CN116396936A - 用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，涉及生物医药技术领域，该种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法包括S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs使用神经干细胞NSC培养基1制备神经球；S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：其通过采用本申请提供的一种治疗缺血性脑卒中的神经干细胞制备方法，通过对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，进一步使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域技术，尤其是指一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
从上世纪90年代开始，脑血管病已连续32年位居国民死亡原因之首，其中脑卒中是单病种中发病率、致残率、复发率、致死率最高的疾病。近年来，脑卒中在我国40周岁以上成年人发病率一直保持在2.0％以上，且仍在继续上升，其中缺血性脑卒中占全体病患80％以上。脑卒中患者即便得到了有效治疗，预后1年内复发率仍高达17.7％。缺血性脑卒中发生后，患者脑部因应激发生缺血性神经兴奋及过度氧化应激，大量神经细胞发生凋亡，加剧脑部炎症反应，随后破坏血脑屏障，进而引发外周淋巴细胞参与，进一步加重脑部炎症，破环神经细胞生存环境，导致脑部出现不可逆损伤。这也是导致大量患者康复后，脑部功能受损，生活难以自理的主要原因。
自2006年，诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSC)技术被发现以来，iPSC以可实现多种不同组织细胞分化的多能性，受到众多学者及研究者的关注，特别是在器官组织修复上被给予厚望。利用不同诱导方法，可以定向将iPSC分化为心肌细胞、胰岛细胞、神经细胞、角膜细胞等。其中，部分细胞分化类型已有多项临床研究证明其可靠性、安全性及有效性。iPSC分化的神经干细胞(iPSC-derivedneuralstemcells,iNSC)，具有与内源NSC同样的生物学功能，可以向下分化多种类型的神经细胞，是一种用于组织替代修复的好材料。通过合理及规范的操作，可以高效的将iPSC分化为iNSC，这就给予了脑卒中患者在预后康复上的一种新的可能性，以iNSC作为脑卒中细胞治疗材料也逐渐步入研究者的视野。
现有技术中临床针对脑部神经细胞损伤并无有效缓解或治疗方法，仅能通过康复治疗刺激患者自我恢复。因此，迫切需要开发一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，以满足实际应用的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，其通过采用本申请提供的一种治疗缺血性脑卒中的神经干细胞制备方法，通过对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，进一步使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗。
为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：
一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其包括如下步骤：
S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；该培养表面为细胞培养板、细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞工厂中的任意一种，该培养的实现方式为贴壁培养；
S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；S2中的初始细胞密度为600,000个细胞/毫升；所述S2中的悬浮培养以翘板往复运动模式下悬浮培养24小时，当细胞球平均直径为100μm时进入S3进行神经球的扩增及成熟；
S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；所述S2经过48小时后进入S3，S3培养的实现方式为悬浮培养，所述S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5°，到达两端最低点时悬停3秒；
该NPC培养基、NSC培养基1、NSC培养基2中均包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基，所述DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基的质量比例为1：1：1.5；所述添加剂包括wnt/β-catenin激动剂、GSK-3抑制剂、ALK抑制剂、Caspase抑制剂、PERK抑制剂、ROCK2制剂、PI3K激活剂。
