JP2007259829A - エフォリン及び/又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エフォリン及び/又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
【選択図】なし
Description
〔1〕エフォリン及び/又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤;
〔2〕炎症細胞がT−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、前記〔1〕記載の化学遊走調節剤;
〔3〕エフォリン及び/又はエフが、B群エフォリン及びエフから選択される、前記〔1〕又は〔2〕記載の化学遊走調節剤;
〔4〕インビトロで炎症細胞にエフォリン及び/又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法;
〔5〕炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び/又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法;
〔6〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも2つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び/又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具;
〔7〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも2つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び/又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット;
〔8〕増幅される領域が1つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対;
〔9〕プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項8記載のプライマー対:配列表の配列番号1及び2、配列番号3及び4、配列番号5及び6、配列番号7及び8、配列番号9及び10、配列番号11及び12、配列番号13及び14、配列番号15及び16、配列番号17及び18、配列番号19及び20、配列番号21及び22、配列番号23及び24、配列番号25及び26、配列番号27及び28、配列番号29及び30、配列番号31及び32、配列番号33及び34、配列番号35及び36、配列番号37及び38、配列番号39及び40、配列番号41及び42、配列番号49及び50、配列番号51及び52;
〔10〕前記〔8〕又は〔9〕記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来RNAとを用いてPCR法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び/又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法、
を提供する。
発作歴がある10人のアテローマ性動脈硬化症患者(平均年齢58.2歳、男性)から、国立循環器病センターで頚動脈血管内膜切除術(CEA)により切除された頚動脈を得た。国立循環器病センターの倫理委員会によって確立された基準にしたがってすべての患者からインフォームド・コンセントを得た。
以下の抗体を使用した:モノクローナル抗CD68(クローンKP1)及び抗平滑筋アクチン(SMA、クローン1A4)、DAKO(Kyoto,Japan)から入手;モノクローナル抗CD4(クローン1F6)及び抗CD8(クローン4B11)、Novocastra(Newcastle, UK)から入手。ポリクローナルウサギ抗エフォリン−B1抗体、Santa Cruz(Santa Cruz, CA)から入手。ポリクローナルヤギ抗エフB2抗体及びポリクローナルウサギ抗CXCR4抗体、Sigma(St. Louis, MO)から入手。ビオチン化ブタ抗ヤギIgG抗体、DAKOから入手。Alexa 546−コンジュゲート化抗マウスIgG抗体、Alexa 488−コンジュゲート化抗ウサギIgG抗体及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ヤギIgG抗体、Molecular Probes(Eugene,OR)から入手。
rN及びPlの間の各標的遺伝子の標準化された発現レベルの統計学的な比較は、スタットビュー(StatView) Ver.5.0 ソフトウェア(商品名、SAS Institute Inc, Cary, NC)を用いて対応のあるt−検定(paired Student’s t-test)によって行なった。P<0.05を統計学的に有意であると判定した。
アイソジェン(Isogen)試薬(商品名、Nippon Gene, Tokyo, Japan)を製造業者の指示書どおりに用いて、CEA検体の10対のrN及びPl部分から全RNAを単離した。RNAの濃度を分光光度計で測定し、その質を、サイバー・グリーン色素(Sybr Green dye)(Molecular Probes)で染色した1.2%変性アガロースゲル電気泳動で肉眼で確認した。
10対のCEA検体すべてについて、1μgの全RNAをDNAフリー(DNA-free)(Ambion, Austin, TX)で処理し、ランダムプライマー及びスーパースクリプト(SuperScript)II逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてcDNAに変換した(Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004))。定量的リアルタイムRT−PCRは、ABIプリズム7700配列検出システム(ABI Prism 7700 Sequence Detection System)(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行なった。各標的遺伝子の発現レベルを、GAPDHのそれらに対して標準化した(Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004))。2つのケモカイン受容体、即ちCXCR2及びCXCR4についてのプライマーセット及びTaqManプローブは、コンピュータプログラム「プライマー・エクスプレス(Primer Express)2.0」(PE Applied Biosystems)を用いて以下のように設計した:
フォワードプライマー:5’−TACATGGCTTGATCAGCAAGGA−3’(配列番号43);
リバースプライマー:5’−GCCCTGAAGAAGAGCCAACA−3’ (配列番号44);
TaqManプローブ:5’−TGCCCAAAGACAGCAGGCCTTCCT−3’)(配列番号45);及び
CXCR4
フォワードプライマー:5’−GGTGGTTGTGTTCCAGTTTCAG−3’(配列番号46);
リバースプライマー:5’−ATAATGCAATAGCAGGACAGGATG−3’(配列番号47);
TaqManプローブ:5’−TCATGGTTGGCCTTATCCTGCCTGGTA−3’(配列番号48)。
固定したCEA検体をパラフィン包埋し、厚さ3μmの切片を作製した。調製物の完全性の評価のために、これらの切片を、マウス抗CD68抗体(1:300希釈)と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ共役エンビジョン・システム(Envision system)(PO-Envision, DAKO)及び基質として3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)を用いた間接法により染色した。
