細胞シート積層体の内部の血管内皮ネットワーク構築を促進し、また、患部へ移植した際は、移植部周辺へのＶＥＧＦ分泌を行い、移植部周辺の血管新生を促進するものと考えられる。

ＨＧＦとは肝細胞増殖因子と呼ばれ、一般的に線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞などから産生され、主に上皮系細胞の増殖や機能を制御するパラクリン因子としての作用が特徴である因子である。ＨＧＦは肝実質細胞ばかりでなく、血管内皮細胞では遊走能の促進、管腔形成などの形態形成誘導作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用および免疫応答調節作用なども有する。本発明の例の場合、ＨＧＦは骨格格筋筋芽細胞および線維芽細胞が相互作用することにより分泌が促進される。骨格筋筋芽細胞および線維芽細胞からなる細胞シートもしくは細胞シート積層体において、骨格筋筋芽細胞の割合が９０％〜２５％、好ましくは７５％〜２５％、最も好ましくは６０％〜４０％含まれると、１細胞あたりのＨＧＦが多く産生される細胞シートが作製され、良い。細胞シートもしくは細胞シート積層体から産生されるＨＧＦにより、細胞シート積層体自身の内部の血管内皮ネットワーク構築、管空形成を促進し、また、患部へ移植した際は、移植部周辺へのＨＧＦ分泌を行い、移植部周辺の血管新生を促進するものと考えられる。

ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、どちらも主要な血管新生促進因子であり、コラーゲンゲル、マトリゲル内の内皮細胞培養系の２次元的評価では、両因子を作用させると、血管構造の占有面積や全長に影響を与え、相乗効果があることが観測されている（非特許文献：Xin et al., “Hepatocyte growth factor enhances vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo,” Am. J. Pathol., 158, 1111-1120 (2001)、Sulpice et al., “Cross-talk between the VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells,” Biol. Cell, 101, 525-539 (2009)）。そのため、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの双方が産生される細胞シートもしくは細胞シート積層体であってもよい。ＶＥＧＦおよびＨＧＦの双方の因子が産生されることにより、相乗効果が促進され、細胞シートもしくは細胞シート積層体内での血管内皮細胞ネットワーク形成の促進、管腔形成などの形態形成誘導作用、血管新生作用が促され、好ましい。骨格筋筋芽細胞および線維芽細胞からなる細胞シートもしくは細胞シート積層体においては、骨格筋筋芽細胞の割合が７５％〜２５％、好ましくは６０％〜４０％含まれると、１細胞あたりのＶＥＧＦおよびＨＧＦが多く産生される細胞シートが作製され、好ましい。細胞シートもしくは細胞シート積層体から産生されるＶＥＧＦおよびＨＧＦにより、細胞シート積層体内部には高密度な血管内皮ネットワークや管空形成が促進され、また、患部へ移植した際は、移植部周辺へのＶＥＧＦおよびＨＧＦ分泌を行い、移植部周辺の血管新生を促進するものと考えられる。

本発明の方法において、細胞シートを作製する際、播種する細胞数は、使用細胞の動物種、細胞種によって異なるが、本発明の例にある骨格筋筋芽細胞と線維芽細胞のうち１種類、もしくは２種類の細胞からなる細胞シートを作製するには、細胞シート１枚あたり、１．０×１０^５〜７．０×１０^５個／ｃｍ^２が良く、好ましくは１．１５×１０^５〜４．６×１０^５個／ｃｍ^２が良く、さらに好ましくは１．５×１０^５〜４．３×１０^５個／ｃｍ^２が良く、最も好ましくは２．０×１０^５〜３．９×１０^６個／ｃｍ^２が良い。血管内皮細胞ネットワークを伴った細胞シートもしくは細胞シート積層体を作製する場合、播種濃度が１．０×１０^５個／ｃｍ^２以下だと細胞密度が低く、血管内皮細胞の遊走が早くなり過ぎ、血管内皮細胞ネットワークを構築しづらくなり、本発明を実施する点において好ましくない。６．０×１０^５個／ｃｍ^２以上の場合、血管内皮細胞の遊走が遅くなり、十分な血管内皮細胞ネットワークが構築されず、本発明を実施する点において好ましくない。

この細胞シート積層体の流動性は本発明の目的に限らず、例えば移植を目的とした細胞シートの指標になり得るものと考える。例えば、実施例で述べるように、細胞シート積層体の流動性がある程度高ければ、それだけ生体側から血管が侵入しやすくなり、それだけ移植した細胞シート積層体が生体に適合する結果となる。また、その他の細胞においても積層体の流動性が高いと血管網が侵入しやすいものと期待される。

