WO2010101225A1 - 細胞シートを利用した細胞評価システム及びその利用方法 - Google Patents

細胞シートを利用した細胞評価システム及びその利用方法 Download PDF

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cell
cells
sheet
culture
sheet laminate
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紀ノ岡　正博
康範 武澤
田谷　正仁
充弘 齋藤
芳樹 澤
清水　達也
岡野　光夫
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学校法人 東京女子医科大学
国立大学法人大阪大学
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    • G01N33/5064—Endothelial cells
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the present invention relates to a cell evaluation system useful in the fields of drug discovery, pharmacy, medicine, biology and the like, and a method for using the cell evaluation system.
  • Non-Patent Document 1, 2 and 3 Non-Patent Document 1, 2 and 3
  • the animal cell culture technology has become indispensable for the development of regenerative medicine technology.
  • the animal cell culture technology has further advanced, and research and development for animal cells has been extended to various fields.
  • the target animal cells can be used not only to commercialize the original cells, but also to produce useful products by analyzing the cells and their surface proteins.
  • the patient's own cells are being grown in vitro, or the function of the cells is increased and returned to the living body for treatment.
  • the technique of culturing animal cells is one field that many researchers are paying attention to.
  • the technical field of evaluating pharmaceuticals and cosmetics using cultured cells has attracted attention as an alternative to conventional animal experiments in terms of uniform evaluation conditions and animal welfare.
  • Patent Document 2 and Non-Patent Document 5 show test methods for testing biological indicators of cells in the state of cells embedded in a gel.
  • This is a commonly used method for three-dimensionally culturing cells to be cultured in a tissue-like manner in vitro.
  • the state of the cells in the gel can be simplified as in a two-dimensional analyzer by the thickness of the gel.
  • an expensive and large-scale apparatus such as a confocal microscope that always analyzes in three dimensions must be used.
  • the cells in the gel are not in a high density state as in a living tissue, and are inevitably in a low density and sparse state, which is not always sufficient as an evaluation system.
  • Patent Document 3 discloses a method for evaluating the function of cells using a porous membrane.
  • a method of using a porous membrane there is usually shown a method of judging a cell to be evaluated based on the degree of passage of the porous membrane as in Patent Document 3 or seeing an influence on the cell by passing only the substance through the porous membrane. ing.
  • this method merely observes the behavior of cells with respect to an artificial object called a porous membrane, and does not necessarily reproduce the behavior of cells in a living body.
  • Non-Patent Document 4 shows an evaluation system using cells on a cell culture substrate, but the technology here uses a single layer of cells cultured on the substrate. Although it is an evaluation system that uses the above, it can only obtain information in two dimensions that is completely different from the state of the tissue in the living body, and is not necessarily sufficient as a cell evaluation system.
  • Patent Document 4 discloses that cells are placed on a cell culture support on which the surface of a substrate is coated with a polymer having an upper or lower critical solution temperature of 0 to 80 ° C. in water.
  • a novel cell culturing method is described in which culture is performed at a lysis temperature or lower or a lower critical lysis temperature or higher, and then the cultured cells are detached without an enzyme treatment by setting the temperature to the upper critical lysis temperature or higher or the lower critical lysis temperature or lower.
  • Patent Document 5 uses this temperature-responsive cell culture substrate to cultivate skin cells at an upper critical dissolution temperature or lower or a lower critical dissolution temperature or higher, and thereafter, an upper critical dissolution temperature or higher or a lower critical dissolution temperature or lower.
  • the cultured skin cells are detached with low damage.
  • various new developments have been made with respect to conventional culture techniques.
  • the cell sheet obtained here can be used for transplantation, and the cell sheet is expected to have a structure close to that of a living body.
  • the cell evaluation system is useful in fields such as drug discovery, pharmacy, medicine, and biology. You can expect it to be fully usable.
  • the present invention has been made with the intention of solving the problems associated with the cell evaluation system described above. That is, the present invention provides a novel temperature-responsive cell culture substrate based on a completely different idea from the prior art.
  • the present inventors have conducted research and development by adding studies from various angles. As a result, it was found that the cell sheet laminate obtained using the temperature-responsive culture substrate creates a special environment close to the structure in the living body. Furthermore, it has been found that by changing the types of cells constituting the cell sheet laminate, the state of the cells in the cell sheet laminate can be changed, and various pseudo tissues can be created. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention provides a cell sheet laminate, target that obtains as a three-dimensional information a biological index related to at least one selected from life, death, proliferation, migration, and differentiation of a target cell by a two-dimensional analysis technique.
  • a cell evaluation system comprising a cell and a two-dimensional analyzer is provided. Further, the present invention obtains, as a three-dimensional information, a biological index related to at least one selected from life, death, proliferation, migration and differentiation of a target cell by using a two-dimensional analysis method using such a cell evaluation system.
  • a cell evaluation method is also provided.
  • the present invention does not directly measure the three-dimensional structure of the cell sheet laminate using a large-scale apparatus, but can analyze three-dimensional information by continuously analyzing two-dimensional information that can be obtained by a simple method. I want to get it.
  • the cell evaluation system described in the present invention it is possible to obtain advanced three-dimensional information by a simple technique of two-dimensional analysis of biological indices of cultured cells. Conventionally, observing the behavior of cells in a tissue requires a large-scale analysis device. However, according to the present invention, this is not necessary, and it can be easily combined with surrounding cell culture devices to obtain advanced information. Will be able to.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of Example 1.
  • each term represents the following meaning.
  • Growth factor Packed cells (cell sheet) Cellular flux
  • Target cells labeled cells Migration of target cells: migration of labeled cells Elements: elements Endothelial cells: Endothelial cells
  • Fibroblast cells Fibroblast cells
  • Myoblast cells myoblast cells
  • Reagent Reagent Evaluation Migration of target cells (endothelial cells) in cell aggregate: migration of labeled cells (endothelial cells) in cell aggregates
  • Fluidity of packed cells (myoblast cells) Fluidity of packed cells (myoblasts) Quantification of network Comparing: comparison Active migration: Active migration Passive migration: Passive migration It is a figure which shows the procedure of lamination
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure for evaluating cell behavior in Example 1.
  • each term represents the following meaning.
  • Stacked confocal images Stacked confocal images
  • High magnification Step Step Determination of intensity threshold: Determination of intensity threshold
  • Conversion to binary images Conversion to binary images
  • Ratio of green voxels Ratio of green voxels
  • Axial distribution of colored voxels Axial distribution of colored voxels
  • Defining of thickness of cell sheet Defining the thickness of cell sheet
  • Axial packing Axial (height) packing Distribution over layer number Frequency of green voxels: frequency of green voxels
  • Layer number from bottom Layer number from bottom
  • FIG. 3 is a diagram showing
  • each term represents the following meaning.
  • Stacked confocal images Stacked confocal images
  • Low magnification Green green Merge images: Conversion to its skeleton with morphological filters: Thinning using morphological filters Measuring length of network and counting No. of tips: Measuring network length and counting endpoints It is a figure which shows the result of the coculture of the endothelial cell in the myoblast cell sheet
  • Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h (A) 0 layer, (B) 1 layer, (C) 2 layer, (D) 5 layer, Green: CD31 positive (Endothelial cells) Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells) Scale bar: 200 mm.
  • Green CD31 positive (Endothelial cells) Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells) Scale bar: 200 mm.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • each term represents the following meaning. Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: morphology of endothelial cells in myoblast sheet after 96 hours layer: layer Green: green CD31 positive: CD31 positive Red: Red Celltracker orange positive: Cell detection orange positive Scale bar: Scale line It is a figure which shows the result of the behavior change of the endothelial cell in the various layer number in the EBM-2 culture
  • Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h (A) 0 layer, (B) 1 layer, (C) 5 layer, Green: CD31 positive (Endothelial cells) Red: Celltracker orange positive ( Myoblast cells) Scale bar: 200 mm.
  • Green CD31 positive (Endothelial cells)
  • Red Celltracker orange positive ( Myoblast cells)
  • Scale bar 200 mm.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • each term represents the following meaning. Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: morphology of endothelial cells in myoblast sheet after 96 hours layer: layer Green: green CD31 positive: CD31 positive Red: Red Celltracker orange positive: Cell detection orange positive Scale bar: Scale line It is a figure which shows the result of a time-dependent change of the co-culture of the 5-layer myoblast sheet
  • each term represents the following meaning.
  • Frequency of green voxels frequency of green voxels
  • Layer number from bottom Layer number from bottom
  • Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblasts
  • Scale bar Scale line It is a figure which shows the result of the time-dependent change of the flow in the myoblast sheet
  • each term represents the following meaning.
  • Frequency of green voxels frequency of green voxels
  • Layer number from bottom Layer number from bottom 3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 3D images and spatial distribution of colored cells in a 5-layer sheet of myoblasts
  • Other layer sheet Other layer sheet Scale bar: Scale line It is a figure which shows the result of a comparison with the migration property of the endothelial cell of Example 1, and sheet
  • each term represents the following meaning.
  • Axial distribution of colored voxels Axial distribution of colored cells
  • Position of captured images position of captured image
  • Spatial distribution of endothelial cells and basal layer sheet in 5-layer sheet of myoblast cells Spatial distribution of endothelial cells and bottom layer sheet in 5-layer sheet of myoblasts
  • Scale bar Scale line It is a figure which shows the result of the influence on network formation of EGF of Example 1.
  • Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells (A) (C) EGF (-), (B) (D) EGF (+), (A) (B) 48 h, (C ) (D) 96 h, Green: CD31 positive (Endothelial cells) Red: Celltracker orange positive (Myoblast cells) Scale bar: 200 mm.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • each term represents the following meaning.
  • Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells Morphology of endothelial cells in myoblast 5-layer sheet Green: green CD31 positive: CD31 positive Red: Red Celltracker orange positive: Cell detection orange positive Scale bar: Scale line It is a figure which shows the result of the influence on network formation of EGF of Example 1. Specifically, Quantification of endothelial network (1 image 0,889 mm 2 ).
  • each term represents the following meaning.
  • Number of tips number of endpoints
  • Length length image: Image Quantification of endothelial network
  • FIG. 1 Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells (A) (C) EGF (-), (B) (D) EGF (+), (A) (B) 48 h, ( C) (D) 96 h, Green: CD31 positive (Endothelial cells) Red: Celltracker orange positive (Myoblast cells) Green line: Endothelial cells, Red broken line: Myoblast cells Scale bar: 20 mm. The lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • each term represents the following meaning.
  • Frequency of green voxels frequency of green voxels
  • Layer number from bottom Layer number from bottom
  • Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblasts
  • Scale bar Scale line It is a figure which shows the result of the influence on the myoblast sheet
  • 3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells (A) (C) EGF (-), (B) (D) EGF (+), (A) (B ) 48 h, (C) (D) 96 h, Green: Celltracker green (Basal layer sheet) Red: Celltracker red (Other layer sheet) Green line: Basal layer sheet, Red broken line: Other layer sheet Scale bar: 20 mm is shown. The lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • each term represents the following meaning.
  • Frequency of green voxels frequency of green voxels
  • Layer number from bottom Layer number from bottom 3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 3D images and spatial distribution of colored cells in a 5-layer sheet of myoblasts
  • Scale bar Scale line
  • each term represents the following meaning.
  • Myo 100 sheet a cell sheet consisting entirely of myoblasts
  • Myo 50 / Fib 50 sheet A cell sheet in which myoblasts and fibroblasts are mixed at a ratio of 50/50
  • Example 3 it is a figure which shows the culture state of a myoblast. Specifically, Photographs of myoblast at 48 h in (a) low- and (b) high-density cultures. (Scale bar: 100 mm.).
  • each term represents the following meaning.
  • Photographs of myoblast at 48 h in (a) low- and (b) high-density cultures : (a) a micrograph of myoblasts after 48 hours in a low-density and (b) high-density medium
  • Scale bar Scale line
  • Example 3 it is a figure which occupies the influence of the cytokine production characteristic by the culture state of a myoblast. Specifically, Cellular production rate of VEGF at 48h in low- and high density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheet.