作为一种优选方案：所述添加剂具体包括SB431542、A83-01、CHIR99021、CHIR98014、CHIR98024、740Y-P、Chroman1、Emricasan、Polyamine、Trans-ISRIB、EGF、FGF-2、N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、非必须氨基酸添加剂(NEAA)、β巯基乙醇中的至少一种。
作为一种优选方案：所述NPC培养基中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021。
作为一种优选方案：所述NSC培养基1中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
作为一种优选方案：所述NSC培养基2中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
作为一种优选方案：所述S1、S2和S3中均添加有用于提高细胞存活增殖能力的CEPT添加剂,该CEPT添加剂包括Chroman1、Emricasan、Polyamine和Trans-ISRIB；所述S1和S2中须在培养的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
作为一种优选方案：所述S1中添加有用于作为培养表面包被的添加剂以便于RONAs的形成，该作为培养表面包被的添加剂为重组人层黏连蛋白(laminin)、重组人纤连蛋白(fibronectin)或重组人玻连蛋白(Vitronectin)中的一种。
作为一种优选方案：所述S3每2天全换液一次；当神经球直径超过350μm时执行传代程序，所述执行传代程序包括：使用消化液进行消化，并按1000,000个细胞/毫升转移至新的培养容器中。
作为一种优选方案：所述S3中的传代程序最多执行2次，每次传代后的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
作为一种优选方案：所述iPSC来源于成体皮肤成纤维细胞、成体外周血单个核细胞或成体尿液内上皮细胞。
所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的应用，用于制备治疗缺血性脑卒中的制剂。
作为一种优选方案：所述NSC制剂的神经干细胞用于在MCAO上定殖并产生分化，具体表现为细胞出现NeuN、β-tubulin成熟神经元标志物；该NSC制剂的神经干细胞用于降低MCAO引起的动物体重下降趋势；该NSC制剂的神经干细胞用于减少MCAO引起的脑部梗死面积。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，通过采用本申请提供的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗；通过使用特定的培养方法搭配特定培养基的方案，可以有效将最终获得的神经干细胞阳性标志物比例维持在80％以上，同时具有良好的增殖分化活性；通过本方法制备的神经干细胞可以有效的缓解因缺血导致的脑部损伤，同时加快机体恢复，并且能够在脑组织内产生一定的定殖和分化以辅助疾病动物健康的进一步恢复。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
附图说明
图1为本发明之神经干细胞制备流程简图；
图2为本发明之RONAs第6天及神经球第12天光学显微镜下图像；
图3为本发明之NSCs免疫荧光染色结果示意图；
图4为本发明之NSCs流式细胞术检测结果示意图；
图5为本发明之NSCs分化后的神经元免疫荧光染色结果示意图；
图6为本发明之MCAO动物模型经细胞治疗前后的体重变化示意图；
图7为本发明之MCAO动物模型经细胞治疗后脑组织TTC染色结果；
图8为本发明之MCAO动物模型经细胞治疗后脑部病理组织免疫荧光染色结果示意图。
具体实施方式
一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其包括如下步骤：
S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；该培养表面为细胞培养板、细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞工厂中的任意一种，该培养的实现方式为贴壁培养；
S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；S2中的初始细胞密度为600,000个细胞/毫升；该S2中的悬浮培养以翘板往复运动模式下悬浮培养24小时，当细胞球平均直径为100μm时进入S3进行神经球的扩增及成熟；
S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；该S2经过48小时后进入S3，S3培养的实现方式为悬浮培养，该S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5°，到达两端最低点时悬停3秒；
该NPC培养基、NSC培养基1、NSC培养基2中均包括基础培养基和添加剂；该基础培养基包括DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基，该DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基的质量比例为1：1：1.5；该添加剂包括wnt/β-catenin激动剂、GSK-3抑制剂、ALK抑制剂、Caspase抑制剂、PERK抑制剂、ROCK2制剂、PI3K激活剂。