細胞シート積層体を作製する際、単層の細胞シートを積層する位置、順番、積層回数は特に制約されるものではないが、被覆又は補填される組織に応じ、接着性の強い滑膜由来細胞シートを使用すること等で適宜変えられる。また、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。積層回数が多くなると積層化した中心部の細胞シートに酸素、栄養分が行き届き難くなり好ましくない。その際には、細胞シート積層体内に血管網を構築させる方法で防ぐことができる。血管網を構築する方法は特に限定されるものではないが、例えば、血管内皮細胞のみからなる細胞シート、もしくは、血管内皮細胞を一定割合含んでいる細胞シートを、本発明の方法により作製した細胞シートの間に挟み込む、あるいは最上層に積層する、あるいは最下層に敷く方法により作製しても良く、あらかじめ培養基材上に血管内皮細胞を播種し、播種された血管内皮細胞上に細胞シートを積層化する方法で作製しても良い。あらかじめ培養基材上に播種した血管内皮細胞の上に細胞シートを積層化する方法で細胞シート積層体を作製する場合、播種する血管内皮細胞数の数は、積層化する細胞の種類、血管内皮細胞の種類によって変わるが、例えば、０．１〜５.０×１０^４個／ｃｍ^２が良く、好ましくは０．３〜３．０×１０^４個／ｃｍ^２が良く、最も好ましくは０．５〜２．０×１０^４個／ｃｍ^２が良い。０．１×１０^４個／ｃｍ^２以下である、血管内皮細胞ネットワークが十分に形成されず、また５．０×１０^４個／ｃｍ^２以上であると、血管内皮ネットワーク構造が密になり過ぎるので好ましくない。

本発明における細胞シート積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、血管内皮細胞用基礎培地でもよく、骨格筋筋芽細胞用基礎培地でもよく、線維芽細胞用基礎培地でもよく、広範な固着細胞の培養に用いられる基礎培地でもよく、後から血管新生に関与する１または複数のサイトカインを添加した培地でもよい。細胞の種類に応じて作られた培地には、それぞれの細胞培養特性に応じた組成（例えば、サイトカイン添加等）になっている。特に血管内皮細胞用基礎培地には、血管新生に関与するサイトカインが添付されており、広範な固着細胞の培養に用いられる基礎培地に比べ、高価である。本発明によれば、血管新生を促進するサイトカインを細胞シート積層体自身が産生するため、血管新生を促進するサイトカインが添加されていない基礎培地を使用しても、細胞シート積層体内に血管内皮細胞ネットワークが構築される。安価な基礎培地を使用しても血管内皮細胞ネットワーク形成を伴った細胞シート積層体が作製可能となり、最終的には移植にかかるコストの軽減に繋がる。また、細胞シート積層体自身が血管新生を促進するサイトカインを分泌するため、移植部位周辺にも血管新生を促進し、治療効果の高い移植材となることが期待できる。これらの培地には、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、使用される培養細胞移動治具は剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば特に限定されるわけではなく、例えば多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等が挙げられ、積層化作業を行い易くするために柄の付いた治具に多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等を取り付けたものを利用しても良い。

本発明における細胞シート積層体とは、温度応答性ポリマーが被覆された細胞培養基材上から剥離され、必要に応じて培養細胞移動治具を用いることで得られた培養細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けておらず、培養時に形成される細胞−基材間の基底膜様蛋白質も酵素による破壊を受けておらず、また、細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持され、構造的欠陥が少なく強度の高いものである。

本発明では、血管内皮ネットワークを構築した細胞シート積層体の利用方法について特に限定されるものではないが、例えば、細胞シート積層体を構成する細胞を筋芽細胞とし、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、蛍光顕微鏡により標識細胞の遊走性を追跡することで血管網構築を評価することができる。

本発明の細胞は限定されるものではなく、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。この中で、動物細胞は市販されているものが多く好都合である。動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。また、上記の各種細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させて得られた細胞でも良く、何ら限定されるものではない。

本発明に利用される細胞は特に限定するものではないが、例えば細胞を試薬、蛋白質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色したものでも良い。

ヒトに対し、本発明で示す細胞シート積層体を利用すれば、移植された細胞シート積層体はヒトの生体内で機能を長期間発現することとなる。そして、剥離された細胞シート積層体の大きさや形状、もしくは両者で機能の発現量を制御できる。このような細胞シート積層体は、例えば構成する細胞として、心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞とすれば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される心臓の疾患または障害を伴う各疾患の治療、もしくは心筋壁の再建を目的に使用されるが、使用する細胞種によって適宜、移植先が特定され、特に限定されるものではない。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