  • each term represents the following meaning.
  • Production rate low density high density high density 5-layer sheet: 5-layer sheet Cellular production rate of VEGF at 48h in a low- and high-density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheet .: VEGF cell production rate after 48 hours in low and high density media, and 5 Cell production rate of VEGF after 48 hours in the medium of lamellar myoblast sheet It is a figure which shows the lamination
  • each term represents the following meaning.
  • Target cells labeled cells seeding density Packed cells (5-layer of myoblast sheet) stained by Celltracker orange: 5-layer myoblast sheet
  • Mounting Overlay
  • Previous protocol Conventional experimental design It is a figure which shows the result of the cocultivation of the endothelial cell in the myoblast cell sheet
  • FIG. The lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC).
  • each term represents the following meaning.
  • Pre-culture time of HUVECs Pre-culture time of HUVEC Co-culture time with myoblast sheet: Co-culture time with myoblast sheet the first 24 hours: the first 24 hours the last 24 hours: the last 24 hours
  • FIG. The lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC). It is a figure which shows the result of the culture procedure of Example 6, and the result of the co-culture of the endothelial cell in a cancer cell sheet.
  • the lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC).
  • the present invention relates to a novel cell evaluation system comprising a cell sheet laminate, target cells, and a two-dimensional analyzer.
  • the cell sheet laminate is a culture scaffold for the target cells (hereinafter sometimes referred to as culture format or packed cells).
  • cultivation scaffold will be obtained as a three-dimensional information by the two-dimensional analysis method. Will be able to.
  • the two-dimensional analysis apparatus is not particularly limited as long as it is a technique for obtaining cells as two-dimensional information or plane information.
  • the apparatus includes a fluorescence microscope, an optical microscope, a stereomicroscope, and a laser microscope.
  • microscopes such as confocal microscopes and confocal laser microscopes, plate reader devices, and other devices having macro lenses.
  • the observation may be performed on an image, or may be performed by visual observation in a microscope field of view.
  • the analysis method is not particularly limited as long as it is a normal method using the above-described apparatus.
  • cells are fluorescently stained and / or dyed by at least one method such as a reagent, protein, gene, etc.
  • the method etc. which observe with the microscope etc. which were mentioned above are mentioned.
  • Labeled cells refer to cells that have been fluorescently stained and / or dyed.
  • a cell sheet laminate is required.
  • a temperature-responsive base material is required.
  • This base material is obtained by grafting a temperature-responsive polymer to a cell culture base material having a specific surface by electron beam irradiation.
  • the material of the base material is not particularly limited, but the cell attachment surface is one of polystyrene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, or a combination of two or more. Of these, polystyrene and polycarbonate are particularly preferred as cell culture substrates.
  • the temperature-responsive polymer used for coating the substrate has an upper critical solution temperature or a lower critical solution temperature of 0 ° C. to 80 ° C., more preferably 20 ° C.
  • the cells may die, which is not preferable. Further, if the upper critical lysis temperature or the lower critical lysis temperature is lower than 0 ° C., the cell growth rate is generally extremely reduced or cells are killed, which is also not preferable.
  • the temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer.
  • a polymer examples include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers.
  • the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used.
  • copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used.
  • poly-Nn-propylacrylamide (a homopolymer) Lower critical solution temperature 21 ° C), poly-Nn-propylmethacrylamide (27 ° C), poly-N-isopropylacrylamide (32 ° C), poly-N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), poly- N-cyclopropylacrylamide (at 45 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (at about 35 ° C), poly-N-ethoxyethylmethacrylamide (at about 45 ° C), poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide (at the same) About 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl meth
  • Monomers for copolymerization used in the present invention include polyacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, poly-N, N-dimethylacrylamide, polyethylene oxide, polyacrylic acid and salts thereof, polyhydroxyethyl methacrylate, Examples thereof include water-containing polymers such as polyhydroxyethyl acrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, carboxymethyl cellulose, and the like, but are not particularly limited.
  • the coating amount of the temperature-responsive polymer on the surface of the culture substrate is preferably in the range of 1.1 to 2.3 ⁇ g / cm 2 , preferably 1.4 to 1.9 ⁇ g / cm 2 , more preferably 1. 5 to 1.8 ⁇ g / cm 2 .
  • the coating amount is less than 1.1 ⁇ g / cm 2 , the cells on the polymer are difficult to peel off even when a stimulus is applied, and the working efficiency is remarkably deteriorated.
  • it is 2.3 ⁇ g / cm 2 or more, it is difficult for cells to adhere to that region, and it becomes difficult to sufficiently attach the cells.
  • the form of the culture substrate in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include dishes, multiplates, flasks, and cell inserts.
  • the temperature of the cultured substrate to which the cultured cells are attached is equal to or higher than the upper critical solution temperature of the coating polymer on the culture substrate, or It can be made to peel by making it below the lower critical solution temperature. In that case, it can be performed in a culture solution or in another isotonic solution, and can be selected according to the purpose.
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FCS fetal calf serum
  • the base material to be coated substances generally capable of giving form such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., which are usually used for cell culture, such as polymer compounds other than those mentioned above, are used. All ceramics can be used.
  • the method for coating the culture substrate with the temperature-responsive polymer is not particularly limited, and for example, the method described in JP-A-2-21865 may be used. That is, such coating is performed by applying a substrate and the above monomer or polymer to one of electron beam irradiation (EB), ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, organic polymerization reaction, or physical application such as coating and kneading. It can be performed by, for example, mechanical adsorption.
  • EB electron beam irradiation
  • ⁇ -ray irradiation ultraviolet irradiation
  • plasma treatment corona treatment
  • corona treatment corona treatment
  • organic polymerization reaction organic polymerization reaction
  • physical application such as coating and kneading. It can be performed by, for example, mechanical adsorption.
  • the cell sheet laminate used in the present invention may be one in which the cell sheets are laminated alone or in combination with a sheet composed of another cell. In that case, it is preferable to use two or more different cells, because different cells interact with each other, and a cell sheet with higher activity can be obtained.
  • the position, order, and number of times of lamination are not particularly limited, but can be appropriately changed by using a synovial cell sheet having strong adhesion depending on the tissue to be coated or supplemented. Further, the number of lamination is preferably 10 times or less, preferably 8 times or less, and more preferably 4 times or less. Chondrocytes survive even in environments that are not originally filled with nutrient supply.
  • the method for constructing the vascular network is not particularly limited.
  • a method in which vascular endothelial cells are mixed in advance in a laminate a method in which vascular endothelial cell sheets are laminated in the production of a laminate, or cell sheet lamination Examples thereof include a method of embedding a body in a living body to construct a vascular network.
  • the method for producing the cell sheet laminate in the present invention is not particularly limited.
  • the cultured cells are peeled off in a sheet form, and the cultured cell sheets are laminated using a cultured cell moving jig as necessary. It is obtained by making it.
  • the temperature of the medium is not more than that temperature when the polymer coated on the surface of the culture substrate has an upper critical solution temperature, and particularly if it is more than that temperature if the polymer has a lower critical solution temperature.
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FCS fetal calf serum
  • the cultured cell transfer jig used is not particularly limited as long as it can capture the detached cell sheet, and examples thereof include porous films, films such as paper and rubber, plates, sponges, and the like.
  • a jig with a handle attached with a film such as a porous film, paper, rubber or the like, plates, sponges, etc. may be used.
  • the cell sheet laminate in the present invention is peeled off from the cell culture substrate coated with the temperature-responsive polymer, and the cultured cell sheet obtained by using the cultured cell transfer jig as necessary is
  • the cells are not damaged by proteolytic enzymes such as dispase and trypsin during the culture, and the basement membrane-like protein between the cell and the substrate formed during the culture is not damaged by the enzyme.
  • the desmosome structure between cells is retained, and there are few structural defects and high strength.
  • the cell sheet laminate used in the present invention is a densely laminated cell sheet, and therefore creates a special culture scaffold used in conventional cell evaluation systems. I found out.
  • the culture scaffold in the conventional evaluation system is sparse due to the presence of substances other than cells, and a large-scale analysis device is absolutely necessary for analysis in the thickness direction.
  • the cell sheet laminate of the present invention is in a state where cells are packed at high density, the thickness is thin, and the environment in the laminate is tissue-like, and two-dimensional analysis is performed in the thickness direction. Information can be read simply by overlapping.
  • the number of laminated cell sheets may be 3 or more, preferably 4 or more, and more preferably 5 or more. When the number of layers is two or less, the cell sheet laminate is different from the tissue-like state and is not suitable as the laminate of the present invention.
  • the present invention is evaluated by migrating target cells in the cell sheet laminate thus obtained and observing the behavior thereof.
  • the type of the target cell is not particularly limited, and a cell suitable for the purpose of evaluation may be adopted as appropriate.
  • cells having high migratory properties include myoblasts, vascular endothelial cells, mesenchymal stem cells, cardiomyocytes, and epidermal basement membrane cells, but are not particularly limited.
  • examples of cells having low migration ability include fibroblasts and differentiated epidermal keratinocytes, but are not particularly limited.
  • the cell sheet laminate used in the present invention is also characterized in that the fluidity can be changed by changing the type of cells in the laminate, thereby making it possible to create various pseudo-tissues.
  • the cells used at that time are not particularly limited, but examples of the cells having high fluidity include myoblasts, vascular endothelial cells, mesenchymal stem cells, cardiomyocytes, and epidermal basement membrane cells. Examples of the low fluidity cells include fibroblasts and differentiated epidermal keratinocytes, but are not particularly limited.
  • a cell sheet laminate having various fluidity can be prepared by mixing cells with low fluidity into cells with high fluidity.
  • the fluidity of this cell sheet laminate is not limited to the object of the present invention, but is considered to be an indicator of a cell sheet for the purpose of transplantation, for example.
  • the higher the fluidity of the cell sheet laminate the easier the blood vessel enters from the living body side, and the more transplanted cell sheet laminate conforms to the living body.
  • the biological index referred to in the present invention is not particularly limited as long as it is an evaluation relating to cells, and examples thereof include any one of cell viability, proliferation, migration and differentiation, or a combination of two or more thereof. It is done.
  • three-dimensional information about the cell may be used, and examples thereof include, but are not particularly limited to, a trajectory of movement of the cell, a cell network obtained as a result, and a degree of construction of the tubular tissue.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, advanced information called the biological parameter
  • a drug may be allowed to act on the above system. If the drug is allowed to act on the system of the present invention and the behavior of the target cell is observed, the effect of the drug on the cell can be known.
  • the drug to be used is not particularly limited, and may be appropriately used according to the system to be evaluated. For example, cytokines such as EGF, HGF, and VEGF, anticancer agents, differentiation inducers, etc. Is mentioned.
  • the present invention is expected to be extremely useful as a system for drug discovery and efficacy evaluation.
  • various evaluation systems can be constructed by changing the combination of the cell sheet laminate, the labeled cell, and the two-dimensional analyzer.
  • the cells constituting the cell sheet laminate are myoblasts
  • the labeled cells are fluorescently labeled vascular endothelial cells
  • the migration of the labeled cells is measured by a fluorescence microscope.
  • the vascular network construction mechanism can be evaluated.
  • the cells constituting the cell sheet laminate are cancer cells
  • the labeled cells are fluorescently labeled vascular endothelial cells
  • the drug is an anticancer drug
  • the efficacy of the anticancer drug can be evaluated.
  • the cells constituting the cell sheet laminate are differentiated cells
  • the labeled cells are fluorescently labeled stem cells
  • the drug is a differentiation inducer
  • the differentiation programming mechanism of the stem cells can be analyzed.
  • the cell of the present invention is not limited, and examples thereof include cells such as animals, insects and plants, and bacteria. Of these, many commercially available animal cells are advantageous. Examples of the origin of animal cells include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, rats, nude mice, mice, guinea pigs, pigs, sheep, Chinese hamsters, cattle, marmoset, and African green monkeys. .