该添加剂具体包括SB431542、A83-01、CHIR99021、CHIR98014、CHIR98024、740Y-P、Chroman1、Emricasan、Polyamine、Trans-ISRIB、EGF、FGF-2、N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、非必须氨基酸添加剂(NEAA)、β巯基乙醇中的至少一种。
该NPC培养基中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021。
该NSC培养基1中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
该NSC培养基2中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
该S1、S2和S3中均添加有用于提高细胞存活增殖能力的CEPT添加剂,该CEPT添加剂包括Chroman1、Emricasan、Polyamine和Trans-ISRIB；该S1和S2中须在培养的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
该S1中添加有用于作为培养表面包被的添加剂以便于RONAs的形成，该作为培养表面包被的添加剂为重组人层黏连蛋白(laminin)、重组人纤连蛋白(fibronectin)或重组人玻连蛋白(Vitronectin)中的一种。
该S3每2天全换液一次；当神经球直径超过350μm时执行传代程序，该执行传代程序包括：使用消化液进行消化，并按1000,000个细胞/毫升转移至新的培养容器中。
该S3中的传代程序最多执行2次，每次传代后的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
该iPSC来源于成体皮肤成纤维细胞、成体外周血单个核细胞或成体尿液内上皮细胞。
该用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的应用，用于制备治疗缺血性脑卒中的制剂。
该NSC制剂的神经干细胞用于在MCAO上定殖并产生分化，具体表现为细胞出现NeuN、β-tubulin成熟神经元标志物；该NSC制剂的神经干细胞用于降低MCAO引起的动物体重下降趋势；该NSC制剂的神经干细胞用于减少MCAO引起的脑部梗死面积。
实施例1
本发明如图1至图8所示，一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其包括如下步骤：
S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC(诱导多能干细胞)分化以形成神经聚集体RONAs；具体如下：
培养表面的包被
使用不含Ca2+、Mg2+离子的PBS溶液对T75培养瓶进行润洗，弃去润洗液后，按5μg/cm2加入fibronectin，然后放于含5％CO2的37℃培养箱中包被至少1小时以上备用，使用前吸去培养瓶中溶液即可。
iPSC的复苏
将iPSC从深低温环境中取出，置于37℃水浴锅中快速复温解冻，使用D-PBS于200g离心持续3分钟，洗涤一次，并以E8完全培养基适量重悬，取样计数，按1.5-2E4个细胞/cm2的密度进行细胞的接种，之后加入CEPT处理24小时。之后每天按需换液，至细胞密度达到80％以上时，即可准备进行RONAs的诱导制备流程。
RONAs的诱导
当iPSC融合度达到80％以上，即可进入RONAs的制备流程，使用消化液消化iPSC，并使之完全分散为单个细胞，200g离心3分钟，收集细胞，以适量NSC培养基1重悬，取样计数，按2-2.5E4个细胞/cm2的密度进行细胞接种，之后加入CEPT处理24小时，24小时全换液，之后按每天2天全换液一次，于诱导第6天观察细胞密度达到100％时即可进入下一阶段处理。
S2、将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；具体如下：
RONAs的消化
于第6天，对已经达到100％细胞密度的RONAs，使用消化液进行消化，使之完全分散为单个细胞，并使用70μm细胞滤网进行过滤，于200g离心力下离心4分钟后，收集细胞沉淀，以NSC培养基2重选，取样计数，调整细胞浓度为6E5个细胞/ml并加入CEPT添加剂促进细胞增殖及抗凋亡活性，使用10cm细胞培养皿进行培养，每个皿中加入10ml细胞悬液，并置于翘板摇床上，以10rpm的速度左右往复运动的模式下培养细胞，经24小时后，使之形成平均直径为100μm的神经球，即可进入扩增及成熟培养阶段。
S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；该S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5°，到达两端最低点时悬停3秒：具体如下：
神经球的扩增及成熟