［実施例１］
血管内皮細胞と筋芽細胞シートの共培養システムを構築した（特許文献：国際公開２０１０／１０１２２５号公報）。図１は細胞シート内に構築された血管内皮細胞ネットワーク形成の定量的評価の方法を表している。細胞シート内に構築された血管内皮細胞（緑）ネットワークを画像処理し、ネットワークの長さ（Ｌ）およびネットワークの端点数（Ｎ_Ｔ）を導き出す。ネットワークの長さ（Ｌ）を端点数（Ｎ_Ｔ）で除する（Ｌ／Ｎ_Ｔ）ことで、血管内皮ネットワークの構築度合を比較することができるシステムである。

（高密度・低密度筋芽細胞シートにおける血管内皮細胞の挙動解析）
上記のシステムを用い、細胞密度の異なる細胞シートと内皮細胞を共培養し、細胞密度の違いが内皮細胞ネットワーク形成に影響を与えるか検討する。また、内皮細胞の形状や結合度を観察し、それぞれの条件におけるネットワーク形成過程を予測する。

（実験条件）
播種密度が1.15×10⁵ cells/cm²（超低密度）、2.3×10⁵cells/cm²（低密度）、4.6×10⁵ cells/cm²（高密度）の単層筋芽細胞シートを作製し、CellTracker Orange（赤）で染色後、5層に積層した。96 h培養後、内皮細胞を抗CD31抗体で染色しネットワークを観察した（図２、図３、図４、図５）。実験条件は以下の通りである。

（初代細胞培養）
細胞培養にはCorning社のポリスチレン製培養容器（225 cm² T-flask）を用いた。筋芽細胞培養には培養面にラミニン（Sigma製）を塗布した。ラミニン塗布面はリン酸緩衝溶液（PBS、 Sigma 製）によるラミニンの20倍希釈溶液を培養面25cm²当たり1ml添加し、37 ℃・5 % CO₂存在下での1 hのインキュベーションによりタンパクを吸着させた後、PBSで洗浄することによって作製した。

（単層継代培養）
実験には足場依存性ヒト骨格筋筋芽細胞(Camblex社製) および正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(Lonza社製)を用い、CO₂インキュベータ（MCO-17AI、三洋電機（株）製）内で37℃、5%CO₂雰囲気下で培養を行った。筋芽細胞培養には、培地は抗生物質-抗真菌剤 100×(Invitrogen社製)を1 vol%、1M HEPES buffer(Sigma社製)を2 vol%、ウシ胎児由来血清(以後FBS、 GIBCO社製)を10vol％でそれぞれ添加したDulbecco’s modified Eagles Medium （DMEM、Sigma製） を用いた（以下DMEM(10% FBS)）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma社製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma社製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37℃で3 min反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 minの遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度1.0×10³cells/cm²で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は24 h毎に行った。

内皮細胞培養には、培地はEBM-2（Lonza製）を用いた（以下EBM）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37℃で5 min 反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1450 rpm、室温にて5 minの遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度2.5×10³cells/cm²で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は48 h毎に行った。

（筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養）
細胞培養基材として、ポリスチレン製の35 mm culture dish（Corning製）および温度応答性培養容器（24 穴マルチウェル、CellSeed社製）を用いた。温度応答性培養容器とはポリスチレン面にN-イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合させた培養面であり、３２℃を臨界点として可逆的に表面が疎水性、親水性と変化するため、温度変化により細胞間接着を維持したまま容易に細胞を培養面から剥離させることが可能である。

筋芽細胞シートの作製は、37℃でのプレインキュベーション24 h後にコンフルエントとなるように、温度応答性培養容器に1.15×10⁵cells/cm²、2.3×10⁵ cells/cm²、4.6×10⁵cells/cm²の量で筋芽細胞を播種した。24 h後、20 ℃、5 %CO₂雰囲気下で30分インキュベートして剥離させた細胞シートを上部からゼラチンゲルで回収する。これが1層の細胞シートとなり、細胞の剥離・回収を繰り返すことで多層シートの作製を行う。

シート共培養システムの構築は、以下の手順で行った。あらかじめ内皮細胞を35mm culture dishにて24h前培養した。ここで培地は、20%FBSを含むEBM培地を使用し、内皮細胞の播種密度は、0.5×10⁴cells/cm²とした。前培養後、内皮細胞を含むdish上に、多層の筋芽細胞シートを載せ、20℃、2h加湿状態にて静置（細胞シートのdish上への転写）、10％FBSを含むDMEMを導入し1h、37℃で静置（ゼラチン溶解）、そして培地交換を行い、培養開始とした。

