WO2016166847A1 - 観察装置 - Google Patents

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WO2016166847A1
WO2016166847A1 PCT/JP2015/061606 JP2015061606W WO2016166847A1 WO 2016166847 A1 WO2016166847 A1 WO 2016166847A1 JP 2015061606 W JP2015061606 W JP 2015061606W WO 2016166847 A1 WO2016166847 A1 WO 2016166847A1
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WO
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bacteria
information
fine particles
observation apparatus
time
Prior art date
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PCT/JP2015/061606
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French (fr)
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豪 桝屋
一成 今井
宗郎 前嶋
賢太郎 大澤
直子 千田
Original Assignee
株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus.
  • Measures of fine particles such as cells in a liquid mainly include a light scattering method for analyzing light scattering and an image imaging method for imaging particles with a microscope.
  • the light scattering method can easily measure the size and number of high-concentration particles.
  • the light scattering method is generally used as a method for examining drug activity against bacteria. For example, the liquid containing bacteria is irradiated with light, the incident light is scattered by the bacteria, and the attenuation of the transmitted light amount is measured. Thereby, the growth state of bacteria is measured.
  • image imaging methods that measure not only the size and number of cells but also the shape of cells by microscopic observation have been actively used.
  • label-free observation methods such as CARS microscopes and OCT that do not use labels such as fluorescent substances have been developed. These observation methods are confocal optical systems, and images out of focus are excluded. Therefore, an image without a defocused image is obtained. Since only the sharp image in focus is obtained, the size and shape of the cell can be quantitatively evaluated from the image. In addition, since this feature results in a tomographic image, a three-dimensional image can be generated by superimposing two-dimensional images on different planes.
  • the CARS microscope is used to observe a minute area in one cell.
  • OCT is used for observation of the shape of a tissue piece such as the thickness of the cornea (Patent Document 1).
  • sensitivity testing devices that test the effects of antibacterial agents on bacteria, that is, the growth of bacteria is suppressed by antibacterial agents.
  • the number of bacteria is counted using a light scattering method.
  • the light scattering method has low sensitivity and requires day and night culture.
  • One way to improve sensitivity is to increase the initial culture concentration of bacteria, but the initial concentration of bacteria is determined by CLSI (the Clinical and Laboratory Standards Institute) at a low concentration of 5 ⁇ 105 CFU / ml. The concentration cannot be changed.
  • an image imaging method as a method for improving sensitivity and shortening the culture time. Observe the growth process of one bacterium by imaging. However, some bacteria have chemotaxis (for example, Escherichia coli). By observing only the bacteria present on one plane of the sample solution, it is necessary to grasp the overall state of the bacteria in the sample solution. I can't. In order to use image imaging for examination of bacteria for drugs, a technique for observing three-dimensional images is required. Then, the microscope observation method which can observe the bacteria in a liquid is proposed (patent document 2).
  • the bacteria When the bacteria have chemotaxis, the bacteria are distributed not only in the bottom of the sample container but also in the liquid. The state is different between the bacteria present on the bottom surface and the bacteria moving in the liquid, and the bacteria present on the bottom surface contain many dead bacteria. Therefore, the state of the whole bacteria in the sample solution cannot be accurately grasped only by observing the bacteria on the bottom surface.
  • the method of observing a 3D shape from a tomographic image such as OCT can only measure the surface shape and the size of the tissue from the tomographic image, and measures information (for example, the number) of bacteria that are scattered in the liquid. I could't. In addition, with the conventional observation method, it was not possible to observe the spatial distribution of bacteria that existed separately in the liquid.
  • the present invention provides a technology that can accurately acquire information on fine particles (cells, bacteria, etc.) that are scattered in a liquid.
  • the present application includes a plurality of means for solving the above-mentioned problems.
  • a confocal optical system for measuring fine particles existing on a focal plane in a sample liquid in a sample container, and the sample liquid A driving mechanism for driving a part of the sample container and the confocal optical system to scan in three dimensions, and controlling the confocal optical system and the driving mechanism, and a plurality of focal planes for a plurality of different times.