于第7天，当神经球平均直径达到100μm后，进入对神经球的扩增及成熟阶段，将培养皿以倾角为10°静置3分钟，弃去9ml培养上清后，加入新鲜的NSC培养基2，并将培养皿平放摇匀，调整摇床模式，更改静置悬浮培养2小时，翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5°，到达两端最低点时悬停3秒。
此后每2天扩大培养体系一次，即从10ml变为20ml，其他体积以此类推。并于第12天时，以流式细胞术检测神经球细胞中nestin、PAX6等表达情况，达到80％以上时，即可收集神经球进行NSC制剂的制备；若未达到则继续进行扩增培养，至神经球细胞的nestin、PAX6达到80％以上为止。
制备NSC制剂
神进球细胞的nestin、PAX6表达情况达到80％以上时，将培养皿以倾角为10°静置3分钟，尽量吸取全部培养上清，使用5mlD-PBS清洗神经球，再次吸取全部洗涤上清后，加入2.5ml消化液消化神经球6分钟，并使用5ml新的D-PBS终止消化，并吹散神经球，收集全部细胞悬液，以200g离心力离心4分钟，收集细胞沉淀，并计数，按动物实验需求或临床实验需要，加入对应溶剂调整细胞浓度，即得具有神经干细胞的NSC制剂。
效果实施例1
NSCs的相关细胞表征鉴定
免疫荧光染色
对按实施例1方法制备的细胞进行免疫荧光染色以验证细胞分化情况。细胞爬片在4％多聚甲醛溶液中室温固定1小时；PBS溶液润洗5分钟共3次。使用含有0.3％TritonX-100的PBS溶液对细胞爬片室温透化1小时；PBS溶液润洗5分钟共3次；使用含有10％驴血清和0.3％TritonX-100的PBS溶液对细胞爬片室温封闭1小时；使用添加一抗的抗体稀释液对细胞爬片4℃孵育过夜；PBS溶液润洗5分钟共3次。使用添加对应二抗的抗体稀释液对细胞爬片室温避光孵育3小时；PBS溶液润洗5分钟共3次；使用含有5ng/mL Hoechst33342的PBS溶液对细胞爬片室温避光染色15分钟；PBS溶液润洗5分钟共3次。将染色完成的细胞爬片封片，在倒置荧光显微镜下观察。
抗体稀释液为含有0.3％TritonX-100和3％驴血清的PBS溶液。一抗使用情况为Nestin(MilliporeMAB5326、1:800)、SOX1(R&DAF3369、1:500)、PAX6(Abcamab195045、1:500)、SOX2(R&DAF2018、1:800)。二抗使用情况为驴抗鼠AlexaFluor488(InvitrogenA-21202、1：1000)、驴抗兔AlexaFluor568(InvitrogenA10042、1：1000)、驴抗山羊AlexaFluor647(InvitrogenA-21447、1：1000)；如图3所示，可见细胞表达SOX1、SOX2、Nestin和PAX6，说明按实施例1方案分化所得的细胞表达有NSCs的标志物。
流式细胞术
对按实施例1描述所得的细胞进行流式细胞检测，基于SOX1、Nestin、PAX6、Tra1-60的表达与否鉴定NSCs。用4％多聚甲醛溶液室温固定细胞15分钟，PBS溶液润洗，BDPermⅢ破膜剂冰上破膜30分钟，PBS溶液润洗，流式抗体室温孵育20分钟，PBS溶液润洗，上机检测。抗体使用情况为SOX1(BD561592)、Nestin(BD560393)、PAX6(BD562388)、Tra1-60(BD560193)；根据流式细胞术的结果图4，SOX1+细胞比例高达98.8％，Nestin+细胞比例高达99.7％，PAX6+细胞比例高达94.9％，说明所得细胞为NSCs。
NSCs分化为神经元细胞
对按实施例1步骤所得的细胞进行体外分化能力检测。消化实施例1中所得的NSCs，按每平方厘米3×104个活细胞接种至0.1mg/mLPoly-D-Lysine溶液包被的24孔培养板上，每孔加入0.5mL神经元诱导培养基。之后每3天换液直至14天后收获。神经元诱导培养基为含有1％N2添加物、2％B27添加物、1mMGlutaMAX、0.1mM2-mercaptoethanol、0.5mMdbcAMP、200μMascorbic acid、10ng/mLβNGF、10ng/mLBDNF、10ng/mLGDNF、10ng/mLNT3的DMEM/F12和NeuralBasal的1:1混合培养基。对进行体外分化的细胞进行免疫荧光染色，细胞爬片在4％多聚甲醛溶液中室温固定1小时，PBS溶液润洗5分钟共3次；使用含有0.3％TritonX-100的PBS溶液对细胞爬片室温透化1小时，PBS溶液润洗5分钟共3次；使用含有10％驴血清和0.3％TritonX-100的PBS溶液对细胞爬片室温封闭1小时。使用添加一抗的抗体稀释液对细胞爬片4℃孵育过夜。PBS溶液润洗5分钟共3次。使用添加对应二抗的抗体稀释液对细胞爬片室温避光孵育3小时。PBS溶液润洗5分钟共3次。使用含有5ng/mLHoechst33342的PBS溶液对细胞爬片室温避光染色15分钟。PBS溶液润洗5分钟共3次。将染色完成的细胞爬片封片，在倒置荧光显微镜下观察。抗体稀释液为含有0.3％TritonX-100和3％驴血清的PBS溶液。一抗使用情况为β3-Tubulin(R&DAB5804、1:500)、NeuN(Abcamab177487、1:500)。二抗使用情况为驴抗鼠AlexaFluor488(InvitrogenA-21202、1：1000)、驴抗兔AlexaFluor568(InvitrogenA10042、1：1000)。如图5所示，分化后细胞表达神经元细胞微管标记物β3-Tubulin和神经元细胞核标记物NeuN，说明NSCs具有体外分化为神经元的潜能。