細胞質染色は、組織の高さを知るために、また筋芽細胞の流動を調べるときにシートを色分けするために、筋芽細胞をシート作製前に細胞質の染色を行う。0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37℃で3 min反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 minの遠心分離により細胞を回収し、さらに無血清培地により懸濁した細胞懸濁液に対して、等量の無血清培地希釈の10μM CellTracker Orange CMTMR (Molecular probes製) (またはCellTracker green CMFDA (Molecular probes製))を加えて、5 mM CellTrakcer Dyeとなるようにする。37 ℃、5 % CO²雰囲気下で15 min静置した後、1000 rpm、室温にて5 minの遠心分離を行って細胞を回収し、再びDMEM 10% FBSで懸濁を行った後、1.15×10⁵cells/cm²、2.3×10⁵ cells/cm²、4.6×10⁵cells/cm²の量で播種する。

抗体染色は、筋芽細胞と内皮細胞が混在する組織内で内皮細胞を同定して観察するためにAnti-CD31(Mouse MonoclonalAnti-Human CD31、DAKO社製)による抗体染色を行った。CD31は内皮細胞に存在する分子量100kDの糖タンパクを認識する抗体である。細胞をPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬株式会社製）を加え、一晩4 ℃で静置し固定した。PBSで培養面を2回洗い、PBSで希釈した0.1%Triton X-100を加え、細胞に透過性を付与した。PBSで2回洗浄した後、PBS希釈の0.1 %ウシ血清由来アルブミン（和光純薬株式会社製）に1 h浸した。その後、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで40倍に希釈したanti-CD31抗体に浸し、4 ℃で一晩静置した。PBSで2回洗い、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで200倍に希釈した二次抗体（Alexa Fluor(R) 488 goat anti-mouse IgG、Molecular Probes製）に室温で1 h浸した。PBSにて2回洗浄した後、Slow fade(Molecular Probes社製)を1、2滴たらして、カバーガラス(IWAKI社製)をかけて、共焦点顕微鏡(EX-20、OLYNPUS社製)により三次元画像を取得し、細胞観察を行った。

（細胞挙動の評価手順）
血管ネットワークの定量評価は、共焦点レーザー顕微鏡で取得したネットワークの写真をImage ProPlusを用いてネットワークを2次元で画像解析する(図１)。目視にて決定した閾値により二値化して、モフォロジカルフィルタを用いて細線化した画像のネットワークの長さ（Ｌ）と端点数（Ｎ_Ｔ）をカウントして、それぞれのネットワークの比較を行った。

96 h培養後、内皮細胞ネットワークの値をネットワーク度（ネットワーク長さ/端点数）により定量評価した。その結果、超低密度シートにおいては、ネットワーク形成が行われず、解析不能であった（図２）。低密度シートにおいてL/N_Tの平均値が1.12 mm/tips、高密度シートにおいては0.54 mm/tipsとなり、高密度シートの場合は低密度シートに比べ約2分の1の値になった（図３、図４）。また、ネットワーク長さL（mm）に違いは見られなかったが、端点数N_T（tips）は高密度シートの場合において約2倍の値をとった。

96 h培養後の内皮細胞の各層における分布を図５に示す。低密度シートでは約7割の内皮細胞が5層目に存在している一方、高密度シートでは、内皮細胞は1層目と5層目に多く分布が見られた。

図３および図４より、高密度シート（4.6×10⁵cells/cm²）、低密度シート（2.3×10⁵cells/cm²）それぞれにおいて、ネットワーク長さL（mm）に違いはなかったため、内皮細胞数は同じであったと考えられる。一方、端点数Ｎ_Ｔ（tips）は高密度シートにおいて増加していたことから、高密度シート内においては内皮細胞同士のつながりが悪くなったと考えられる。内皮細胞はシート内で筋芽細胞と共に動いており、水平方向にネットワークを形成するが、高密度シートは低密度シートに比べ流動性が小さいため、内皮細胞の水平方向の遊走が阻害されネットワークの繋がりが悪くなったと考えられる。

また、低密度、高密度シートそれぞれで5層目に内皮細胞の集塊が観察された。集塊ができる理由として、シート内部に遊走した内皮細胞がシート上部に到達し，一部増殖するためであると考えられる。高密度シートでは低密度シートに比べ５層目の分布が減少していることから、内皮細胞の鉛直方向の遊走が阻害されたと考えられる（図５）。