  • a three-dimensional analysis is performed by a simple method of two-dimensional analysis of a biological index related to at least one selected from viability, proliferation, migration and differentiation of cultured cells. Information can be obtained. Conventionally, observing the behavior of cells in a tissue requires a large-scale analysis device, but the present invention eliminates the necessity.
  • FIG. 1 A co-culture system of vascular endothelial cells and myoblast sheet was constructed (FIG. 1).
  • This system consists of three elements: “target cells”, “filling cells”, and “drugs”.
  • the endothelial cells that migrate inside the packed cells are labeled cells, and the myoblasts of the sheet, which is the place of labeled cells, It is a packed cell, and the migration of the labeled cell and the behavior of the packed cell can be controlled by stimulating drug addition.
  • Previous studies have shown that the cells of a sheet migrate in the dense environment of the sheet, which is called the “flow” of packed cells.
  • labeled cells migrate in a dynamic scaffold, and this system is a system close to in vivo that is surrounded by other cells and is also affected by intercellular communication. Even in this system, analysis under conditions mimicking in vivo is possible.
  • endothelial cells which are labeled cells
  • sheet flow which is packed cells. The procedure shown in Fig. 3 is used to examine whether endothelial cells migrate faster than sheet flow (Active migration) or passively migrate to sheet flow (Passive migration) by comparing endothelial cell migration and sheet flow. did.
  • the network was quantitatively evaluated according to the procedure shown in FIG.
  • epidermal growth factor EGF
  • an epidermal growth factor was added as a drug, and the effect was examined.
  • the experiment used scaffold-dependent human skeletal muscle myoblasts (Camblex) and normal human venous endothelial cells (Lonza) at 37oC in a CO 2 incubator (MCO-17AI, Sanyo Electric). The culture was performed in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the medium is 1 vol% of antibiotic-antifungal agent 100 ⁇ (Invitrogen), 2 vol% of 1M HEPES buffer (Sigma), fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS, Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM, manufactured by Sigma) to which 10 vol% of each was added (hereinafter referred to as DMEM (0% FBS)) was used.
  • EGM-2 BulletKit manufactured by Lonza
  • EBM-2 BulletKit manufactured by Lonza
  • trypsin solution consisting of 0.1% trypsin (Sigma) and 0.02% EDTA (Ethlenediamine tetra-acetic acid, Sigma) was added dropwise per 1 cm 2 of culture area, and 5 minutes at 37oC. (Min)
  • the reaction was performed and the cells were detached.
  • a trypsin inhibitor solution (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) in the same amount as trypsin was added to stop the enzyme dispersion reaction.
  • Cells are collected by centrifugation at 1450 rpm and room temperature for 5 min (min), and the cell suspension re-suspended in culture medium is inoculated on the culture surface at a viable cell concentration of 2.5 ⁇ 10 3 cells / cm 2.
  • the medium was added to a depth of 2 mm. The medium was changed every 48 h (hours).
  • a temperature-responsive culture vessel is a culture surface in which N-isopropylacrylamide is graft-polymerized on a polystyrene surface. The surface reversibly changes to hydrophobic and hydrophilic at 32 ° C, so cell indirect due to temperature changes. It is possible to easily detach the cells from the culture surface while maintaining the attachment.
  • the myoblast sheet was prepared by seeding myoblasts in a temperature-responsive culture vessel in an amount of 2.3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 so as to be confluent after pre-incubation at 37 ° C. for 24 h (hours). After 24 hours (hours), the cell sheet that has been detached by incubating for 30 minutes at 20 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere is recovered from the top with a gelatin gel. This becomes a single-layer cell sheet, and a multilayer sheet is produced by repeatedly peeling and collecting the cells.
  • endothelial cells are seeded in a 35 mm culture dish at 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium is EBM-2 (2% FBS), but in order to improve the adhesion of the myoblast cell sheet to be mounted later, the FBS ratio was increased after 24 h, at an optimal concentration for endothelial cell proliferation. Change the medium to EBM-2 with 20% FBS. After 24 h (hours), the culture medium is removed and various layers of myoblast sheets are placed. The gelatin gel was dissolved and removed at 37 ° C., and co-culture was started with the time when the gelatin gel was dissolved as 0 h (0 hour) (FIG. 2).
  • myoblasts are stained before producing the sheet in order to know the height of the tissue and to color-code the sheet when examining the flow of myoblasts.
  • 1 mL of a trypsin solution consisting of 0.1% trypsin (manufactured by Sigma) and 0.02% EDTA (Ethlenediamine tetra-acetic acid, manufactured by Sigma) was added dropwise per 1 cm 2 of the culture area and reacted at 37 ° C for 3 min (minutes). Cells were detached.
  • trypsin inhibitor solution (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) in the same amount as trypsin was added to stop the enzyme dispersion reaction.
  • Cells are collected by centrifugation at 1000 rpm and room temperature for 5 min (minutes), and 10 ⁇ M CellTracker Orange CMTMR (Molecular probe) (or CellTracker green CMFDA (Molecular probes)) is added to give 5 mM CellTrakcer Dye. After standing at 37 ° C in 5% CO 2 atmosphere for 15 min (min), collect cells by centrifugation at 1000 rpm and room temperature for 5 min (min), and resuspend in DMEM 10% FBS After seeding, seed at an amount of 2.3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 .
  • Antibody staining was performed with anti-CD31 (Mouse Monoclonal Anti-Human CD31, manufactured by DAKO) in order to identify and observe endothelial cells in a tissue in which myoblasts and endothelial cells were mixed.
  • CD31 is an antibody that recognizes a glycoprotein with a molecular weight of 100 kD present in endothelial cells. After washing the cells with PBS, 4% paraformaldehyde / phosphate buffer solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the cells were allowed to stand overnight at 4 ° C. and fixed.
  • the culture surface was washed twice with PBS, and 0.1% Triton® X-100 diluted with PBS was added to impart permeability to the cells. After washing twice with PBS, it was immersed in 0.1% bovine serum-derived albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted with PBS for 1 h (hour). Thereafter, the cells were immersed in anti-CD31 antibody diluted 40-fold with 0.1% bovine serum-derived albumin and allowed to stand overnight at 4 ° C.
  • 0.1% bovine serum-derived albumin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the plate was washed twice with PBS, and immersed in a secondary antibody (Alexa FluorR-488-goat-anti-mouse IgG, manufactured by Molecular Probes) diluted 200-fold with 0.1% bovine serum-derived albumin at room temperature for 1 hour (hour). After washing twice with PBS, drop 1 or 2 drops of Slow fade (Molecular Probes), cover glass (IWAKI), and confocal microscope (EX-20, OLYNPUS) Three-dimensional images were acquired and cell observation was performed.
  • a secondary antibody Alexa FluorR-488-goat-anti-mouse IgG, manufactured by Molecular Probes
  • bovine serum-derived albumin 0.1% bovine serum-derived albumin
  • the bottom layer sheet is dyed green with Celltracker green CMFDA and the other four layers are dyed red with Celltracker orange CMTMR by the method shown in the cytoplasm staining method above, and the above (construction of sheet co-culture system)
  • a myoblast cell sheet was prepared according to the procedure, and the sheet was placed on an FBS-coated 35 mm culture dish and cultured.
  • Step 3 For the frequency distribution in the vertical direction, a method of obtaining the frequency distribution in the vertical direction of the three-dimensional image obtained by the confocal laser scanning microscope was used (FIG. 3). First, the slice image of each color is binarized by a threshold determined visually (Step 1), and the number of green pixels (N G [voxel]) of one image is calculated by adding the number of green and red pixels ( N G + N R [voxel]) to obtain a distribution in the height direction (R G [-]) (Step 2).
  • Step 3 For each color, define a portion of 10% or more of the distribution normalized by the maximum number of pixels ( NG , max or N R , max [voxel]) as the portion where the stained tissue exists, and height (z [ ⁇ m] ) Is calculated (Step 3).
  • the distribution of Step 2 is further normalized within the height range obtained from Step 3, and the distribution of green voxel is obtained as the frequency distribution (F G [-]) for each sheet layer, and the endothelial cells and the lowermost sheet Cell distribution was created (Step 4).
  • Quantitative evaluation of the blood vessel network is a two-dimensional image analysis of the network photograph taken with a confocal laser microscope using Image ProPlus ( Figure 4).
  • the networks were compared with each other by counting the length of the network and the number of endpoints of the image that was binarized with a visually determined threshold and thinned using a morphological filter.
  • Endothelial cells were cultured in EBM-2 medium for 48 h (hours), then seeded with 2.0 x 10 4 cm 2 myoblasts stained with Celltracker orange (A 0-layer sheet)
  • a myoblast sheet on which layers 1, 2, and 5 were placed was co-cultured with DMEM (10% FBS) for 96 h (hours), followed by CD31 staining.
  • DMEM 50% FBS
  • endothelial cells were hardly seen and no network was present (FIG. 5A).
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote. This is a single culture of endothelial cells.
  • FIG. 6 shows the result of coculturing for 96 h (hour) with EBM-2 by placing 0, 1, and 5 layers of myoblast sheet on the endothelial cells.
  • endothelial cells were hardly present in layers 0 and 1 (FIGS. 6A and B).
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • EBM-2 can adhere to both endothelial cells and myoblasts, but they all form agglomerates and there is no network.
  • a 5-layer sheet was placed, a network was formed in a wide range (FIG. 6C).
  • the network formation is not a problem for the network formation, and the growth in the three-dimensional organization called the 5-layer sheet promoted the network formation.
  • EBM-2 formed a finer network than DMEM (10% FBS), and it was a smooth thread with few irregularities.
  • network formation does not depend on the type of medium or the adhesion to the culture surface, but growth in a three-dimensional organization called a 5-layer sheet is thought to promote network formation. Therefore, it was suggested that the sheet plays the role of the matrix of endothelial cells and has the function of forming a network like the matrix in vitro such as matrigel and collagen gel.
  • DMEM 10% FBS
  • FIG. 7 shows a photograph taken confocally after culturing five layers of myoblast cell sheets and endothelial cells in DMEM (10.% FBS) for 0, 48, 96 h (hours). The lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • FIG. 7A shows that endothelial cells have already begun to bind to each other at 0 h immediately after the gelatin gel is dissolved. It is considered that 3 h (time) has elapsed since the myoblast sheet was placed on the endothelial cells at 0 h in the sheet stacking procedure, and it was bound during that time.
  • the endothelial cells formed a fibrous network, and at 96 h (hour), a network having a different form from that at 48 h (hour) was formed (FIGS. 7B and C). From the photograph of the sectional view, the endothelial cells are present under the myoblast sheet at 0 h (time) of the sheet culture (FIG. 7D). In cultures of 48 and 96 h (hours), many endothelial cells were present inside the sheet, so it is considered that the endothelial cells migrated upward within the sheet (FIGS. 7E and F). At 48 and 96 h (hours), agglomeration was observed on the upper surface of the sheet as shown in FIG. 7G.
  • FIG. 8 shows a three-dimensional image taken at a confocal point, a cross-sectional view, and the distribution of the lowermost sheet cells.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • the endothelial cells migrate faster than the sheet flow, and the endothelial cells are bound to each other, and as a result, the endothelial cells are networked and agglomerated. Therefore, it is considered that the endothelial cells are actively migrating more actively than the myoblasts.
  • FIG. 11 is a graph obtained by thinning the image through image processing, evaluating the network length L ( ⁇ m / image) and the number of end points T [tip], and plotting an image of 96 h (time).
  • L ⁇ m / image
  • T tip
  • FIG. 12 shows a photograph of a sectional view of an endothelial cell and a distribution in the vertical direction.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote. From FIGS. 12A ′, B ′, C ′, and D ′, it seems that there is no difference in the presence or absence of EGF in 48 and 96 h (time), and EGF is considered not to affect the migration of endothelial cells.