  • a control device that acquires information about the fine particles, and the control device provides an observation device that obtains information representing temporal changes in the information about the fine particles at the plurality of focal planes.
  • a confocal optical system for measuring fine particles present on a focal plane in a sample liquid in a sample container, and the sample container and the common liquid in order to scan the sample liquid in three dimensions.
  • a drive mechanism for driving a part of the focus optical system, the confocal optical system and the drive mechanism are controlled, and information on the fine particles at a plurality of focal planes is acquired at least for the first time and the second time.
  • An observation apparatus comprising: a control device; and a display device that displays information related to the fine particles on the plurality of focal planes in a format in which temporal changes between the first time and the second time can be compared. Is provided.
  • 2D XY plane data closest to the bottom of the sample container This is 2D YZ plane data of bacteria with chemotaxis. It is 2D YZ plane data of bacteria without chemotaxis. It is another example of the screen displayed on the display of a computer.
  • the following example relates to a method or apparatus for examining the drug activity of a fine particle from the spatial distribution of the fine particle floating in the liquid containing the drug and the temporal change of the spatial distribution.
  • the fine particles include bacteria, cells and the like.
  • an XYZ rectangular coordinate system is set.
  • a predetermined direction in the horizontal plane is defined as the X direction
  • a direction orthogonal to the X direction in the horizontal plane is defined as the Y direction
  • a direction orthogonal to each of the X direction and the Y direction is defined as the Z direction.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a detection method of the bacteria observation apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 1 shows a general OCT (three-dimensional optical coherence tomography) detection method.
  • the detection method used here is preferably a detection method using a confocal optical system.
  • confocal optical system By using the confocal optical system, a defocused image does not appear in the observation image, and bacteria present on the focal plane can be accurately measured.
  • Other confocal optical systems include CARS microscopes.
  • the sample liquid 101 is held by the sample container 102.
  • the sample solution 101 contains bacteria, nutrients necessary for the bacteria to grow as a solvent, and an antibacterial agent.
  • the bacteria observation apparatus includes a confocal optical system (here, OCT).
  • the bacteria observation apparatus includes a light source 103, a beam splitter 104, an objective lens 105, a mirror 106, and a detector 107.
  • the light source 103 oscillates laser light that is coherence light.
  • the laser light is divided into reflected light and transmitted light by the beam splitter 104.
  • the light reflected by the beam splitter 104 is collected in the sample liquid 101 by the objective lens 105.
  • incident light is reflected at the interface between the solvent and the bacteria surface. Reflected light from the bacteria passes through the beam splitter 104 and is received by the detector 107.
  • the detector 107 is, for example, a photodetector such as a photodiode or a CCD (charge coupled device).
  • the light transmitted from the light source 103 through the beam splitter 104 is reflected by the mirror 106 and then reflected by the beam splitter 104. This light is received by the detector 107 simultaneously with the reflected light reflected from the bacteria. In the case of the light reflected by the object at the focal position, the phase of the light reflected by the mirror 106 and the light reflected by the bacteria in the sample liquid 101 overlaps, and thus the light is amplified. The amplified light is received by the detector 107.
  • the light reflected from other than the bacteria in the sample liquid 101 does not overlap the phase of the light reflected by the mirror 106, the light is received by the detector 107 without being amplified.
  • the intensity of the light reflected at the interface between the solvent of the sample liquid 101 and the bacteria surface the displacement of the refractive index between the solvent and the bacteria surface is converted into the intensity of the light.
  • FIG. 2 is a schematic view of the bacteria observation apparatus of this example.
  • the bacteria observation apparatus includes a pedestal 202, a coherence light source 203, a beam splitter 204, a vertical mirror 205, an objective lens 206, a reference light mirror 207, a detector 208, and a computer (control device) as main components. 209, an objective lens actuator 210, and an XY stage 211.
  • the pedestal 202 has a structure capable of holding the sample container 201 and allowing light to enter from the bottom surface.
  • the coherence light source 203 oscillates laser light that is coherence light.