［実施例２］
（培養状態に依存した筋芽細胞のサイトカイン生成能）
５層細胞シートはコンフルエントで形成された単層シートが立体的に重ねられた立体組織であり、３次元的にも密なコンフルエント状態といえる。細胞は接触阻害によって増殖性を一時的に失った状態にある。コンフルエント状態で立体培養されているシート形成細胞のサイトカイン生成を理解するために、より単純な系である通常の平面培養時のサイトカイン特性と比較した。培養状態は、低密度、高密度、シート、積層シートと細胞の疎密培養、平面・立体培養に応じて階層構造になると見做せる。この階層構造に対して細胞あたりサイトカイン生成を検討した。

筋芽細胞を1.0 x 10⁴ cells/cm²、8.0 x 10⁴cells/cm²、 2.3 x 10⁵cells/cm²（シートと同じ播種密度）の密度で播種し、培養初期の48 h（即ち、培養を開始してから４８時間後）における培養培地を採取し、VEGF、 HGFの生成量を調べた。トリパンブルー染色により算出した細胞数で規格化し、細胞あたりの平均生成レベルとして比較を行った。

培養48 hで採取した培地から求めた細胞あたりのVEGF、 HGFの生成量を図６に示す。ELISAで検出された濃度と培地体積から全生成量を求め、上記細胞密度と培養皿面積より得られた全細胞数で規格化することによって算出した。比較のため、筋芽細胞5層シートの培養48 h における生成量を細胞数で規格化した値を併せて載せた。VEGFは細胞密度が大きいほど細胞あたり生成量が増大しており、特にコンフルエントの密度（1.9 x 10⁵ cells/cm²）で最大となっている。この結果は、密なコンフルエント状態をとることで筋芽細胞のVEGF生成能が増大することを示している。5層シート培養の値もこれに近く、コンフルエント状態の細胞のみで作製されたシートは移植材料としてVEGF分泌能（分泌効率）の点において有効であると考えられる。

一方、図７に示すように、細胞シート作成法が異なるが、細胞シートの積層数を上昇に伴い、上記の結果同様、VEGF、HGFともに生成量は、上昇することが明らかとなった。これらは、細胞シート内の細胞密度の変化に伴う細胞の遊走性の違いが生じその結果、代謝が変化し、結果、生成量が変化されていると考えられる。

以上より、筋芽細胞移植には、単細胞で行うより、細胞シート状、特に積層細胞シートの構造として、細胞を供給することが、患部におけるサイトカイン生成量の観点から有効であることを示唆した。

骨格筋組織から採取され単離された筋芽細胞群には線維芽細胞が混在することが分かっている（Rhoads et al.、“Satellite cell-mediated angiogenesis in vitro coincides with hypoxia-inducible factor pathway、” Am J. Physiol. Cell Physiol.、 296、C1321-C1328、 (2009)）。線維芽細胞は多様な組織に存在し、炎症反応のとき患部に移動し治癒に働くことが知られている。特に活発に細胞外マトリックス（ECM; Extracellular matrix）やサイトカインを生成することで、生体組織の構造保持や細胞の生理学的状態の維持に寄与すると考えられている（Tomasak et al.、“Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodeling、” Nat. Rev. Mol. Cell Biol.、3、349-363 (2002)）。従って、混在する線維芽細胞が細胞シート全体の力学的性質やシート内の筋芽細胞の遊走性・分化に影響を与える可能性がある。しかし、これらシート全体の性質と含まれる線維芽細胞の割合の関係については未だ得られていない。線維芽細胞が高い割合で含まれるとき、細胞間接着に関わる膜蛋白質やECMの発現・形成パターン、細胞遊走性に寄与するサイトカイン類の分泌パターンが変化する可能性がある。

そこで、筋芽細胞と真皮線維芽細胞の混合細胞から作成した5層細胞シートをポリスチレン面に播種、シート培養を行い24 h毎に採取した培養培地から、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法により、サイトカイン類分泌量を測定した。筋芽細胞の割合は100%、 75%、 50%と変化させこれらの筋芽細胞純度依存性を調べた。