  • FIG. 13 shows a three-dimensional image taken at a confocal point when EGF is added, a cross-sectional view, and a distribution of sheet cells in the lowermost layer.
  • the lightly colored part in the figure corresponds to “Green” in the figure footnote.
  • the vertical distribution does not seem to be affected by the addition of EGF for 48 or 96 hours (time) (FIGS. 13A ′, B ′, C ′, and D ′).
  • EGF has little influence on the fluidity of the sheet, and it is predicted that the promotion of endothelial cell network formation is not caused by the increase in the sheet flow.
  • EGF did not affect the sheet flow nor the vertical migration of endothelial cells, but the EGF addition plot in FIG. 11 is on the extension of the plot without EGF addition.
  • bFGF increases the expression of VE-cadherin, an adhesion molecule for endothelial cells. As a result, the frequency of strong cell-to-cell adhesion is increased, and it is considered that a fine network was not formed.
  • a 5-layer myoblast sheet laminate (FIG. 14 (A)) consisting of only myoblast sheets and myoblasts and fibroblasts were mixed at a ratio of 50/50 in the same manner as in Example 1.
  • a layered cell sheet laminate (FIG. 14B) was prepared. The lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC). Each cell sheet was evaluated for migration of human vascular endothelial cells in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. From the examination of the migration of vascular endothelial cells after 5 hours (hours) of culture, the fluidity in the myoblast sheet is reduced by the mixture of fibroblasts, and as a result, the migration of vascular endothelial cells is reduced. I understood that.
  • the laminate comprising only myoblast sheet has higher VEGF production and lower HGF production than the cell sheet laminate in which myoblasts and fibroblasts are mixed at a ratio of 50/50.
  • VEGF is produced by myoblasts and HGF is produced by fibroblasts. From the above, it is considered necessary to reduce the fluidity in the laminate and to make VEGF and HGF exist in order to sufficiently develop the vascular network by the invading vascular endothelial cells.
  • a multilayer cell sheet is a confluent single-layer sheet formed by confluence, so that it is also densely confluent in three dimensions, and the cells temporarily lose their proliferative properties due to contact inhibition. Therefore, the cytokine characteristics were compared in a state that can be regarded as a sheet-mimetic system in which cells are in close contact with each other and in a state in which cells can migrate relatively freely.
  • Myoblasts were seeded at the same high density (2.3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ) and low density (1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ) as the sheet, and a culture medium was obtained for 48 hours of culture. VEGF production was measured by ELISA. The number of cells at the time of medium collection was determined by counting and evaluated as the amount of VEGF produced per cell.
  • FIG. 15 shows the results after 48 hours of low density and high density culture.
  • the cells were counted by trypan blue staining, and the cell densities were (1.22 ⁇ 0.10) ⁇ 10 4 cells / cm 2 and (1.89 ⁇ 0.14) ⁇ 10 5 cells / cm 2 , respectively.
  • FIG. 16 shows the amount of VEGF produced per cell determined from the medium collected at 48 hours of culture. The total production amount was determined from the concentration detected by ELISA and the culture medium volume of 2.1 mL, and was calculated by normalizing with the cell density and the total cell number obtained from the culture dish area of 10.5 cm 2 . For the amount of myoblast 5-layer sheet produced in 48 hours of culture, the value normalized by the number of cells was also listed.
  • the production amount per cell of the high-density culture is about twice that of the low-density culture, suggesting that the VEGF-producing ability of myoblasts is increased by taking a dense confluent state.
  • the value of the high-density culture is close to the value of the five-layer sheet culture, and it is considered that it is important in terms of increasing the VEGF secretion ability (secretion efficiency) to produce a sheet as a transplant material only with confluent cells.
  • Example 1 vascular endothelial cells were cultured in EBM-2 (containing 2% FBS) medium for 24 hours and then cultured in EBM-2 (containing 20% FBS) medium for 24 hours (described in FIG. 17).
  • the previous (protocol (C)) was cultured for 24 hours in EBM-2 (containing 2% FBS) medium (FIG. 17 (A)), or from the beginning as EBM-2 (containing 20% FBS) 24
  • the behavior of vascular endothelial cells in the myoblast cell sheet was examined by the same method as in Example 1 except that the method was cultured for only time (FIG. 17B).
  • FIG. 18 shows the culture of vascular endothelial cells when cultured under conditions A to C (photographed at 8 spots at random in each condition).
  • the lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC).
  • the culture condition (B) formed a fine network similar to the culture condition (C) shown in Example 1.
  • a co-culture system of cancer cells and vascular endothelial cells was constructed.
  • (Co-culture of cancer cell sheet and vascular endothelial cell) A cancer cell multilayer sheet was prepared according to the method of Example 1, using A549 strain cancer cells as cancer cells. At that time, the cell seeding number was 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2, and after culturing for 24 hours, five layers were laminated. As the medium, DMEM containing 10% FBS was used.
  • vascular endothelial cells (HUVEC) were cultured in EBM-2 medium for 24 hours (seeding density 1.0x10 4 cells / cm 2 ), and then cultured in EBM-2 (containing 20% FBS) for 24 hours. did.
  • FIG. 19 shows the behavior of HUVEC in the laminated A549 cell sheet after 0, 5, and 24 hours.
  • the lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC).
  • vascular endothelial cells The migration of vascular endothelial cells to the outside of the laminated cell sheet is a phenomenon observed even when the filling cells are myoblasts. However, when A549 is used as the filling cell, it collapses from the network formation of the vascular endothelial cells and goes out of the sheet. Was going very fast.
  • a co-culture system of cancer cells and vascular endothelial cells was constructed under conditions different from those in Example 5.
  • the medium after the adhesion of the cancer cell multilayer sheet to HUVEC in Example 5 was changed from the DMEM medium containing 10% FBS (the uppermost photograph in FIG. 20) to EBM-2 (2 % FBS) (Fig. 20 bottom photo) or EBM-2 with 20% FBS added (containing 20% FBS) (Fig. 20 middle row photo)
  • Example 5 was followed except for co-culture.
  • the lightly colored parts in the figure correspond to vascular endothelial cells (HUVEC).
  • EBM-2 containing 2% FBS
  • EBM-2 containing 20% FBS
  • a co-culture system of mesenchymal stem cells and vascular endothelial cells was constructed. (Co-culture of mesenchymal stem cell sheet and vascular endothelial cells) Using adipose-derived mesenchymal stem cells, a multilayer sheet of mesenchymal stem cells was prepared according to the method of Example 1. At that time, the cell seeding number was 4.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2, and after culturing for 48 hours, five layers were laminated. As the medium, ⁇ -MEM containing 10% FBS was used.
  • vascular endothelial cells were cultured in EBM-2 medium for 24 hours (seeding density 1.0x10 4 cells / cm 2 ), and then cultured in EBM-2 (containing 20% FBS) for 24 hours. did.
  • a laminated mesenchymal stem cell sheet was adhered on the HUVEC, and the behavior of the HUVEC under the laminated mesenchymal stem cell sheet was examined in the same manner as in Example 1 using a fluorescence microscope. As a result, it was found that HUVEC under the laminated mesenchymal stem cell sheet migrated to the uppermost layer of the laminated mesenchymal stem cell sheet after 48 hours.
  • a co-culture system of cardiomyocytes and vascular endothelial cells was constructed.
  • (Co-culture of cardiomyocyte sheet and vascular endothelial cell) A cardiomyocyte multilayer sheet was prepared using rat cardiomyocytes according to the method of Example 1. At that time, the cell seeding number was 5.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2, and after culturing for 24 hours, five layers were laminated. As the medium, M199 containing 10% FBS was used.
  • vascular endothelial cells (HUVEC) were cultured in EBM-2 medium for 24 hours (seeding density 1.0x10 4 cells / cm 2 ), and then cultured in EBM-2 (containing 20% FBS) for 24 hours. did.
  • a laminated cardiomyocyte sheet was adhered on the HUVEC, and the behavior of the HUVEC under the laminated cardiomyocyte sheet was examined using the same concept as in Example 1 using an optical microscope. As a result, it was found that HUVEC under the laminated cardiomyocyte sheet migrated to the uppermost layer of the laminated cardiomyocyte sheet after 96 hours.
  • a co-culture system of epidermal keratinocytes and fibroblasts was constructed. (Co-culture of epidermal keratinocyte sheet and fibroblast) Using the epidermal keratinocytes, a stratified sheet of epidermal keratinocytes was prepared according to a conventional method using 3T3 cells as feeder cells. The cell seeding number at that time was 4.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2, and after culturing for 14 days, a stratified epidermal keratinocyte sheet in which about 3 layers were laminated could be obtained. As the medium, DMEM medium containing 10% FBS was used.
  • fibroblasts were cultured in DMEM medium for 24 hours (seeding density 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ).
  • a stratified epidermal keratinocyte sheet was adhered on the fibroblast, and the behavior of the fibroblast under the stratified epidermal keratinocyte sheet was examined in the same manner as in Example 1 using a fluorescence microscope. As a result, it was found that fibroblasts under the stratified epidermal keratinocyte sheet hardly migrated into the stratified epidermal keratinocyte sheet even after 48 hours.
  • a three-dimensional analysis is performed by a simple method of two-dimensional analysis of a biological index related to at least one selected from viability, proliferation, migration and differentiation of cultured cells. Information can be obtained. It does not require an expensive and large-scale analysis device as in the prior art, and can be easily combined with surrounding cell culture devices to obtain advanced information. Therefore, the present invention is a very useful invention in the fields of drug discovery, pharmacy, medicine, biology and the like.

