CN108525008A - 具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成，脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成，血管移植物为脱细胞血管材料；其制备方法包括如下步骤：a、制取脱细胞血管材料备用；b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；c、将制得的脂肪细胞片覆盖在脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上。本发明制得的血管移植组织移植后在体内的有效时间长，有利于推迟二次手术时间，减缓患者痛苦与经济负担。

Description

具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药生物材料领域，具体涉及一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法。
背景技术
近年来，尽管血管腔内治疗得到迅速发展，但传统的血管移植手术仍是处理心血管疾病的重要手段，尤其对于治疗大部分复杂先天性心脏病和部分周围血管疾病目前还处于不可替代的地位；血管移植术就是将人工血管移植在机体病变的血管部位，替换异常血管，重新建立血流通路。
血管移植后两周是机体免疫炎症发生的高峰，移植用的血管移植物内渗入机体的促炎症细胞越多，预示血管的生物相容性越差及更高的远期的钙化水平。
因此，为了避免血管移植物在体内出现上述问题，需要研制出一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，使得血管移植物在患者体内有效时期延长，推迟二次手术的时间，减少患者医疗经济负担，延长患者寿命。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，将动物自体脂肪干细胞分化并制作为具有分泌功能的脂肪细胞片，然后应用于血管移植物上，从而建立新型的抗钙化的组织工程血管材料。
本发明提供的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成；
进一步，所述脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成；
进一步，所述血管移植物为脱细胞血管材料。
本发明还公开了一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，包括如下步骤：
a、制取脱细胞血管材料备用；
b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；
c、将步骤b中的脂肪细胞片覆盖在步骤a中的脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上，即可制成具有优异抗钙化性能的血管移植组织；
进一步，所述步骤b中，诱导动物自体脂肪干细胞分化用的成脂分化培养液由基础细胞培养液混合地塞米松、吲哚美辛、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)制成；
进一步，所述基础细胞培养液为含有10％牛血清、1.0％抗生素的DMEM细胞培养液；
所述成脂分化培养液地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)的浓度分别为1μmol/L、200μmol/L、0.5μg/mL、0.5mmol/L；
进一步，所述抗生素为青霉素或链霉素。
本发明的有益效果：
本发明将动物自体脂肪干细胞分化而来的脂肪细胞做成脂肪细胞片，应用在脱细胞血管材料表面，利用了脂肪细胞分泌炎症因子的功能，减轻了血管移植物的发生炎症反应的程度，延迟了血管移植物在动物体内的钙化进程，从而使得血管移植物体内有效时限得以延长，有利于推迟二次手术时间，减缓患者痛苦与经济负担，延长患者寿命。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
图1为脱细胞血管材料HE染色处理后图；
图2为脱细胞血管材料与新鲜血管材料中DNA含量对比图；
图3为检测SVF(脂肪间充质干细胞)细胞表面抗原CD34结果；
图4为检测SVF细胞表面抗原CD166结果；
图5为检测SVF细胞表面抗原ABCG2结果；
图6为检测SVF细胞表面抗原CD29结果；
图7为油红“O”脂肪染色法鉴定脂肪细胞结果图；
图8为HE染色鉴定脂肪细胞片覆盖在脱细胞血管材料表面结果图；
图9为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的HGF的表达水平图；