単独染色によって種々の形態の細胞においてエフォリン−B1又はエフB2様の免疫反応性が見出されたので、二重免疫組織化学染色を行なってエフォリン−B1又はエフB2を発現する正確な細胞タイプを明らかにした。
健常ヒト成人の末梢血中に循環している静止状態の(resting)単球及びT−リンパ球においてもエフォリン−B1及びエフB2が発現されているかどうかを調べた。単核細胞を、健常成人志願者の全血(200mL)からリンフォプレップ(Lymphoprep)試薬(Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)を用いて分離し、以前記載されたように、対流遠心エルトリエーション(counterflow centrifugal elutriation)(R5E elutriation system, 日立工機、茨城県)に供した(Terui et al., J. Immunol. 156, 1981-1988(1996))。この単球富化(enriched)画分からの細胞を、マウス抗CD68抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 488−コンジュゲート化抗マウスIgG抗体とインキュベートした。これらの細胞を、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI; Molecular Probes)で対染色し、Axiophot2 落斜蛍光(epifluorescence)顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて単球の純度について調べた。
フォワードプライマー:5’−AGCTGCCTGTAGCACAGTTC−3’(配列番号49);
リバースプライマー:5’−GAGCAGGAAGATGACGCAAC−3’配列番号50);
エフB2
フォワードプライマー:5’−GACTCCACTACAGCGACTGC−3’(配列番号51);
リバースプライマー:5’−TTGCGGTAGAAGACACGCAC−3’(配列番号52);及び
GAPDH
フォワードプライマー:5’−ACCACAGTCCATGCCATCAC−3’(配列番号53);
リバースプライマー:5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’(配列番号54)。
PCR反応における鋳型として、THP−1細胞、Jurkat細胞、内皮細胞の各々からRNAを抽出し、クオンティテクト逆転写(QuantiTect Reverse Transcription)キット(QIAGEN、カタログNo.205311)を用いて逆転写酵素を添加して又は添加せずにcDNAを作製した。具体的には、各RNAを、0.5mLのチューブ中で合計14μL(7×gDNA Wipeout Buffer 2.0μL、RNase無含有水とRNA(10pg〜1μg)との合計12μL)の反応液中で42℃で2分間インキュベートした後、氷冷し、DNase処理した。次に、DNase処理後のチューブに反応液のカクテル(5×Quantiscript RT Buffer 4μL、RT Primer Mix 1.0μL、Quantiscript Reverse Transcriptase 1.0μLの合計6μL)を入れて、cDNA合成を行なった。cDNA合成を行なわない逆転写酵素なし(RT(−))にはDEPC水を6μL加え、合計20μLにした。この反応液を42℃で15分間インキュベートした後、95℃で3分間加熱して酵素を不活化した。
ephrin-A1 F及びR(配列番号1及び2)
ephrin-A2 F3及びR3(配列番号3及び4)
ephrin-A3 F2及びR(配列番号5及び6)
ephrin-A4 F及びR(配列番号7及び8)
ephrin-A5 F及びR(配列番号9及び10)
EphA1 F及びR(配列番号11及び12)
EphA4 F及びR(配列番号17及び18)
EphA5 F及びR(配列番号19及び20)
EphA6 F及びR(配列番号21及び22)
Ephrin-B1 F及びR(配列番号27及び28)
EphB4 F及びR(配列番号39及び40);
EphA2 F及びR(配列番号13及び14)
EphA3 F及びR(配列番号15及び16)
EphA7 F及びR(配列番号23及び24)
EphA8 F及びR(配列番号25及び26)
ephrin-B2 F及びR(配列番号29及び30)
ephrin-B3 F及びR(配列番号31及び32)
EphB1 F及びR(配列番号33及び34)
EphB2 F及びR(配列番号35及び36)
EphB3 F及びR(配列番号37及び38)
EphB6 F及びR(配列番号41及び42)
であった(F=フォワード、R=リバース)。
実験の前日に、ヒト単球由来のTHP−1細胞を、4×105個/mL(2.4×106個/dish)の濃度で直径10cmの丸シャーレに播いた。実験までの培養時間は約15時間であった。
Claims (10)
- エフォリン及び/又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
- 炎症細胞がT−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、請求項1記載の化学遊走調節剤。
- エフォリン及び/又はエフが、B群エフォリン及びエフから選択される、請求項1又は2記載の化学遊走調節剤。
- インビトロで炎症細胞にエフォリン及び/又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法。
- 炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び/又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法。
- 炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも2つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び/又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具。
- 炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも2つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び/又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット。
- 増幅される領域が1つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対。
- プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項8記載のプライマー対:配列表の配列番号1及び2、配列番号3及び4、配列番号5及び6、配列番号7及び8、配列番号9及び10、配列番号11及び12、配列番号13及び14、配列番号15及び16、配列番号17及び18、配列番号19及び20、配列番号21及び22、配列番号23及び24、配列番号25及び26、配列番号27及び28、配列番号29及び30、配列番号31及び32、配列番号33及び34、配列番号35及び36、配列番号37及び38、配列番号39及び40、配列番号41及び42、配列番号49及び50、配列番号51及び52。
- 請求項8又は9記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来RNAとを用いてPCR法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び/又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法。
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