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Abstract

　細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システムを構築することによって、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する３次元の生物学的指標を２次元の解析という簡便な手法で得ることができる。

Description

細胞シートを利用した細胞評価システム及びその利用方法
　本発明は、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞評価システム及びその利用方法に関するものである。
　近年、損傷を受けた生体組織を再生するためにさまざまな再生医療技術が注目されている。このことは、心筋組織の再生を例にとっても、心筋組織へ心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞を直接注入し再生する方法、後述するように心筋組織細胞を特殊な温度応答性基材上で培養し温度変化させて低損傷な心筋組織細胞シートして移植して再生する方法（特許文献１参照。）等の多くの研究が進められており、一部の細胞ではヒトへの臨床研究も始まっている。そして、最近では胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や間葉系幹細胞から心筋細胞を分化誘導する研究が進められ、さらには人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋細胞を分化させようとする研究も始まっている。これとは別に、体外で組織工学手法を用いて心筋組織を構築した上で、体内に戻すという研究もおこなわれている。これまでに、コラーゲン、ポリ乳酸、ゼラチンからなる３次元の支持体を用いて新生仔ラットの心筋細胞を培養することにより、心筋組織様構造が構築されたと報告されている（非特許文献１、２、３参照。）。しかし、全身に血液を送り出すような収縮弛緩機能を持つ心筋組織の構築にはいくつもの障害があることが明らかとなっている。
　再生医療技術の発展のためには細胞培養技術の発展が必要不可欠になってきた。そして、その動物細胞培養技術はさらに進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させたり、或いはその細胞の機能を高めて生体内へ戻し治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者が注目している一分野である。特に培養細胞を利用して医薬品や化粧品の評価を行う技術分野は、評価条件の均一化及び動物愛護の意味からこれまでの動物実験に代わる技術として注目されている。
　そのような中、特許文献２、非特許文献５ではゲル中に包埋された細胞の状態で細胞の生物学的指標を試験する試験方法が示されている。培養しようとする細胞を生体外で組織様に立体的に培養しようとする通常用いられる方法であるが、この場合、ゲルの厚さによりゲル中の細胞の様子を２次元解析装置のような簡便な装置で分析できず、例えば常に共焦点顕微鏡のような３次元で解析するような高価で大がかりな装置を利用しなくてはならなかった。さらに、ゲル中の細胞は生体組織内のように密度の高い状態とならず、どうしても密度の低い、疎の状態となり、評価系としては必ずしも十分なものではなかった。
　また、特許文献３には多孔膜を利用して細胞の機能を評価する方法が示されている。多孔膜を利用する方法としては、通常、特許文献３のように評価したい細胞を多孔膜の通過程度で判断したり、多孔膜を通して物質だけを通過させ細胞への影響を見る方法が示されれている。しかしながら、この方法では多孔膜という人工物に対する細胞の挙動を観察しているに過ぎず、必ずしも生体内における細胞の挙動を再現しているものではなかった。
　さらに、非特許文献４には細胞培養基材上の細胞を利用した評価システムが示されているが、ここでの技術は基材上で培養された１層の細胞を利用するもので、細胞を利用した評価系であるものの生体内の組織の状態とは全く異なる２次元での情報しか得られず、細胞評価システムとして必ずしも十分なものではなかった。
　このような背景のもと、特許文献４には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０～８０℃である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献５には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。ここで得られた細胞シートは移植に利用できるものであり、その細胞シートは生体に近い構造になっていることが予想され、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞評価システムとして利用できることが十分に期待できる。
再表２００２－００８３８７号公報 特開２００７－２５９８２９号公報 特開２００８－１１８９００号公報 特開平２－２１１８６５号公報 特開平０５－１９２１３８号公報
ＦＡＳＥＢ　Ｊ．、１１、６８３－６９４（１９９７） Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２２７、Ｈ４３３－Ｈ４４４（１９９９） Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１１９、３６８－３７５（２０００） Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２６８，　３６－４４（２００１） Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　８，５２３－５３３（２００１）
　本発明は、上述したような細胞評価システムに関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性細胞培養基材を提供するものである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、温度応答性培養基材を利用して得られた細胞シート積層体が生体内の構造に近い特殊な環境を作り出していることを見出した。さらにその細胞シート積層体を構成する細胞の種類を変えることで細胞シート積層体内の細胞の状態を変えることができ、さまざまな疑似組織を作れることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明は、２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システムを提供する。また、本発明は、かかる細胞評価システムを利用し２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞評価方法をも提供する。本発明は大がかりな装置を使って細胞シート積層体の三次元構造を直接的に測定するものではなく、簡単な手法でも入手できる２次元の情報を連続的に解析することで３次元の情報を得ようとするものである。
　本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の高度な情報を得ることができるようになる。従来、組織中の細胞の挙動を観察するのは大がかりな解析装置を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなり、さらに周辺の細胞培養装置と容易に組み合わせられ高度な情報を得ることができるようになる。
実施例１の概要を示す図である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Growth factor: 増殖因子
Packed cells (cell sheet): 充填細胞（細胞シート）
Cellular flux: 細胞流動
Target cells: 標識細胞
Migration of target cells: 標識細胞の遊走
Elements: 要素
Endothelial cells: 内皮細胞
Fibroblast cells: 線維芽細胞
Myoblast cells: 筋芽細胞
Reagent: 試薬
Evaluation: 評価
Migration of target cells (endothelial cells) in cell aggregate: 細胞集合体における標識細胞（内皮細胞）の遊走
Fluidity of packed cells (myoblast cells): 充填細胞（筋芽細胞）の流動性
Quantification of network: ネットワークの定量
Comparing: 比較
Active migration: 能動的遊走
Passive migration: 受動的遊走
実施例１の細胞シートの積層化の手順を示す図である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Myoblast cells: 筋芽細胞
Seeding: 播種
Depth: 深さ
Temperatured-responsive culture well plate: 温度応答性培養ウエルプレート
Gelatin gel: ゼラチンゲル
Stamp: スタンプ
Overlay: 積み重ね
Harvest: 剥離
Repetition: 繰り返し
Removal of gelatin gel: ゼラチンゲルの除去
Incubation: インキュベーション
Analysis: 分析
実施例１の細胞挙動の評価手順を示す図である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Stacked confocal images: 積層化された共焦点画像
High magnification: 高倍率
Step: ステップ
Determination of intensity threshold: 強度閾値の決定
Conversion to binary images: 二値画像への変換
Green: 緑色
Red: 赤色
Counting number of detected pixels: 検出画素数の計算
Number of green voxels: 緑色ボクセル数
Height of captured image: 捕捉画像の高さ
Normalizing number of green voxels to total number of green and red ones: 緑色及び赤色ボクセルの総数に対する緑色ボクセル数の規格化
Ratio of green voxels: 緑色ボクセルの割合
Axial distribution of colored voxels: 有色ボクセルの軸方向（高さ方向）分布
Defining of thickness of cell sheet: 細胞シートの厚さの定義
Axial packing: 軸方向（高さ方向）充填
Distribution over layer number: 層数分布
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
実施例１の細胞挙動の評価手順を示す図である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Stacked confocal images: 積層化された共焦画像
Low magnification: 低倍率
Green: 緑色
Merge images: 併合画像
Conversion to its skeleton with morphological filters: モフォロジカルフィルタを用いる細線化
Measuring length of network and counting No. of tips: ネットワークの長さ測定及び端点数の計数
実施例１の筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。具体的にはMorphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h,(A)0 layer, (B)1 layer, (C)2 layer, (D)5 layerを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: ９６時間後における筋芽細胞シート中の内皮細胞の形態
layer: 層
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEBM-２培養での種々の層数における内皮細胞の挙動変化の結果を示す図である。具体的には、Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h,(A)0 layer, (B)1 layer, (C)5 layerを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: ９６時間後における筋芽細胞シート中の内皮細胞の形態
layer: 層
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１の5層の筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養の経時変化の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells, (A)(D)0 h, (B)(E)48 h, (C)(F)96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : (A)-(C)200 mm, (D)-(G)20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１の筋芽細胞シート内流動の経時変化の結果を示す図である。具体的には、3-D  images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)0 h, (B) 48 h, (C)96 hを示し、Green : Celltracker green(Basal layer sheet)Red : Celltracker red(Other layer sheet)Green line : Basal layer sheet, Red broken line : Other layer sheetScale bar : 20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける有色細胞の３次元画像及び空間分布
Green: 緑色
Red: 赤色
Green line: 緑色線
Basal layer sheet: 底部層シート
Red broken line: 赤色破線
Other layer sheet: 他の層のシート
Scale bar: 目盛り線
実施例１の内皮細胞の遊走性とシート流動の比較の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells and basal layer sheet in 5-layer sheet of myoblast cells, (A)0 h, (B)48 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Basal layer sheet)Green line : Endothelial cells, Red broken  line : Myoblast cellsScale bar : 20 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Axial distribution of colored voxels: 有色細胞の軸方向（高さの方向）分布
Position of captured images: 捕捉画像の位置
Spatial distribution of endothelial cells and basal layer sheet in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞及び底部層シートの空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells (A)(C)EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D) 96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の形態
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Quantification of endothelial network (1 image  0,889 mm2) としている。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Number of tips: 端点数
Length: 長さ
image: 画像
Quantification of endothelial network: 内皮ネットワークの定量
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)(C)EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D) 96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Green line : Endothelial cells, Red broken  line : Myoblast cellsScale bar : 20 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Green line: 緑色線
Endothelial cells: 内皮細胞
Red broken line: 赤色破線
Myoblast cells: 筋芽細胞