  • the coherence light source 203, beam splitter 204, objective lens 206, reference light mirror 207, and detector 208 correspond to the light source 103, beam splitter 104, objective lens 105, mirror 106, and detector 107 in FIG.
  • the vertical mirror 205 is a mirror that reflects the light reflected by the beam splitter 204 in the Z direction toward the objective lens 206.
  • the objective lens actuator 210 is an actuator that moves the objective lens 206 in the Z direction, and can scan the focal position of the objective lens 206 in the depth direction of the sample container 201.
  • the XY stage 211 is configured so that the pedestal 202 on which the sample container 201 is placed can be moved in the X direction and the Y direction.
  • the computer 209 includes at least a processor such as a CPU (Central Processing Unit), a storage unit such as a memory, and a storage device such as a hard disk.
  • the computer 209 includes an input device (such as a mouse and a keyboard) that receives input from the user and a display device (such as a display) that displays measurement results.
  • a processor such as a CPU (Central Processing Unit)
  • a storage unit such as a memory
  • a storage device such as a hard disk.
  • the computer 209 includes an input device (such as a mouse and a keyboard) that receives input from the user and a display device (such as a display) that displays measurement results.
  • a display device such as a display
  • a sample container 201 containing a sample solution in which the bacteria to be measured and the antibacterial agent are suspended.
  • the bottom surface of the sample container 201 is desirably thin and smooth.
  • the sample container 201 is fixed to the pedestal 202.
  • Laser light is oscillated from the coherence light source 203.
  • the laser beam is reflected by the beam splitter 204 and reflected by the vertical mirror 205 in the Z direction (vertical direction).
  • the laser light is condensed into the sample liquid in the sample container 201 by the objective lens 206.
  • the laser light is reflected by bacteria in the sample liquid in the sample container 201.
  • the laser light reflected by the bacteria again passes through the objective lens 206, is reflected by the vertical mirror 205, passes through the beam splitter 204, and is received by the detector 208.
  • the light oscillated from the coherence light source 203 and transmitted through the beam splitter 204 is reflected by the reference light mirror 207, reflected by the beam splitter 204, and received by the detector 208.
  • the light reflected by the bacteria and the light reflected by the reference light mirror 207 interfere with each other, whereby the intensity reflecting the relative refractive index of the bacteria is measured by the detector 208.
  • Data measured by the detector 208 (hereinafter referred to as “measurement data”) is transmitted to the computer 209 as digital data. Measurement data and information on the coordinates of the measurement data are stored in a storage device of the computer 209.
  • the objective lens actuator 210 can scan the focal position of the objective lens 206 in the height direction in the sample liquid by moving the objective lens 206 in the Z direction.
  • the XY stage 211 can scan the light collection position by the objective lens 206 in the horizontal direction by moving the base 202 on which the sample container 201 is placed in the X direction and the Y direction. By driving the objective lens actuator 210 and the XY stage 211, a signal from bacteria in the sample liquid is detected as three-dimensional position information.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining various processing units of the computer 109.
  • the computer 109 controls the confocal optical system and the driving mechanism (the objective lens actuator 210 and the XY stage 211), and acquires information about bacteria at a plurality of focal planes at a plurality of different times.
  • the computer 109 obtains information representing a temporal change in information about bacteria from the acquired information.
  • the computer 109 includes a data acquisition unit 301, a data analysis unit 302, a data display processing unit 303, and a control unit 304.
  • the data acquisition unit 301 is a module that acquires measurement data measured by the detector 208.
  • the data acquisition unit 301 converts the measurement data measured by the detector 208 into two-dimensional plane data.
  • the data analysis unit 302 is a module that uses the measurement data acquired by the data acquisition unit 301 as input information and outputs an analysis result of the measurement data.
  • the data analysis unit 302 may convert two-dimensional plane data that is measurement data into image information.
  • the data analysis unit 302 may generate image information on a plurality of focal planes for a plurality of different times.
  • the data analysis unit 302 may analyze the image information and calculate at least one quantitative value of the number of bacteria, the shape of the bacteria, the size of the bacteria, and the proportion of the bacteria in the focal plane.