图10为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的VEGF的表达水平图；
图11为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的APN的表达水平图；
图12为实验组的血管移植组织植入体内四周后取出进行APN抗体免疫荧光染色测试结果图；
图13为对照组的脱细胞血管材料植入体内四周后取出进行APN抗体免疫荧光染色测试结果图；
图14为取第8周时血管移植物经HE染色的结果图，其中，Decellularized group为对照组，iACS treated group为实验组；
图15为取四个时间点的血管移植物经HE染色的结果图，其中，Decellularizedgroup为对照组，iACS treated group为实验组；
图16为取四个时间点的对照组中M1型巨噬细胞及M2型单核巨噬细胞的渗入量柱状图；
图17为取四个时间点的实验组中M1型巨噬细胞及M2型单核巨噬细胞的渗入量柱状图；
图18为对照组与实验组中M1：M2结果的对比图；
图19为采用Von Kossa硝酸银染色评价实验组和对照组的血管钙化情况结果图；
图20为对实验组和对照组进行原子火焰法检测钙化程度的结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例一
一、血管移植组织的制备
1、脱细胞血管材料制备
采用动物颈动脉脱细胞处理制成脱细胞血管材料，具体包括如下步骤：
(1)首先将生理盐水清洗后的动物颈动脉置于低渗离子水中，并在4℃温度下，持续振荡漂洗12h；
(2)然后对漂洗后的主动脉进行浸泡洗涤，洗涤过程为：依次采用1％TritonX-100、去离子水、1％SDS(十二烷基硫酸钠)进行洗涤，每种试剂洗涤3h，且更换洗涤试剂之前均需采用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗三次，每次5分钟，重复该洗涤过程至少5遍。上述洗涤步骤中均需按浓度为5μmol/L、1g/L、100mg/L分别加入苯甲基磺酸氟(蛋白酶抑制剂)、抗生素头孢咗啉钠、链霉素，且每一步洗涤均在4℃振荡器中持续振荡；
(3)再将洗涤后的颈动脉浸泡于胰酶和乙二胺四乙酸的混合溶液中，在37℃条件下震荡1h；其中，混合溶液中，胰酶的质量浓度为0.05％，乙二胺四乙酸的质量浓度为0.02％，溶剂为去离子水；
(4)将步骤(3)所得的颈动脉在PBS中浸泡洗涤12h，在4℃振荡器中持续振荡进行洗涤，PBS每3h需更换一次，然后用0.1％过氧乙酸消毒30min；
(5)对步骤(4)制得的脱细胞血管材料效果进行鉴定后，将脱细胞血管材料应用常规程序冻干处理后密封保存。
2、动物自体脂肪干细胞的提取
1)分离大鼠腹股沟皮下脂肪组织，置于含有抗生素(青霉素或链霉素)的D-Hank，s溶液中涮洗，去除脂肪筋膜组织，之后用手术剪将脂肪组织剪碎成1mm左右的小颗粒,加入适量0.2％Ⅱ型胶原酶的PBS溶液，在37℃条件下消化90min；
2)向步骤(1)中加入等体积的含10％胎牛血清的DMEM-LG培养基终止消化，并用200目筛网过滤，去除未消化的组织,留取滤液；
3)将步骤(2)中所得滤液在1000×g离心10min(离心半径为15cm),丢弃脂肪细胞层和上层液体，收集细胞沉淀；
4)将细胞沉淀用DMEM-LG培养基(含15％胎牛血清)重悬，接种于带透气孔的T25细胞培养瓶中,在5％CO2、37℃标准环境下进行SVF原代培养，当细胞团贴壁时，更换培养基，并除去未贴壁细胞，之后每2-3天更换一次培养基,待细胞长到70-80％融合时，即可进行消化传代培养；
5)消化传代培养：弃去上层培养基，采用预热(37℃)的PBS溶液冲洗细胞2次，然后加入预热(37℃)的0.25％胰蛋白酶(含EDTA)，待细胞回缩成球状，脱离培养皿时，立即加入含10％胎牛血清的培养基终止消化，然后回收悬液，并将悬液在1000rpm离心5min，弃去上清液；
6)按1:2传代：加入8ml培养液，分别装于两个T25细胞培养瓶中，到达第三代SVF时用于表型鉴定后，即可开始成脂分化诱导。
3、脂肪干细胞诱导分化为脂肪细胞
(1)取出第三代SVF细胞复苏，待细胞融合至80％左右，按20000个/孔的密度接种到温度反应性培养皿中，加入含有10％牛血清和1％双抗的DMEM-G培养基进行细胞培养。接种后24h首次换培养基，之后每48h换一次培养基，待细胞长到80％融合度的时候，即可进行成脂分化诱导；
(2)弃去步骤(1)中的DMEM-G培养基，并用PBS冲洗后，向细胞中加入成脂分化培养液，每2-3天换液一次，带细胞成脂分化达到50％以上即可；成脂分化培养液由基础细胞培养液混合地塞米松、吲哚美辛、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)制成；其中，基础细胞培养液为含有10％牛血清、1.0％抗生素(青霉素或链霉素)的DMEM细胞培养液，按成脂分化培养液中浓度分别为1μmol/L、200μmol/L、0.5μg/mL、0.5mmol/L加入地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)。