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFの筋芽細胞シート流動への影響の結果を示す図である。具体的には、3-D  images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)(C) EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D)96 hを示し、Green : Celltracker green(Basal layer sheet)Red : Celltracker red(Other layer sheet)Green line : Basal layer sheet, Red broken line : Other layer sheetScale bar : 20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける有色細胞の３次元画像及び空間分布
Green: 緑色
Celltracker green: 細胞探知緑色
Basal layer sheet: 底部層シート
Red: 赤色
Celltracker red: 細胞探知赤色
Other layer sheet: 他の層のシート
Green line: 緑色線
Red broken line: 赤色破線
Scale bar: 目盛り線
実施例２の筋芽細胞シートだけからなる積層体と筋芽細胞と線維芽細胞が50/50の割合で混合された細胞シート積層体への血管内皮細胞の遊走性を比較検討した結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Myo 100 sheet: すべて筋芽細胞からなる細胞シート
Myo 50 / Fib 50 sheet: 筋芽細胞と線維芽細胞が50/50の割合で混合された細胞シート
実施例３において、筋芽細胞の培養状態を示す図である。具体的には、Photographs of myoblast at 48 h in (a) low- and (b) high-density cultures.（Scale bar: 100 mm.）を示している。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Photographs of myoblast at48 h in (a) low- and (b) high-density cultures: （ａ）低密度、及び（ｂ）高密度の培地における４８時間後の筋芽細胞の顕微鏡写真
Scale bar: 目盛り線
実施例３において、筋芽細胞の培養状態によるサイトカイン産生特性の影響を占めす図である。具体的には、Cellular production rate of VEGF at 48h in low- and high　density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheetを示す。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Production rate: 産生速度
low density: 低密度
high density: 高密度
5-layer sheet: ５層シート
Cellular production rate of VEGF at 48h in a low- and high-density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheet.: 低密度培地及び高密度培地における４８時間後のＶＥＧＦの細胞産生速度、並びに５層筋芽細胞シートの培地における４８時間後のＶＥＧＦの細胞産生速度
実施例４の細胞シートの積層化手順を示す図である。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Target cells: 標識細胞
seeding density: 播種細胞密度
Packed cells (5-layer of myoblast sheet) stained by Celltracker orange: 細胞探知オレンジで染色した充填細胞（５層の筋芽細胞シート）
Myoblast sheet-HUVEC co-culture: 筋芽細胞シート－HUVEC共培養
Mounting: 上載せ
Previous protocol: 従来の実験計画
実施例４の筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。
　図中、各用語は次の意味を表わす。
Seeing density: 播種細胞密度
Pre-culture time of HUVECs: HUVECの前培養
Co-culture time with myoblast sheet: 筋芽細胞シートを用いた共培養時間
the first 24 hours: 最初の２４時間
the last 24 hours: 最後の２４時間
実施例５の癌細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。 実施例６の培養手順並びに癌細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。
　本発明は、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる新規な細胞評価システムに関するものである。その際、細胞シート積層体とは標的細胞にとっては培養の足場（以下、培養フォーマット、充填細胞ということがある。）となる。本発明のシステムであれば２次元の解析手法で培養の足場内にいる標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得ることができるようになる。その２次元解析装置とは、細胞を２次元の情報や平面の情報として得る手法であれば特に限定されるものではないが、例えばその装置としては、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、実体顕微鏡、レーザー顕微鏡、共焦点顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等の顕微鏡類、プレートリーダー装置類、その他マクロレンズを有する装置類等が挙げられる。観察は画像上で行ってもよく、顕微鏡視野で目視によって行ってもよい。また、その解析手法も上述した装置を利用する通常の方法であれば特に限定されないが、例えば細胞を試薬、蛋白質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色しその程度を上述した顕微鏡類等で観察する方法等が挙げられる。標識細胞とはこの蛍光染色及び/または色素染色された細胞を意味する。
　本発明では細胞シート積層体が必要である。そして、この細胞シートを得るためには温度応答性基材が必要となる。この基材とは、特定の表面を持った細胞培養基材に電子線照射において温度応答性ポリマーをグラフト化させたものである。基材の材質とは、特に限定されるものではないが、細胞付着表面としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレートのいずれか、若しくは２以上を組み合わせたものである。この中で特にポリスチレン、ポリカーボネートは細胞培養用基材で通常使われており好適である。基材の被覆に用いられる温度応答性ポリマーは、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度０℃～８０℃、より好ましくは２０℃～５０℃を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。
　本発明に用いる温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－（若しくはＮ，Ｎ－ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃～５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
　培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１～２．３μｇ／ｃｍ2の範囲が良く、好ましくは１．４～１．９μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは１．５～１．８μｇ／ｃｍ2である。１．１μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ2以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。本発明における培養基材の形態は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートなどが挙げられる。
　本発明の方法において、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
　被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
　さらに温度応答性ポリマーの培養基材への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。
　本発明に用いる細胞シート積層体とは、細胞シートが単独若しくは別の細胞からなるシートと組み合わされた状態で積層化されたものでも良い。その際、２種以上の異なる細胞を利用すると異なる細胞間で相互作用し合い、より高い活性の細胞シートが得られ好ましい。また、その積層する位置、順番、積層回数は特に制約されるものではないが、被覆又は補填される組織に応じ、接着性の強い滑膜由来細胞シートを使用すること等で適宜変えられる。また、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。軟骨細胞は元来栄養供給が満たされた環境でなくても生存する。しかしながら１０回より多くなると積層化した中心部の細胞シートに酸素、栄養分が行き届き難くなり好ましくない。その際には、細胞シート積層体内に血管網を構築させる方法で防ぐことができる。その血管網を構築する方法は特に限定されるものではないが、例えば積層体内にあらかじめ血管内皮細胞を混在させる方法、積層体を製造する際に血管内皮細胞シートを積層させる方法、あるいは細胞シート積層体を生体内に埋入して血管網を構築させる方法等が挙げられる。
　本発明における細胞シート積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、使用される培養細胞移動治具は剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば特に限定されるわけではなく、例えば多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等が挙げられ、積層化作業を行い易くするために柄の付いた治具に多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等を取り付けたものを利用しても良い。
　以上より、本発明における細胞シート積層体とは、温度応答性ポリマーが被覆された細胞培養基材上から剥離され、必要に応じて培養細胞移動治具を用いることで得られた培養細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けておらず、培養時に形成される細胞－基材間の基底膜様蛋白質も酵素による破壊を受けておらず、また、細胞－細胞間のデスモソーム構造が保持され、構造的欠陥が少なく強度の高いものである。
　発明者らは、本発明に利用される細胞シート積層体とは細胞シートが密に積層化されたものであり、それ故、従来の細胞評価システムに利用されていた特殊な培養の足場を作り出していることを見出した。例えば、従来の評価システムにおける培養の足場は細胞以外の物質の存在によりどうしても疎の状態であり、厚さ方向の分析にはどうしても大がかりな解析装置が必要であった。本発明の細胞シート積層体であれば、細胞が高密度に充填したような状態となっており、厚さが薄く、しかも積層体内の環境が組織様であり２次元の解析を厚さ方向に重ねることだけで情報を読み取ることができるようになる。本発明においては、細胞シートの積層化枚数は３層枚以上であれば良く、好ましくは４層以上、さらに好ましくは５層以上が良い。積層数が２層以下であると、細胞シート積層体が組織様の状態と異なり、本発明の積層体として不適当である。
　本発明は、かくして得られた細胞シート積層体内に標的細胞を遊走させその挙動を観察することで評価される。標的細胞の種類は特に限定されるものではなく、評価目的に沿った細胞を適宜採用すれば良い。この中で、遊走性の高い細胞としては筋芽細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、さらに心筋細胞、表皮基底膜細胞等が挙げられるが特に限定さるものではない。また、遊走性が低い細胞としては、線維芽細胞、分化した表皮角化細胞が挙げられるが特に限定さるものではない。
　同様に、さらに本発明で利用される細胞シート積層体とは、積層体内の細胞の種類を変えることで流動性を変えられ、そのことでさまざまな疑似組織を作れることもが特徴の一つである。その際に利用される細胞は特に限定されないが、上述のように流動性の高い細胞としては筋芽細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、さらに心筋細胞、表皮基底膜細胞等が挙げられる。また、流動性の低い細胞としては、線維芽細胞、分化した表皮角化細胞が挙げられるが特に限定さるものではない。流動性の高い細胞に流動性の低い細胞を混合することでさまざまな流動性を有する細胞シート積層体を作製することができる。
　この細胞シート積層体の流動性は本発明の目的に限らず、例えば移植を目的とした細胞シートの指標になり得るものと考えている。例えば、実施例で述べるように、細胞シート積層体の流動性が高ければそれだけ生体側から血管が侵入しやすくなり、それだけ移植した細胞シート積層体が生体に適合する結果となる。また、その他の細胞においても積層体の流動性が高いと侵入しやすいものと期待される。
　本発明でいうところの生物学的指標とは、細胞に関する評価ならば特に限定されるものではないが、例えば細胞の生死、増殖、遊走、分化のいずれがもしくはそれらの２種以上の組み合わせが挙げられる。本発明では、さらにその細胞に関する3次元の情報でも良く、例えば細胞が移動した軌跡、その結果得られた細胞網、管状組織の構築程度等が挙げられるが特に限定されるものではない。本発明によれば、細胞の生物学的指標という高度な情報を簡便な評価システムで得られるようになる。
　本発明においては、以上のシステムに薬剤を作用させても良い。本発明のシステムに薬剤を作用させ標的細胞の挙動を観察すれば、細胞に対する薬剤の効果を知ることができる。その際、使用する薬剤は特に限定されるものではなく、評価したい系に沿って適宜利用していけば良いが、例えばＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ等のサイトカイン類、抗がん剤、分化誘導剤等が挙げられる。本発明は創薬、薬効評価のシステムとしても極めて有用なものと期待される。
　本発明では、細胞シート積層体、標識細胞、２次元解析装置の組み合わせを変えることでさまざまな評価系が構築できる。その具体例は、特に限定されるものではないが、例えば、細胞シート積層体を構成する細胞を筋芽細胞とし、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、蛍光顕微鏡により標識細胞の遊走性を追跡することで血管網構築メカニズムを評価することができる。或いは、細胞シート積層体を構成する細胞を癌細胞、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、薬剤を抗がん剤とすれば、抗がん剤の薬効を評価できるようになる。さらに、細胞シート積層体を構成する細胞を分化細胞、標識細胞を蛍光標識した幹細胞とし、薬剤を分化誘導剤とすれば、幹細胞の分化プログラミング機構を解析することができるようになる。
　本発明の細胞は限定されるものではなく、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。この中で、動物細胞は市販されているものが多く好都合である。動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。
　本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の情報を得ることができるようになる。従来、組織中の細胞の挙動を観察するのは大がかりな解析装置を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなる。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
　血管内皮細胞と筋芽細胞シートの共培養システムを構築した（図１）。このシステムは、「標的細胞」、「充填細胞」、「薬剤」の3つの要素からなり、充填細胞の中を遊走する内皮細胞が標識細胞で、標識細胞の場であるシートの筋芽細胞が充填細胞であり、薬剤添加の刺激により標識細胞の遊走や、充填細胞の挙動を制御することができる。これまでの研究でシートという密な環境でシートの細胞は遊走することが分かっており、これを充填細胞の「流動」と呼ぶ。すなわち標識細胞は動的な足場の中で遊走しており、このシステムは他の細胞に囲まれて細胞間コミュニケーションの影響も受けるin vivoに近いシステムで、3要素を種々変化することによって、他の系においても生体内に模倣した条件での解析が可能となる。そして標識細胞である内皮細胞の遊走および充填細胞であるシート流動を評価するための手法を確立した。図３に示す手順で評価し、内皮細胞がシートの流動より速く遊走するか（Active migration）、シート流動に受動的に遊走するか（Passive migration）を内皮細胞の遊走とシート流動を比較し検討した。またネットワークの定量評価を図４に示す手順で行った。また薬剤として、上皮細胞の増殖因子であるEpidermal growth factor（EGF）を添加し、その効果を検討した。