  • the data analysis unit 302 may calculate the number of bacteria by counting the number of portions of the image information that are equal to or greater than a predetermined luminance value.
  • the shape of the bacteria, the size of the bacteria, and the proportion of the bacteria in the focal plane may also be obtained from the size of the portion of the image information that is equal to or greater than a predetermined luminance value.
  • the ratio of bacteria in the focal plane is calculated for the following reason.
  • Bacteria may vary in size due to individual differences. Therefore, instead of using the number of bacteria as an evaluation value for the amount of bacteria, the area occupied by bacteria in the two-dimensional plane data may be used as the evaluation value.
  • the data analysis unit 302 may perform statistical processing on the calculated quantitative value to calculate information on the spatial distribution of bacteria.
  • the information on the spatial distribution of bacteria is information representing the relationship between the distance from the bottom surface of the sample container and the number of bacteria.
  • the data analysis unit 302 statistically processes quantitative values calculated from a plurality of pieces of image information on a plurality of focal planes, and represents information on the relationship between the spatial distribution information of bacteria and time (for example, the number of bacteria). (Temporal change in the spatial distribution).
  • the data analysis unit 302 may obtain information on the motility of the bacteria from the information on the spatial distribution of the bacteria.
  • the data analysis unit 302 may obtain information related to temporal changes in bacterial motility from information representing the relationship between the spatial distribution of bacteria and time. For example, when the number of bacteria at a position away from the bottom surface of the sample container decreases, it can be determined that the drug has affected the chemotactic bacteria, and the response of the drug to the bacteria can be detected.
  • the data analysis unit 302 may include statistical software that can inspect changes in the state of bacteria from temporal changes in information about bacteria.
  • the data display processing unit 303 is a module that displays the analysis result from the data analysis unit 302 on the display of the computer 109.
  • the data display processing unit 303 displays information on bacteria on a plurality of focal planes on a display in a format in which temporal changes can be compared.
  • the data display processing unit 303 may display the analysis result of the temporal change in the information about the bacteria on the display. For example, the data display processing unit 303 may display the determination result regarding the motility of the bacteria and the information regarding the response of the drug to the bacteria on the display.
  • the control unit 304 is a module that controls each component of the bacteria observation apparatus.
  • the control unit 304 can manage each component of the bacteria observation apparatus to manage the start of measurement and the end of measurement. Further, the control unit 304 can control the driving of the objective lens actuator 210 and the driving of the XY stage 211 when acquiring measurement data.
  • processing unit described above may be realized as a function of a program executed on the computer 109.
  • the processing unit may be realized by storing a program code corresponding to each process in a memory and executing a program code by a processor.
  • a part of the processing unit may be configured by hardware such as a dedicated circuit board.
  • FIG. 4A is a flowchart showing a test method for a bacterial specimen.
  • a specimen which is a bacterium separated and cultured from blood or the like is obtained (401). Since the amount of bacteria is usually small, pre-culture is performed (402).
  • a mixed solution (sample solution) of a drug for examining the response to bacteria and a culture solution is prepared (403).
  • sample solution a mixed solution of a drug for examining the response to bacteria and a culture solution
  • 404 Suspend bacteria in sample solution mixed with drug
  • a control which is a sample solution containing only the culture solution containing no drug is also prepared. Dispense the sample solution containing bacteria into the sample container (405).
  • the sample container is set in the observation apparatus of this embodiment (406). Measurement with an observation device is started (407). Thereafter, measurement data is acquired while performing temperature control and measurement (408). The acquired measurement data is analyzed by the computer 109. A test result as to how the drug has affected the bacteria after the analysis processing is output on the computer 109 (409).
  • FIG. 4B is a flowchart showing the contents of step 408 in FIG. 4A.
  • the data acquisition unit 301 acquires measurement data measured by the detector 208 (401).
  • the control unit 304 drives the XY stage 211 to scan the condensing position of the objective lens 206 on the XY plane.
  • the data acquisition unit 301 acquires two-dimensional plane data for a certain condensing position (focal position).