4、脂肪细胞片覆盖于脱细胞血管材料
1)将转移膜置于诱导产生的脂肪细胞层上(放置时应避免转移膜与细胞层间形成气泡)，然后将培养皿置于20-25℃条件下，放置5-6min，使脂肪细胞与转移膜紧紧贴合，制成细胞片；
2)将制得的细胞片覆盖到脱细胞血管材料外膜上，之后放入37℃环境，孵育30-60min，使脂肪细胞从脂肪细胞片上脱落，脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上，再去除转移膜，即制得具有优异抗钙化性能的血管移植组织。
二、血管材料性能检测
1、血管脱细胞处理效果检测
将脱细胞血管材料经过HE染色，可以观察到没有细胞残留(见图1)；
对脱细胞血管材料进行DNA提取分析，检测到血管脱细胞处理后DNA残留相对于新鲜血管材料DNA含量低于2％(见图2)。
结论：脱细胞血管材料已经有效地去除了细胞组织。
2、脂肪细胞片性能检测
2.1脂肪干细胞的鉴定
检测方法：通过流式细胞技术检测SVF细胞表面抗原：CD34、ABCG2、CD29和CD166。
结果显示:少于3.6％的细胞表达造血干细胞表面因子CD34；CD29、CD166间质细胞表面标志，均有60％以上的表达；ABCG2表达约为42％(见图3、4、5、6)。
结论：提取的细胞为脂肪间充质干细胞。
2.2脂肪细胞的鉴定
检测方法：油红“O”脂肪染色法。
实验结果：经过7天成脂肪诱导分化，可以在显微镜下观察到细胞内出现大量脂滴(见图7)。
2.3脂肪细胞片覆盖在脱细胞血管材料表面的鉴定
检测方法：HE染色法。
实验结果：镜下可见25μm厚的脂肪细胞片分泌APN(脂联素)(见图8)。
2.4脂肪细胞分泌功能的鉴定
测定方法：酶联免疫吸附测定(ELISA)，分别测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的HGF(肝细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)和APN(脂联素)的表达水平。
结果显示:分化来的脂肪细胞分泌VEGF和APN含量大大高于直接提取的SVF细胞即动物自体脂肪干细胞(见图9、10)，而HGF的分泌量在SVF细胞中较多(见图11)。
三、血管移植组织的动物体内应用及性能检测
1、动物皮下模型的建造
以12只六周龄的SD大鼠为试验对象,将大鼠采用3％戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉后，对其背部剃毛处理,并采用碘伏消毒背部皮肤。然后将大鼠均分为两组，实验组植入本实施例采用大鼠提取的脂肪细胞片覆盖的猪颈动脉脱细胞血管材料制成的血管移植组织，对照组植入不含有脂肪细胞的猪颈动脉脱细胞血管材料；
植入方法为：在每只大鼠背部的左右上下各取一个植入位点(取四个植入点就可以)，将血管移植物以1*1cm的大小植入皮下，缝合切口，无菌敷料包扎。术后大鼠常规饲养，分别于术后1、2、4、8周时取出血管移植物，做相应检测。
2、组织学检测
材料的一般处理：将实验组和对照组中取出的血管移植物用10％的福尔马林室温固定24h，经过标本自动脱水机(LEICA ASP 300S)脱水后，进行蜡封、切片，待分析。
2.1脂肪细胞片在体内存活情况的免疫荧光检测
检测方法：APN免疫荧光染色(具体见：2.2)。
检测结果：在第四周时，对两组血管材料移植物取出进行APN抗体免疫荧光染色。可以观察到实验组将血管移植组织移植一月后仍能观察到细胞片厚度为25μm左右，紧贴脱细胞血管材料表面，并且表明仍具有分泌APN的能力(见图12)，而未覆盖脂肪细胞片的脱细胞血管材料检测不到APN的分泌(见图13)。
2.2取切片进行免疫荧光染色以检测巨噬细胞的分布。
检测方法：取切片在柠檬酸盐溶液中煮沸2分钟来暴露抗原，之后在5％的山羊血清中进行30分钟的室温孵育；一抗封闭液4℃过夜，第二天37℃复温45min。(APN的一抗为小鼠抗大鼠APN抗体1:300稀释浓度；小鼠抗大鼠CD68 1：150稀释于PBS缓冲液；兔抗大鼠CD163 1:100稀释于PBS缓冲液；兔抗大鼠CCR7 1:150稀释于PBS缓冲液)CCR7为M1型巨噬细胞的表面标志，CD163为M2型巨噬细胞表面标志。PBS冲洗3次，每次各5min。滴加荧光标记二抗，室温闭光孵育1h(山羊抗小鼠IgG，Alexia Fluor594，1:200；山羊抗兔IgGfluorescein-conjugated,1:200)，37℃孵育60min。用含DAPI的封片剂Mounting Medium封片，拍照。