　（初代細胞培養）
　細胞培養にはCorning社のポリスチレン製培養容器（225 cm2 T-flask）を用いた。筋芽細胞培養には培養面にラミニン（Sigma製）を塗布した。ラミニン塗布面はリン酸緩衝溶液（PBS、Sigma 製）によるラミニンの20倍希釈溶液を培養面25cm2当たり1ml添加し、37oC・5 % CO2存在下での1 h（時間）のインキュベーションによりタンパクを吸着させた後、PBSで洗浄することによって作製した。
　（単層継代培養）
　実験には足場依存性ヒト骨格筋筋芽細胞（Camblex社製）および正常ヒトさいたい静脈内皮細胞（Lonza社製）用い、CO2インキュベータ（MCO-17AI、三洋電機（株）製）内で37oC、5%CO2雰囲気下で培養を行った。筋芽細胞培養には、培地は抗生物質-抗真菌剤 100×（Invitrogen社製）を1 vol%、1M HEPES buffer（Sigma社製）を2 vol%、ウシ胎児由来血清（以後FBSと称する、GIBCO社製）を10vol％でそれぞれ添加したDulbecco's modified Eagles Medium（DMEM、Sigma製）を用いた（以下DMEM（0% FBS）と称する）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma社製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma社製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm2当たりに1 mL滴下し、37oCで3 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度1.0×103 cells/cm2で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は24 h（時間）毎に行った。
　内皮細胞培養には、培地はEGM-2 BulletKit（Lonza製）を用いた（以下EBM-2 と称する）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm2当たりに1 mL滴下し、37oCで5 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1450 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度2.5×103 cells/cm2で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は48 h（時間）毎に行った。
　（筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養）
　細胞培養基材として、ポリスチレン製の35 mm culture dish（Corning製）および温度応答性培養容器（24 穴マルチウェル、CellSeed社製）を用いた。温度応答性培養容器とはポリスチレン面にN-イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合させた培養面であり、３２℃を臨界点として可逆的に表面が疎水性、親水性と変化するため、温度変化により細胞間接着を維持したまま容易に細胞を培養面から剥離させることが可能である。
　筋芽細胞シートの作製は、37℃でのプレインキュベーション24 h（時間）後にコンフルエントとなるように、温度応答性培養容器に2.3×105 cells/cm2の量で筋芽細胞を播種した。24 h（時間）後、20 ℃、5 %CO2雰囲気下で30分インキュベートして剥離させた細胞シートを上部からゼラチンゲルで回収する。これが1層の細胞シートとなり、細胞の剥離・回収を繰り返すことで多層シートの作製を行う。
　シート共培養システムの構築は、内皮細胞を1.0×104 cells/cm2で35 mm culture dishに播種する。このとき培地はEBM-2（2 % FBS）であるが、後に載せる筋芽細胞シートの接着力向上のために、24 h後、FBSの比率を高くした、内皮細胞の増殖に最適な濃度である20% FBS添加のEBM-2に培地を交換する。24 h（時間）後、培地を除去して種々の層数の筋芽細胞シートを載せる。ゼラチンゲルを37℃で溶解して除去し、ゼラチンゲルが溶けた時間を0h（０時間）として共培養を開始した（図２）。
　細胞質染色は、組織の高さを知るために、また筋芽細胞の流動を調べるときにシートを色分けするために、筋芽細胞をシート作製前に細胞質の染色を行う。0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm2当たりに1 mL滴下し、37oCで3 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに無血清培地により懸濁した細胞懸濁液に対して、等量の無血清培地希釈の10μM CellTracker Orange CMTMR （Molecular probes製）（またはCellTracker green CMFDA（Molecular probes製））を加えて、5 mM CellTrakcer Dyeとなるようにする。37 ℃、5 % CO2雰囲気下で15 min（分）静置した後、1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離を行って細胞を回収し、再びDMEM 10% FBSで懸濁を行った後、2.3×105 cells/cm2の量で播種する。
　抗体染色は、筋芽細胞と内皮細胞が混在する組織内で内皮細胞を同定して観察するためにAnti-CD31(Mouse MonoclonalAnti-Human CD31、DAKO社製)による抗体染色を行った。CD31は内皮細胞に存在する分子量100kDの糖タンパクを認識する抗体である。細胞をPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬株式会社製）を加え、一晩4 ℃で静置し固定した。PBSで培養面を2回洗い、PBSで希釈した0.1%Triton X-100を加え、細胞に透過性を付与した。PBSで2回洗浄した後、PBS希釈の0.1 %ウシ血清由来アルブミン（和光純薬株式会社製）に1 h（時間）浸した。その後、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで40倍に希釈したanti-CD31抗体に浸し、4 ℃で一晩静置した。PBSで2回洗い、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで200倍に希釈した二次抗体（Alexa FluorR 488 goat anti-mouse IgG、Molecular Probes製）に室温で1 h（時間）浸した。PBSにて2回洗浄した後、Slow fade（Molecular Probes社製）を1、2滴たらして、カバーガラス（IWAKI社製）をかけて、共焦点顕微鏡（EX-20、OLYNPUS社製）により三次元画像を取得し、細胞観察を行った。
　シート内流動については、上述の細胞質染色方法に示す方法で最下層のシートをCelltracker green CMFDAで緑色に、その他の4層をCelltracker orange CMTMRで赤色に染め、上述（シート共培養システムの構築）の手順で筋芽細胞シートを作製して、FBSコートした35 mm culture dishにシートを載せ、シート培養を行った。
　（細胞挙動の評価手順）
　垂直方向の頻度分布は、共焦点レーザー走査顕微鏡にて得られた三次元画像の垂直方向の頻度分布を求める方法をとった（図３）。まず各色のスライス画像を、目視により決定した閾値によりを二値化して（Step 1）、1枚の画像の緑色の画素数（NG[voxel]）を、緑色と赤色の画素数の和（NG+NR[voxel]）で規格化して高さ方向の分布（RG[-]）を求める（Step 2）。そして各色において最大画素数（NG、max or NR、max[voxel]）で規格化した分布の10%以上の部分を染色組織の存在する部分と定義して、高さ（z[μm]）を算出する（Step 3）。Step 2の分布をStep 3より求めた高さの範囲でさらに規格化して、緑色のvoxelの分布をシート各層あたりの頻度分布（FG[-]）として求めて、内皮細胞及び最下層のシート細胞の分布を作成した（Step 4）。
　血管ネットワークの定量評価は、共焦点レーザー顕微鏡で取得したネットワークの写真をImage ProPlusを用いてネットワークを2次元で画像解析する（図４）。目視にて決定した閾値により二値化して、モフォロジカルフィルタを用いて細線化した画像のネットワークの長さと端点数をカウントして、それぞれのネットワークの比較を行った。
　（筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養）
　種々の層数の筋芽細胞シート内における内皮細胞の挙動変化
内皮細胞をEBM-2培地で48 h（時間）培養した後、Celltracker orangeで染色した筋芽細胞を2.0 x 104 cm2で播種（0層のシートとする）、筋芽細胞シートを1、 2、 5層載せたものをDMEM（10% FBS）で96 h（時間）共培養し、CD31染色を行った。0層の場合、内皮細胞はほとんど見られずネットワークは存在しなかった（図５A）。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。これは内皮細胞の単培養で、培地をEBM-2からDMEMに切り替えて約48 h（時間）後には、内皮細胞は脱離し始める様子を確認しているため（data not shown：データの提示なし）、96 h（時間）において内皮細胞の大半は脱離したためと予測される。1層および2層の筋芽細胞シートを載せた時は、0.層の時と同様内皮細胞の存在箇所が少なく、ネットワーク形成も見られなかった（図５B、C）。この場合も培養面からはがれて、シートの細胞間をすり抜けて脱離したと予測される。筋芽細胞シートを5層積層して内皮細胞の上に載せたものは広い範囲でネットワークを形成した（図５D）。0、1、2層のときよりも内皮細胞の存在箇所が増大したことから、層数が多い方が内皮細胞はシートをすり抜けにくく、シート内にとどまりやすいと考えられ、5層のシートが内皮細胞をとどめ、ネットワークを形成することができると示唆された。
　（EBM-2培養での種々の層数における内皮細胞の挙動変化）
　0、1、5層の筋芽細胞シートを内皮細胞の上に載せてEBM-2で96 h（時間）共培養した結果を図６に示す。DMEMで培養したとき、0、1層では内皮細胞はほとんど存在していなかった（図６A、B）。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。EBM-2は内皮細胞，筋芽細胞共に接着できるが、すべて集塊を形成しておりネットワークは存在しない。一方、5層シートを載せた時は広い範囲でネットワーク形成した（図６C）。これらの結果よりネットワーク形成は培地の種類が問題ではなく、5層シートという3次元組織内での成長がネットワーク形成を促したと考えられる。またEBM-2の方がDMEM（10 % FBS）よりきめ細かなネットワークを形成しており、また凹凸の少ない滑らかな糸状であった。すなわち、ネットワーク形成は培地の種類や培養面への接着が重要なのではなく、5層シートという3次元組織内での成長がネットワーク形成を促したと考えられる。よってシートは内皮細胞のマトリックスの役割をしており、マトリゲルやコラーゲンゲルなどin vitroのマトリックスと同様にネットワーク形成をする働きを持つことが示唆された。マトリックスが細胞シートであることから、他の細胞に囲まれて成長するin vivoに模倣した内皮細胞のネットワーク形成システムを確立できたと考える。内皮細胞を組織内にとどめるためには細胞シートは5層が有効と考えられ、また培地はDMEM（10 % FBS）が使用できることから、ネットワーク形成共培養システムとしてこれを基本条件と定める。
　（5層の筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養の経時変化）
　5層の筋芽細胞シートと内皮細胞をDMEM（10. % FBS）で0 、48 、96 h（時間）培養して共焦点で撮影した写真を図７に示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。図７Aよりゼラチンゲルが溶解してすぐの0hで、すでに内皮細胞同士が結合し始めているのが分かる。これはシート積層手順上、0hの時点で筋芽細胞シートを内皮細胞の上に載せてから、3 h（時間）が経過しており、その間に結合したと考えられる。48 h（時間）では内皮細胞が繊維状のネットワークを作り、96 h（時間）では48 h（時間）の時と異った形態のネットワークを形成していた（図７B、C）。断面図の写真より、シート培養0h（時間）において、内皮細胞は筋芽細胞シートの下に存在する（図７D）。培養48、96 h（時間）では、内皮細胞がシート内部に存在しているものが多いことから、内皮細胞はシート内部を上方向に遊走したと考えられる（図７E、F）。また48、96 h（時間）でシート上部表面には図７Gに示すように集塊形成が見られた。垂直方向の分布より、0 h（時間）では内皮細胞の大部分がシート1層目に存在し、培養時間とともに存在箇所が上部にシフトしていることが分かる（図７D'、E'、F'、G'）。よって、シートの下にあった内皮細胞は細胞同士が結合して、培養時間と共にシート上部にシフトして、3次元のネットワークを形成したと示唆され、また上部まで行き着いた細胞は集塊になったと予想される。
　（シート内流動）
　（筋芽細胞シート内流動の経時変化）
　内皮細胞の環境、場であるシートの流動性を検討するために、最下層のシートをcelltracker green（緑色）で、他の4層をcelltracker orange（赤色）で染めて積層した後、シート培養を行った。図８に共焦点にて撮影した3次元画像、断面図および最下層のシート細胞の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。ゼラチンゲルが溶解した0h（時間）では、最下層とその他のシートがきれいに分かれており、ゼラチンゲルが溶解した時点では最下層のシートの細胞が上方にはほとんど遊走しておらず、構造を維持していることが確認できた（図８A）。また48、96 h（時間）後の写真より、最下層の細胞が上方に遊走していることが分かる（図８B、C）。垂直方向の分布で、0h（時間）では1層目に大部分があった緑色の細胞が、48、96 h（時間）には上方にシフトしていることがグラフでも示され、シートという密な環境で細胞が流動していることが示唆された。
　（内皮細胞の遊走性とシート流動の比較）
　前項より内皮細胞は流動している筋芽細胞シート内で、遊走してネットワーク形成することが分かった。そこで内皮細胞の垂直方向の遊走と筋芽細胞の流動を比較して、内皮細胞がシートの流動より速く遊走しているか（Active migration）、あるいはシートの流動に受動的に遊走しているか（Passive migration）を調べた。内皮細胞とそれとほぼ同位置にある最下層の細胞の垂直方向の分布の比較を行った。0h（時間）では内皮細胞の方がわずかに下位置にあるが、48 h（時間）において内皮細胞の方がより上方向に遊走している様子が見られた（図９A、B。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。）。 よって内皮細胞はシート流動より速く遊走して内皮細胞同士が結合して、結果内皮細胞がネットワーク及び集塊形成していると考えられる。したがって内皮細胞は筋芽細胞より積極的に遊走するActive migrationをしていると考えられる。
　（EGF添加による影響）
　（EGFのネットワーク形成への影響）
　薬剤による影響を検討するためDMEMにEGF（100 ng/mL）を添加した。48 h（時間）ではEGFを添加したものと添加していないものそれぞれがきめ細やかなネットワークを形成しているが、その形態で差は見られない（図１０A、B。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。）。一方、96 h（時間）においてEGF添加したものの方が、よりきめ細やかなネットワークを形成していることが確認できる（図１０C、D）)。
　5層シート内で内皮細胞は3次元のネットワークを形成しているが、内皮細胞はシート内部という高さが限られた中でネットワークを形成していることから、高さを無視しても差支えがなく、2次元で定量評価できると考えられる。画像処理を経て細線化して、ネットワーク長さL（μm/image）と端点数T[tip]を評価して、96 h（時間）の画像に関してプロットしたものが図１１である。EGFを添加した方がネットワーク長さが大きく、端点数が少ない傾向が見られた。よってEGFを添加した方がより内皮細胞同士がつながり、きめ細やかなネットワークを形成していることがこの指標より示された。48 h（時間）の画像に関しては同じの画像処理では、細線化画像が元のネットワークと大きく異なるため、定量評価することができなかった。また、図１２に内皮細胞の断面図の写真及び垂直方向の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。図１２A'、B'、C'、D'より48、 96 h（時間）共にEGFの有無で差はないように思われ、EGFは内皮細胞の遊走に影響を与えないと考えられる。両条件で内皮細胞の遊走速度はほぼ同じで、内皮細胞同士が接触（衝突）する頻度は同じと考えられる。接触後、はなれるものとつながるものがあるが、EGFを添加したものの方がつながる頻度が高くなり、結果きめこまやかなネットワークを形成したのでないかと考えられる。
　（EGFの筋芽細胞シート流動への影響）