細胞シートのもつパラクライン効果の中でも、血管新生促進効果を有すると云われているサイトカイン類の蛋白レベルでの評価を行った。シート移植後に心疾患部に対し血管内皮細胞（および血液中に含まれる内皮前駆細胞）への遊走性促進により移植組織内に血管新生を促進させるターゲットとして、Growth factor類からVEGF、 HGFを挙げた。培養培地を24 h毎に取得し各時点で取得された培地から得られた吸光度より検出濃度を求め培地体積を掛けることで、シートサンプルが24 hに生成した各因子の質量として評価した（図８a、 b）。
・実験条件
細胞： ヒト骨格筋筋芽細胞、Np 6 (Lot number 4F1618; Lonza, Inc.)
ヒト真皮線維芽細胞、Np 8 (Lot number 3C0243; Cascade Biologics, Inc.)
培地： DMEM (10% FBS)
培養面： ポリスチレン培養皿（5層シート培養）、24well温度応答性培養面（シート形成; CellSeed, Inc.）、ラミニンコート-ポリスチレン培養面（筋芽細胞増殖）
培養環境： 37℃、5% CO₂ in air
播種密度： 2.3 x 10⁵ cells / cm²（シート形成）
シート培養期間： 48h、 168h
培地体積： 1.76 mL（5層シート培養、培地深さ0.2 cm）
培地交換： 24時間毎
採取試料： 24時間毎の培養培地（ELISA）
ターゲット： VEGF (Vascular endothelial growth factor)
HGF (Hepatocyte growth factor)

図８a、bに示す通り、VEGF、 HGFは培養48hでは濃度で500〜5000 pg/mLの範囲で検出されており、例えば内皮細胞の遊走性やネットワーク形成に対してVEGF、 HGF添加による促進効果が観測できるオーダー（VEGF: 3000 pg/mL〜10 ng/mL; HGF: 2500〜5000 pg/mL）と部分的に一致した（Pepper et al.、 “Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro、” Biochem. Biophys. Res. Com.、 189、 824-831 (1992)、Bussolino et al.、 “Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth、” J. Cell Biol.、119、629-641 (1992)）。線維芽細胞混合に伴いVEGF生成は減少したが、HGF生成は増大した。これら顕著な変化は線維芽細胞混合率に対してほぼ線形の変化を示したので、主としてVEGF は筋芽細胞が、HGFは線維芽細胞が分泌していると示唆された。VEGFの蛋白質分泌能においては、筋芽細胞シートに線維芽細胞が混合されると内皮細胞にとって好ましくないと考えられるがHGF分泌能については逆であり、細胞シートにおける筋芽細胞と線維芽細胞の最適な含有バランスが存在するのかもしれない。

以上のように、５層筋芽細胞シートの培養において線維芽細胞含有による各サイトカイン特性への変調が観られている。ここで筋芽細胞群には元々線維芽細胞が混在しており、２重抗体染色（筋芽細胞: desmin; 線維芽細胞: TE-7 antigen）により筋芽細胞ポピュレーションは78.2±2.1 % と評価されている。そこで図８a、 bについて培養初期の48 hにおけるサイトカイン生成量を実際の筋芽細胞ポピュレーションR_Mに対して図８c、 dに再プロットした。

５層細胞シートの模倣系として高密度培養における筋芽細胞に対する真皮線維芽細胞含有の効果を調べた。筋芽細胞と線維芽細胞をそれぞれ100 : 0、 75 : 25、 50 : 50、 25 : 75、 0 : 100で混合し細胞群を調整した（細胞シートの系では50%を超える真皮線維芽細胞を含む細胞群を用いてのシート形成は不可能であった）。これら細胞群を高密度（1.9 x 10⁵ cells/cm²）で播種、培養24−48 h（即ち、培養を開始してから２４−４８時間後）における培地を採取し、VEGFおよびHGFの生成量を測定した。カウントより求めた細胞数で規格化し、細胞あたり生成量として比較した。結果を図１０に示す。比較のために載せた5層シートの培養48 hにおけるVEGFおよびHGF生成は高密度培養に近い混合率依存性を示していた。VEGF生成量は線維芽細胞の混合に伴い単調減少を示したが、HGF生成量については50%混合で最大値を示した。従って、VEGF生成には主に筋芽細胞が寄与すると考えられるが、HGFは筋芽細胞と線維芽細胞の相互作用によって協同的に生成されることが示唆される（図９）。

［実施例３］
（筋芽・線維芽細胞混合シートに対する内皮細胞のネットワーク形成）
内皮細胞の上に筋芽細胞シートおよび筋芽・線維芽細胞混合シートを載せ共培養を行った。細胞シート自体のもつシート流動性やサイトカイン分泌パターンなどの特性は線維芽細胞混合によって変調されることが分かったが、これは血管内皮細胞にとって周囲の環境の変調を与えうると考えられる。そこで混合シートがネットワーク構造形成へどのような影響を与え得るかを調べた（図１０）。