  • the control unit 304 drives the objective lens actuator 210 to change the condensing position of the objective lens 206 in the Z direction.
  • the control unit 304 drives the XY stage 211 at the changed position in the Z direction, and scans the condensing position of the objective lens 206 on the XY plane. Therefore, the data acquisition unit 301 acquires a plurality of two-dimensional plane data at a plurality of focal planes.
  • the data analysis unit 302 analyzes the two-dimensional plane data acquired by the data acquisition unit 301 (412).
  • the data analysis unit 302 may convert two-dimensional plane data into image information.
  • the data analysis unit 302 may analyze the image information and calculate at least one quantitative value of the number of bacteria, the shape of the bacteria, the size of the bacteria, and the proportion of the bacteria in the focal plane. Good.
  • the data analysis unit 302 may perform statistical processing on the calculated quantitative value to calculate information regarding the spatial distribution of bacteria.
  • the data analysis unit 302 may measure the motility of bacteria from the calculated quantitative value. Further, the data analysis unit 302 may inspect the change in the state of the bacteria from the temporal change in the information about the bacteria.
  • the data analysis unit 302 outputs the analysis result (413).
  • the data display processing unit 303 may display the analysis result from the data analysis unit 302 on the display of the computer 109.
  • the data analysis unit 302 analyzes two-dimensional plane data on a plurality of focal planes for a plurality of different times after the medicine is put into the sample solution.
  • the data analysis unit 302 can obtain information related to the response of the drug to the bacteria from information representing temporal changes in information related to the bacteria. For example, the data analysis unit 302 outputs the analysis result of the measurement data after 1 hour (first time) after putting the medicine and the analysis result of the measurement data after 2 hours (second time).
  • the data display processing unit 303 displays the analysis result of the measurement data at the first time and the analysis result of the measurement data at the second time on the display of the computer 109. can do.
  • the data acquisition unit 301 acquires two-dimensional plane data at a plurality of focal planes before and after the drug is added to the sample solution, and the data analysis unit 302 is information on bacteria before and after the drug is added. You may obtain
  • FIG. 5 is a diagram for explaining a method of observing the inside of the sample liquid.
  • the sample container 501 contains a sample solution 502 that is a mixed solution of a culture solution in which bacteria and a drug (for example, an antibacterial agent) are suspended.
  • a drug for example, an antibacterial agent
  • the XY stage 211 is driven.
  • the XY plane is scanned at a certain Z position, and one two-dimensional plane data 503 is measured.
  • the two-dimensional plane data 503 is measured by the detector 208.
  • the two-dimensional plane data 503 is stored in the storage device of the computer 209.
  • the objective lens 206 is moved in the Z direction by the objective lens actuator 210.
  • a plurality of two-dimensional plane data 503 are measured by moving the focal position in the Z direction at about the depth of field.
  • NA 0.45 with a 20 ⁇ objective lens
  • the lens is moved by 5 ⁇ m in the Z direction in consideration of the depth of field.
  • OCT it is desirable to start measurement by OCT from the position where the reflected light on the surface of the sample container 501 is attenuated.
  • the measurement position of the two-dimensional plane data 503 is separated from the bottom surface of the sample container 501 by 30 ⁇ m or more in the liquid. It is desirable to measure from the position (position away from the bottom surface of the sample container 501 by 30 ⁇ m or more in the Z direction).
  • FIGS. 6A-6C are schematic diagrams of two-dimensional plane data obtained by scanning the sample liquid on the XY plane.
  • white circular images indicate bacteria.
  • FIG. 6A is two-dimensional plane data that is closest to the bottom surface of the sample container 501.
  • FIG. 6B is two-dimensional plane data separated from the bottom surface of the sample container 501 by 50 ⁇ m.
  • FIG. 6C shows two-dimensional plane data that is 100 ⁇ m away from the bottom surface of the sample container 501.
  • FIG. 7 is an example of a screen displayed on the display of the computer 209 by the data display processing unit 303.