　EGF添加がシートの流動に影響を及ぼすかを調べた。以前に単層培養でEGF添加により筋芽細胞の遊走性が増大することが確認されており、シート内でも遊走性が増大することも考えられる。図１３にEGFを添加したときの共焦点にて撮影した3次元画像、断面図および最下層のシート細胞の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。しかし、垂直方向の分布はEGF添加による影響が48、96h（時間）共にないように思われる（図１３A'、B'、C'、D'）。よってEGFはシートの流動性への影響は小さく、内皮細胞のネットワーク形成の促進が、シート流動の増大によって引き起こされたものではないと予測される。本検討においてEGFの添加によって、EGFRが活性化したために発達したネットワークを形成したのではないと予測される。EGFはシート流動にも内皮細胞の垂直方向の遊走にも影響を与えなかったが、図１１でEGF添加のプロットがEGFを添加していないプロットの延長上にあることから、EGFを添加した方が早く細胞同士が接着したと考えられ、その要因として、EGFが何らかの経路で内皮細胞の接着分子に影響したのではないかと予測している。その経路として、EGFが筋芽細胞のサイトカインの分泌に影響を与え、その中でbFGFの発現が増大したとすれば、bFGFは内皮細胞の接着分子であるVE-カドヘリンの発現を増大させることから、結果細胞同士の接着が強くつながる頻度が高くなり、きめこまやかなネットワークを形成したのではないと考えられる。
　実施例１と同様な手法で筋芽細胞シートだけからなる５層の筋芽細胞シート積層体（図１４（Ａ））と筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された５層の細胞シート積層体（図１４（Ｂ））を作製した。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。それぞれの細胞シートへ実施例１と同様な手法でヒト血管内皮細胞を遊走させる評価を行った。結果を図１４に示す。培養５ｈ（時間）後の血管内皮細胞の遊走性の検討から、線維芽細胞が混在することで筋芽細胞シート内の流動性が低下し、結果として血管内皮細胞の遊走性を低下させていることが分かった。すなわち、血管内皮細胞を積極的に細胞シート積層体内へ誘導させるには、積層体内の流動性を高めることが必要であることが考えられる。一方、血管網の形成に関しては、線維芽細胞が混在する筋芽細胞シートの方が密なネットワークが形成されていた。これとは別の検討で、筋芽細胞シートのみからなる積層体と筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された細胞シート積層体のそれぞれのＶＥＧＦ産生量とＨＧＦ産生量とを測定し比較検討した。その結果、筋芽細胞シートのみからなる積層体は筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された細胞シート積層体に比べＶＥＧＦの産生量が高く、ＨＧＦの産生量が低いことが分かった。このことより、ＶＥＧＦは筋芽細胞が産生し、ＨＧＦは線維芽細胞が産生しているものと考えられる。以上より、侵入してきた血管内皮細胞による血管網を十分に発達させるには、積層体内の流動性を下げ、ＶＥＧＦ及びＨＧＦを存在させることが必要と考えられる。
（筋芽細胞の培養状態によるサイトカイン産生特性の影響）
　次に筋芽細胞の培養状態がVEGF産生量に影響するのかどうかを検討した。多層細胞シートはコンフルエントで形成された単層シートが重ねられたものであるため、3次元的にも密なコンフルエントであり、細胞は接触阻害によって増殖性を一時的に失った状態にある。そこで、細胞が密に接触したシート模倣系と見なせる状態と比較的自由に遊走できる状態で、サイトカイン特性を比較した。筋芽細胞をシートと同じ高密度（2.3 x 105 cells/cm2）と低密度（1.0 x 104 cells/cm2）で播種し、培養48 時間における培養培地を取得した。ELISAによってVEGF生成量を測定した。培地採取時の細胞数をカウンティングより求め、細胞あたりのVEGF生成量として評価した。
（実験条件）
細胞：　　ヒト骨格筋筋芽細胞（Np5）
培地：　　DMEM（10% FBS）
培養面：　　8wellポリスチレン培養皿、ラミニンコート-ポリスチレン培養面（筋芽細　　　　　　胞増殖）
培養環境：　37℃、5% CO2 in air
播種密度：　2.3 x 105 cells / cm2（高密度）、1.0 x 105 cells / cm2（低密度）
培養期間：　48h、 168h
培地体積：　2.1 mL（培地深さ 0.2 cm）
培地交換：　24時間毎
ターゲット： VEGF（Vascular endothelial growth factor）
採取試料：　 24時間毎の培養培地（ELISA）
細胞数：　　 トリパンブルー染色法によりカウント
（結果）
　図１５に低密度、高密度培養48時間後の結果を示す。トリパンブルー染色法によりカウントし、細胞密度はそれぞれ、（1.22±0.10） x 104 cells/cm2、（1.89±0.14）x 105 cells/cm2であった。培養48 hで採取した培地から求めた細胞あたりのVEGF生成量を図１６に示す。ELISAで検出された濃度と培地体積2.1 mLから全生成量を求め、上記細胞密度と培養皿面積10.5 cm2より得られた全細胞数で規格化することによって算出した。筋芽細胞5層シートの培養48 時間における生成量についても細胞数で規格化した値を併せて載せた。高密度培養の細胞あたり生成量は、低密度培養の約2倍であり、これは密なコンフルエント状態をとることで筋芽細胞のVEGF生成能が増大していることを示唆している。高密度培養の値は5層シート培養の値に近く、移植材料となるシートをコンフルエント状態の細胞のみで作製することがVEGF分泌能（分泌効率）を上げる点で重要であると考えられる。
　実施例１において血管内皮細胞の培養をEBM-2（含2%FBS）培地で24時間培養し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養していた条件（図１７記載のPrevious protocol（C））を、EBM-2（含2%FBS）培地で24時間培養だけ培養する方法（図１７（A））、或いは初めからEBM-2（含20%FBS）培地として24時間だけ培養する方法（図１７（B））とする以外は実施例1と同様な手法によって筋芽細胞シート中の血管内皮細胞の挙動を検討した。A～Cの各条件で培養した際の血管内皮細胞の培養のようす（各条件のようすを８ヶ所ランダムに撮影）を図１８に示す。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。その結果、培養条件（B）は実施例１で示される培養条件（C）と同様に細かなネットワークを形成することが分かった。
　癌細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（癌細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
　癌細胞として、A549株化癌細胞を利用し、実施例１の方法に従って、癌細胞多層シートを作製した。その際の細胞播種数は5.0x105 cells/cm2とし、24時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有DMEMを使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x104 cells/cm2）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に癌細胞多層シートを接着させ、HUVECの積層化A549細胞シート下における0、12、24時間培養後の挙動について共焦点顕微鏡を用いて実施例１と同様に検討を行った。また、共培養開始直後から24時間後の間に観測点（共培養開始5時間後）を加えた。これは前回観察できなかったネットワーク形成からHUVECのシート組織外遊走までのイベントにおけるネットワークの崩壊とHUVECの遊走を確認することを目的としている。得られた0、5、24時間後における積層化A549細胞シート内におけるHUVECの挙動を図１９に示す。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。積層化A549細胞シート下のHUVECは、細胞シートの転写完了直後（0時間後）においても、すでにネットワーク形成が進んでいることが分かる。また、この時点ではシート状細胞塊の外側へのHUVECの遊走は進んでいないようであった。5時間後の様子をみると、すでにネットワークの崩壊とHUVECの積層化細胞シート外への遊走が始まっており、シート状細胞塊外周付近に存在するHUVECが目立ち始めた。その後ネットワークの崩壊とHUVECの遊走が亢進し、24時間後においては積層化細胞シート内に存在するHUVECはほとんど見られなかった。その結果は、48時間後もほぼ同様であった。また、癌細胞多層シートの外側では多くのHUVECが観察された。血管内皮細胞の積層化細胞シート外への遊走は充填細胞が筋芽細胞の場合でも観察された現象であるが、A549を充填細胞とすると、血管内皮細胞のネットワーク形成からその崩壊、シート外への遊走が非常に早く進んでいた。
　実施例５とは異なる条件で癌細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（癌細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
　図２０に示す通り、実施例５におけるHUVECに癌細胞多層シートを接着した後の培地を10％FBS含有DMEM培地（図２０最上段の写真）から、HUVECの専用培地であるEBM-2（2%FBS含有）としたもの（図２０最下段の写真）、またはさらにFBSを添加したEBM-2（20%FBS含有）（図２０中央の列の写真）としたものを用いてA549細胞シートと共培養すること以外は実施例５に従った。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。その結果、EBM-2（含2%FBS）培地、並びにEBM-2（含20%FBS）培地の双方において、A549細胞シートとの共培養を続けると、HUVECの凝集を維持することができた。
　間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（間葉系幹細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
　脂肪由来間葉系幹細胞を利用し、実施例１の方法に従って、間葉系幹細胞の多層シートを作製した。その際の細胞播種数は4.5x105 cells/cm2とし、48時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有α-MEMを使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x104 cells/cm2）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に積層化間葉系幹細胞シートを接着させ、HUVECの積層化間葉系幹細胞シート下における挙動について蛍光顕微鏡を用いて実施例１と同様な検討を行った。その結果、積層化間葉系幹細胞シート下のHUVECは48時間後には積層化間葉系幹細胞シート最上層へ移動していることが分かった。
　心筋細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（心筋細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
　ラット心筋細胞を利用し、実施例１の方法に従って、心筋細胞の多層シートを作製した。その際の細胞播種数は5.5x105 cells/cm2とし、24時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有M199を使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x104 cells/cm2）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に積層化心筋細胞シートを接着させ、HUVECの積層化心筋細胞シート下における挙動について光学顕微鏡を用いて実施例１と同様な考え方で検討を行った。その結果、積層化心筋細胞シート下のHUVECは96時間後には積層化心筋細胞シート最上層へ移動していることが分かった。
　表皮角化細胞と線維芽細胞の共培養システムを構築した。
（表皮角化細胞シートと線維芽細胞の共培養）
　表皮角化細胞を利用し、3T3細胞をフィーダー細胞とした常法に従って表皮角化細胞の重層化シートを作製した。その際の細胞播種数は4.5x104 cells/cm2とし、14日間培養後に、約３層が積層された重層化表皮角化細胞シートを得ることができた。培地としては、10%FBS含有DMEM培地を使用した。一方、これとは別に線維芽細胞をDMEM培地で24時間培養（播種密度1.0x104 cells/cm2）した。この線維芽細胞上に重層化表皮角化細胞シートを接着させ、線維芽細胞の重層化表皮角化細胞シート下における挙動について蛍光顕微鏡を用いて実施例１と同様な検討を行った。その結果、重層化表皮角化細胞シート下の線維芽細胞は48時間後においても重層化表皮角化細胞シート内へほとんど移動していないことが分かった。
　本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の情報を得ることができるようになる。従来のような高価で大がかりな解析装置を必要とせず、さらに周辺の細胞培養装置と容易に組み合わせられ高度な情報を得ることができるようになる。したがって、本発明は創薬、薬学、医学、生物等の分野における極めて有用な発明である。
　図中における各符号は次の意味を有する。
　NG   ：1枚の画像スライスに占める緑色のvoxelの数       [voxel]
　NR   ：1枚の画像スライスに占める赤色のvoxelの数       [voxel]
　RG   ：1枚の画像スライスに占める緑色のvoxelの割合     [-]
　h    ：撮影した画像スライスの高さ       [μm]
　NG、max     ：画像スライス中の緑色のvoxelの最大値     [-]
　NR、max     ：画像スライス中の赤色のvoxelの最大値     [-]
　NG/ NG、max ：各スライスにおける緑色のvoxelの最大値に対する割合     [-]
　NR/ NR、max ：各スライスにおける赤色のvoxelの最大値に対する割合     [-]
　z    ：シート厚さ  [μm]
　FG   ：各層ごとの緑色のvoxelの頻度      [-]
　l    ：1画像に占める血管ネットワーク長さの合計 [mm/image]
　t    ：血管ネットワーク1 mmあたりの端点数の数  [tip/mm]

Claims (16)

  1. 　２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システム。
  2. 　当該システムに薬剤を負荷させることを特徴とする、請求項１記載の細胞評価システム。
  3. 　細胞シート積層体が、０～８０℃に相転移を有する温度応答性ポリマーを被覆した温度応答性培養皿上で作製された細胞シートが積層化されたものである、請求項１、２のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  4. 　細胞シート積層体が、細胞シートが３層以上積層化されたものである、請求項１～３のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  5. 　細胞シート積層体を構成する細胞が細胞シート積層体内で流動する、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  6. 　細胞シート積層体を構成する細胞が筋芽細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞から選択される少なくとも１つを含むものである、請求項５記載の細胞評価システム。
  7. 　細胞シート積層体を構成する細胞が細胞シート積層体内で流動しない、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  8. 　細胞シート積層体を構成する細胞が線維芽細胞及び表皮角化細胞のいずれかを含むものである、請求項７記載の細胞評価システム。
  9. 　細胞シート積層体を構成する細胞の細胞シート積層体内における流動性が制御された、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  10. 　標的細胞が蛍光標識された細胞である、請求項１～９のいずれか１項記載の細胞評価システム。
  11. 　２次元の解析手法が蛍光顕微鏡である、請求項１０記載の細胞評価システム。
  12. 　請求項１～１１の細胞評価システムを利用し２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞評価方法。
  13. 　当該システムに薬剤を加えることで標的細胞の生物学的指標を追跡することを特徴とする、請求項１２記載の細胞評価方法。
  14. 　当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を筋芽細胞とし、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、蛍光顕微鏡により標識細胞の遊走性を追跡する、組織中への血管網構築メカニズムの評価方法。
  15. 　当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を癌細胞、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、薬剤を抗がん剤とした、抗がん剤薬効評価方法。
  16. 　当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を分化細胞、標識細胞を蛍光標識した幹細胞とし、薬剤を分化誘導剤とした、幹細胞の分化プログラミング機構の評価方法。
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