図１１に、骨格筋筋芽細胞と真皮線維芽細胞による混合シートを用いたネットワーク形成に関する結果を示した。共培養48h（即ち、骨格筋筋芽細胞と真皮線維芽細胞による混合シートと、血管内皮細胞との共培養を開始してから４８時間後）において、筋芽細胞50%混合シートの方が、筋芽細胞100%シートよりも、密で枝分かれの多く均質なネットワーク構造を形成していた。

本研究では、ヒト骨格筋組織由来の線維芽細胞が入手困難であるため、ヒト真皮由来の線維芽細胞を混合することによって筋芽細胞シートに対する線維芽細胞含有の効果をこれまで調べてきた。細胞形態、細胞骨格分布や特異的マーカーによる評価では骨格筋、真皮、肺、皮下組織由来の線維芽細胞はいずれも類似した形質をもつことが報告されている（Xin et al.、“Hepatocyte growth factor enhances vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo、” Am. J. Pathol.、158、1111-1120 (2001)）。しかしながら、筋芽細胞は骨格筋組織由来の線維芽細胞を含有しており、実際にそのロットによって混入の程度は異なっている。再生医療において不可欠とされる患者本人からの細胞増殖の過程で、線維芽細胞含有率は増大する可能性がある。したがって、本来含有されている骨格筋由来の線維芽細胞による影響についての知見を得ることが、移植材料としての細胞シートの特性評価には重要である。そこで、医学部のプロジェクト研究チームによって保持されている細胞を用いて、ネットワーク形成への影響を検討した。

シート移植の臨床治験の為に同一患者から採取された、筋芽細胞ロット（シート形成時において、筋芽細胞純度80%（ロットA）、 10%（ロットB）の2種類）を用いて、それぞれを100 : 0、 75 : 25、 50 : 50で混合することで、それぞれ筋芽細胞比率が80%、 62%、 45%の細胞懸濁液を調整した（抗体染色により筋芽細胞以外は、骨格筋由来の線維芽細胞であることを確認している）。これらを用いて５層細胞シートを作製し、内皮細胞との共培養48 hにおけるネットワーク形成を調べた（図１２）。
・実験条件
細胞： ヒト骨格筋筋芽細胞、Np 3 (Lot hMB21A; desmin陽性 81%)
ヒト骨格筋筋芽細胞、Np 3 (Lot hMB21; desmin陽性0%)
ヒト臍帯静脈内皮細胞、Np 4 (Lot 4F0709; Lonza、 Walkersville、MD、USA)
培地： DMEM (10% FBS; 筋芽細胞)
培養面： ポリスチレン培養皿（5層シート培養）、24well温度応答性培養面（シート形成; CellSeed、 Inc.）、ラミニンコート-ポリスチレン培養面（筋芽細胞増殖）
培養環境： 37℃、5% CO₂ in air
播種密度： 2.3 x 10⁵ cells / cm²（シート形成）
培地体積： 1.76 mL（5層シート培養、培地深さ0.2 cm DMEM/10% FBS）
培地交換： 24時間毎
共培養期間：48 h
染色試薬： 抗CD-31抗体（内皮細胞マーカー）、 CellTracker Orange CMTMR（シート形成細胞・細胞質染色）
観察： 共焦点レーザー走査顕微鏡（x10）

図１２および図１３に共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた観察写真を載せた。筋芽細胞81%シートとの共培養に比べ、線維芽細胞含有率が増大した61%、 41%シートではネットワーク構造が密でより均一に形成されているように観察できた。細胞シート形成には筋芽細胞：線維芽細胞の混在比が筋芽細胞ベースで100%以下から40％以上が好ましいことが分かった。少なくとも筋芽細胞シートにおけるネットワーク形成に関しては、骨格筋由来の線維芽細胞も真皮由来の線維芽細胞と類似した効果を与えると考えられる。

細胞シートのサイトカイン生成の測定から、筋芽細胞群への線維芽細胞含有に伴いVEGF、HGFの生成パターンが逆方向に変調されることをこれまでに確認している。どちらも主要な血管新生促進因子と云われており、例えば、コラーゲンゲル、マトリゲル内の内皮細胞培養系の２次元的評価では、血管構造の占有面積や全長に、両因子を作用させることによる相乗効果が観測されている。また内皮細胞に対し細胞骨格に関するシグナリングに関与することで、HGFがネットワーク構造の枝分かれ構造に作用すると考えられている（Sulpice et al.、“Cross-talk between the VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells、” Biol. Cell、101、525-539 (2009)）。従って、これら両因子は内皮細胞における血管新生シグナリングにおいて相補的な役割をもっている可能性があり、混合シートとの共培養で観られたネットワーク形成への効果に対して、関与する可能性を示唆した（図１４）。