检测结果：大鼠皮下移植物在不同的时间点取出，可以看到血管片外观没有明显变化，表面包裹一层纤维化组织；
取四个时间点的血管移植物经HE染色表明所有浸润实验组和对照组血管移植物的细胞都包含CD68阳性细胞；
对照组包含大量的CCR7阳性细胞，它代表M1型单核巨噬细胞，而8周的时候则出现了大量多核巨噬细胞(P＜0.001)(见图14)；
实验组在四个时间点，都以CD163阳性为主的细胞占据，它是M2型单核巨噬细胞的表面标记物(P＜0.001)；
血管移植后两周是机体免疫炎症发生的高峰，这时候的取材可见对照组的M1型巨噬细胞的渗入量明显高于实验组，这往往预示着更大强度的炎症反应，以及远期的钙化水平(见图15)。
将各个时期的细胞类型及数量用柱状图表示，结果表明：对照组中M1：M2比例明显高于实验组，表示其促炎细胞比例更高(见图16、17、18)。
2.3Von Kossa硝酸银染色评价血管钙化情况
分析方法：Von Kossa硝酸银染色常规实验流程。
染色结果：在2、4和8周的取材进行钙化检验，对照组相较与实验组钙化程度明显升高(见图19)。图19钙化染色结果图，图中：上方箭头表示血管外膜，下方箭头指向血管内膜，黑色为钙化位点，颜色越深，钙化程度越重。可见脱细胞血管材料外膜部位钙化明显重于内膜部。
结论：采用不含有脂肪细胞的脱细胞血管材料作为血管移植物的发生炎症反应的程度远远大于采用本例实施制得的含有脂肪细胞的血管移植组织作为血管移植物。
3、原子火焰法进行钙化程度检测
分析方法：原子火焰法检测钙化常规实验流程。
结果：实验组的钙化程度在2周(0.90±0.22μg calcium/mg干燥样本)，4周(1.43±0.13μg calcium/mg干燥样本),8周(10.61±1.10μg calcium/mg干燥样本)。然而对照组的钙化程度则明显升高：2周(1.13±0.18μg calcium/mg干燥样本),4周(2.98±0.23μgcalcium/mg干燥样本),8周(27.91±1.75μg calcium/mg干燥样本)。两组在每个时间点的比较均有统计学差异性(P<0.05)。
结论：实验组的血管移植物的钙化程度轻于对照组(见图20)。
通过上述分析可知：将动物自体脂肪干细胞分化而来的脂肪细胞做成脂肪细胞片，应用在脱细胞血管材料表面，利用了脂肪细胞分泌抗炎症、抗钙化因子的功能，减轻了血管移植物的发生炎症反应的程度，延迟了血管移植物在动物体内的钙化进程，从而使得血管移植物体内有效时限得以延长，有利于推迟二次手术时间，减缓患者痛苦与经济负担，延长患者寿命。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成。
2.根据权利要求1所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：所述脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成。
3.根据权利要求1所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：所述血管移植物为脱细胞血管材料。
4.一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、制取脱细胞血管材料备用；
b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；
c、将步骤b中的脂肪细胞片覆盖在步骤a中的脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上，即可制成具有优异抗钙化性能的血管移植组织。
5.根据权利要求4所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，其特征在于：
所述步骤b中，诱导动物自体脂肪干细胞分化用的成脂分化培养液由基础细胞培养液混合地塞米松、吲哚美辛、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)制成。
6.根据权利要求5所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，其特征在于：
所述基础细胞培养液为含有10％牛血清、1.0％抗生素的DMEM细胞培养液；
所述成脂分化培养液中地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)的浓度分别为1μmol/L、200μmol/L、0.5μg/mL、0.5mmol/L。
7.根据权利要求6所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，其特征在于：所述抗生素为青霉素或链霉素。
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