效果实施例2
NSC治疗MCAO动物模型
大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO动物模型)
通过动物大脑中动脉栓塞模型验证按实施例1中方案制备的NSCs的体内功能性。手术造模并设置注射NSCs的实验组和注射PBS的对照组。手术建模后第三天，用PBS溶液将NSCs制备为细胞悬液。通过脑立体定位注射在病灶同侧纹状体处注射2.5E5个NSCs或等体积PBS。从注射当天起每3天按10mg/Kg皮下注射免疫抑制剂环孢素A直至样品收获。手术后28天处死实验大鼠，收集大脑组织，检测缺血损伤面积和NSCs定植情况。
体重变化监测
从大鼠造模当天起每3天称量每只大鼠体重，根据每组大鼠的平均体重变化绘制体重随时间变化的图表。细胞治疗组术后1周内体重有所下降、第2周起体重逐步恢复；但PBS对照组术后2周体重都未见恢复；细胞治疗组大鼠体重自第12天起与PBS对照组有显著性差别直至收获。如图6所示，经造模后的动物在前3天会出现明显的提体重下降，细胞注射治疗后，可以于第3天抑制动物体重下降趋势，并且在随后的跟踪时间内，逐步加快模型动物的体重恢复，说明按实施例1方法制备的NSCs对大脑中动脉栓塞模型的大鼠恢复具有保护作用。
脑组织梗死萎缩面积检测(TTC染色)
取出大鼠大脑，放置在-20℃冰箱内冷冻20分钟，用大鼠脑槽将脑组织切成2毫米厚的4-5片连续冠状切片，将脑组织切片放入已37℃预热的2％TTC染液中，37℃避光孵育30分钟。使用数码相机拍照后用图片处理系统计算每片脑组织切片的缺血面积。根据图7计算得NSCs组大鼠脑组织梗死萎缩比例为5.86％，低于PBS组的10.22％，说明按实施例1中方案制备的NSCs对大脑中动脉栓塞模型的大鼠大脑具有保护功能。
病理组织免疫荧光染色
将大鼠灌流后取出大脑，在4％多聚甲醛溶液中4℃固定过夜，在含有30％蔗糖的PBS溶液中4℃脱水2天，直至脑组织沉底。用冰冻切片机包埋剂OCT将已固定脱水的脑组织按冠状方向固定在样品台上。用冰冻切片机对脑组织进行25μm冠状连续切片。脑组织切片在PBS溶液中润洗5分钟共3次。使用含有1％TritonX-100的PBS溶液对脑组织片室温透化1小时。PBS溶液润洗5分钟共3次。使用含有10％驴血清和0.3％TritonX-100的PBS溶液对脑组织室温封闭1小时。使用添加一抗的抗体稀释液对脑组织4℃孵育过夜。PBS溶液润洗5分钟共3次。使用添加对应二抗的抗体稀释液对脑组织室温避光孵育3小时。PBS溶液润洗5分钟共3次。使用含有5ng/mLHoechst33342的PBS溶液对脑组织室温避光染色15分钟。PBS溶液润洗5分钟共3次。将染色完成的脑组织切片贴在载玻片上，用封片剂封片，在倒置荧光显微镜下观察。抗体稀释液为含有0.3％TritonX-100和3％驴血清的PBS溶液。一抗使用情况为Nestin(MilliporeMAB5326、1:800)、PAX6(Abcamab195045、1:500)、NeuN(Abcamab177487、1:500)、STEM101(TaKaRaY40400、1:200)。二抗使用情况为驴抗鼠AlexaFluor488(InvitrogenA-21202、1：1000)、驴抗兔AlexaFluor568(InvitrogenA10042、1：1000)。如图8所示，免疫荧光染色通过人特异性神经干细胞标记蛋白Nestin和人核抗体STEM101定位NSCs的位置，通过Nestin与神经干细胞标志物PAX6和神经元细胞核标记物NeuN的共染说明注射的NSCs的留存和分化情况。以上结果说明脑立体定位注射的NSCs在大鼠脑内留存且向下分化为神经元细胞。
本发明的设计重点在于，通过采用本申请提供的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗；通过使用特定的培养方法搭配特定培养基的方案，可以有效将最终获得的神经干细胞阳性标志物比例维持在80％以上，同时具有良好的增殖分化活性；通过本方法制备的神经干细胞可以有效的缓解因缺血导致的脑部损伤，同时加快机体恢复，并且能够在脑组织内产生一定的定殖和分化以辅助疾病动物健康的进一步恢复。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (12)
1.一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；包括如下步骤：
S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；该培养表面为细胞培养板、细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞工厂中的任意一种，该培养的实现方式为贴壁培养；
S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；S2中的初始细胞密度为600,000个细胞/毫升；所述S2中的悬浮培养以翘板往复运动模式下悬浮培养24小时，当细胞球平均直径为100μm时进入S3进行神经球的扩增及成熟；