筋芽細胞及び線維芽細胞の構成比率、及び細胞の播種濃度を最適化することにより、細胞シート積層体内外のサイトカイン産生能が高まるだけでなく、血管内皮細胞ネットワーク構築が高度化されることが明らかとなった。細胞シート内に血管内皮細胞ネットワークが構築された細胞シートを移植した場合、移植部周辺の血管網と速やかに繋がり、治療効果が高いことが知られている。また、現在行われている心疾患患者への筋芽細胞シートによる治療は、細胞シートから分泌されるサイトカイン等によるパラクライン効果によるものと考えられている。このことから、本発明により作製されるサイトカイン産生量が高く、血管内皮細胞ネットワークが高度に構築された細胞シートは、より良い治療効果が得られるものと思われる。

本発明に示される製造方法であれば、血管新生を促進するサイトカインを分泌し、かつ／または血管内皮細胞ネットワークが構築された細胞シート積層体を得ることができる。これは、治療効果が高い移植片の提供にもつながるばかりでなく、さらに厚みをもった細胞シート積層体を作製することにもつながるばかり、さまざまな組織の再生医療に有用なものである。

R_G ：1枚の画像スライスに占める緑色のvoxelの割合（R_G; Ratio of green vexel）
d ：撮影した細胞シート積層体の厚さ
R_M :前細胞数における筋芽細胞の含まれる割合
z ：シート厚さ [μm]
L ：1画像に占める血管ネットワーク長さの合計 [mm/mm²]
N_T ：血管ネットワーク1 mm²あたりの端点数の数 [tip/mm²]
L/N_T ：LをN_Tにより除した値。[mm/tip]

Claims (11)

1. 骨格筋筋芽細胞と線維芽細胞の相互作用により、肝細胞増殖因子（HGF）及び血管内皮
   細胞増殖因子（VEGF）の総産生量を高めるための細胞シートの製造方法であって、
   該細胞シートを構成する細胞として骨格筋筋芽細胞を７５％〜４０％の割合で含み、か
   つ少なくとも線維芽細胞を２５％〜６０％の割合で含む、細胞の混合物を得る；
   ０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上
   で、ポリマーの上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度域で当該細胞シ
   ートを構成する細胞を培養する；
   その後、培養液をポリマーの上限臨界溶解温度以上または下限溶解臨界温度以下の温度
   に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離させる；
   ことを特徴とする、前記細胞シートの製造方法。
2. 細胞の混合物を得る工程が、細胞シートを構成する細胞として骨格筋筋芽細胞を６０％
   〜４０％の割合で含み、かつ少なくとも線維芽細胞を４０％〜６０％の割合で含む、細胞
   の混合物を得ることを特徴とする、請求項１記載の細胞シートの製造方法。
3. 剥離した細胞シートをさらに別のシート状培養細胞に積層化し、或いはその操作を繰り
   返すことで細胞シートを積層化することを特徴とする、請求項１または２記載の細胞シー
   トの製造方法。
4. 播種した血管内皮細胞上に請求項１もしくは２記載の細胞シートまたは請求項３記載の
   細胞シートの積層体を重ねることで、血管内皮細胞ネットワークを構築させた細胞シート
   の製造方法。
5. 当該細胞シートを構成する細胞が生体組織から採取されたものである、請求項１〜４の
   いずれか１項記載の細胞シートの製造方法。
6. 細胞シート１層につき、播種する細胞が１．０×１０^５〜７．０×１０^５個／ｃｍ^２で
   ある、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞シートの製造方法。
7. 剥離方法が蛋白質分解酵素による処理を施されることなく細胞培養支持体から剥離され
   たものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞シートの製造方法。
8. 剥離方法が培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、キャリアと共に剥離する方
   法である、請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞シートの製造方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞シートの製造方法により作製されたことを特徴
   とする、血管新生促進用細胞シート。
10. 細胞シートを、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡
    張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１種の心臓の
    疾患または障害の治療、もしくは心筋壁再建の移植用として使用する、請求項９記載の血
    管新生促進用細胞シート。
11. 請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞シートの製造方法により作製された細胞シート
    を、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心
    筋症及び拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１種の心臓の疾患または障害
    の治療、もしくは心筋壁再建の移植用として使用する、移植用心筋治療薬。