S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；所述S2经过48小时后进入S3，S3培养的实现方式为悬浮培养，所述S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5°，到达两端最低点时悬停3秒；
该NPC培养基、NSC培养基1、NSC培养基2中均包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基，所述DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基的质量比例为1：1：1.5；所述添加剂包括wnt/β-catenin激动剂、GSK-3抑制剂、ALK抑制剂、Caspase抑制剂、PERK抑制剂、ROCK2制剂、PI3K激活剂。
2.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述添加剂具体包括SB431542、A83-01、CHIR99021、CHIR98014、CHIR98024、740Y-P、Chroman1、Emricasan、Polyamine、Trans-ISRIB、EGF、FGF-2、N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、非必须氨基酸添加剂、β巯基乙醇中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述NPC培养基中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021。
4.根据权利要求2所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述NSC培养基1中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
5.根据权利要求2所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述NSC培养基2中的添加剂包括N-2添加剂、GlutaMaxTM-Ⅰ添加剂、B-27添加剂、β巯基乙醇、EGF、FGF-2、NEAA、β巯基乙醇。
6.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述S1、S2和S3中均添加有用于提高细胞存活增殖能力的CEPT添加剂,该CEPT添加剂包括Chroman1、Emricasan、Polyamine和Trans-ISRIB；所述S1和S2中须在培养的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
7.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述S1中添加有用于作为培养表面包被的添加剂以便于RONAs的形成，该作为培养表面包被的添加剂为重组人层黏连蛋白、重组人纤连蛋白或重组人玻连蛋白中的一种。
8.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述S3每2天全换液一次；当神经球直径超过350μm时执行传代程序，所述执行传代程序包括：使用消化液进行消化，并按1000,000个细胞/毫升转移至新的培养容器中。
9.根据权利要求8所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述S3中的传代程序最多执行2次，每次传代后的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
10.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述iPSC来源于成体皮肤成纤维细胞、成体外周血单个核细胞或成体尿液内上皮细胞。
11.一种如权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的应用，其特征在于：用于制备治疗缺血性脑卒中的制剂。
12.根据权利要求11所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的应用，其特征在于；所述NSC制剂的神经干细胞用于在MCAO上定殖并产生分化，具体表现为细胞出现NeuN、β-tubulin成熟神经元标志物；该NSC制剂的神经干细胞用于降低MCAO引起的动物体重下降趋势；该NSC制剂的神经干细胞用于减少MCAO引起的脑部梗死面积。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117448272A (zh) * | 2023-12-20 | 2024-01-26 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 规模化生产制备神经干细胞及其外泌体的方法 |
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2023
- 2023-05-26 CN CN202310607399.9A patent/CN116396936A/zh active Pending
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