  • two-dimensional plane data is acquired at positions separated from the bottom surface of the sample container by 50 ⁇ m, 100 ⁇ m, and 150 ⁇ m.
  • a plurality of two-dimensional plane data on a plurality of focal planes are converted into image information, respectively.
  • the screen includes a first region 601 that displays a group of images at a plurality of Z positions at a first time (1 hour after bacterial suspension), and a second time (2 hours after bacterial suspension). ) And a second region 602 for displaying image groups at a plurality of Z positions.
  • the image group of the first area 601 and the image group of the second area 602 are arranged side by side so that the respective images can be compared.
  • the image information 603 of the two-dimensional plane data and the analysis result 604 of the image information are displayed as a set.
  • the analysis result 604 is the number of bacteria.
  • the screen may include an experiment condition display unit 605 and a measurement condition display unit 606.
  • the number of bacteria existing on a plurality of height planes is displayed.
  • information on the number of bacteria at different times is displayed side by side in a format that allows comparison of changes in the number of bacteria over time. Therefore, the response of the drug to the bacteria over time can be observed.
  • information about bacteria at two different times is displayed, but information about bacteria at three or more different times is displayed on the screen in a format that can be compared. May be.
  • FIGS. 8A and 8B are graphs of the number of bacteria counted from the two-dimensional plane data with respect to the height from the bottom surface of the sample container.
  • the data analysis unit 302 may calculate a change in the number of bacteria with respect to the height of the bottom surface of the sample container from a plurality of two-dimensional plane data at a plurality of Z positions.
  • the graphs in FIGS. 8A and 8B are graphs in which the vertical axis represents the height (Z-direction position) from the bottom surface where the two-dimensional plane data was measured, and the horizontal axis represents the number of bacteria.
  • FIG. 8A is a graph plotting the number of E. coli presenting chemotaxis against the height from the bottom of the sample container. Since Escherichia coli moves, it does not localize on the bottom surface and exists at a position away from the bottom surface of the sample container.
  • FIG. 8B is a graph in which the number of Staphylococcus aureus that does not exhibit chemotaxis is plotted against the height from the bottom of the sample container. Staphylococcus aureus does not exercise. Staphylococcus aureus exists in many locations away from the bottom surface due to the effect of thermal diffusion, but is mainly localized at the bottom surface.
  • the chemotaxis of bacteria can be determined by analyzing the distribution of the number of bacteria in the sample solution in the height direction.
  • the data analysis unit 302 may calculate the number of bacteria with respect to the height from the bottom surface of the sample container, and may output information related to the chemotaxis of the bacteria based on the change in the number of bacteria. As an example, the data analysis unit 302 may output information as illustrated in FIGS. 8A and 8B. Further, the data analysis unit 302 may analyze the graphs as shown in FIGS. 8A and 8B and output the determination result of the presence or absence of bacterial chemotaxis.
  • the data analysis unit 302 may output the determination result of the presence or absence of bacterial chemotaxis from the slopes of the graphs as shown in FIGS. 8A and 8B.
  • the data analysis unit 302 may determine whether there is a certain number of bacteria at a position higher than the Z position that is a certain threshold value, and output a determination result of the presence or absence of bacteria chemotaxis.
  • the data analysis unit 302 may calculate the number of bacteria at a position higher than the Z position that is a certain threshold value, and output it as an evaluation value indicating how much the bacteria have chemotaxis.
  • the data analysis unit 302 may output other information from the graphs as shown in FIGS. 8A and 8B.
  • the data analysis unit 302 may calculate the total bacterial count from the integrated values of the graphs as shown in FIGS. 8A and 8B.
  • FIG. 9 is information representing the relationship between the spatial distribution of bacteria and time. Specifically, FIG. 9 is a graph plotting a temporal change in the distribution of the number of bacteria with respect to the height from the bottom surface of the sample container.
  • the vertical axis is the number of bacteria
  • the horizontal axis is the height from the bottom (position in the Z direction)
  • the depth axis is the incubation time (for example, the elapsed time since the sample solution was prepared) ).
  • the data analysis unit 302 may output information as shown in FIG. If the bottom surface of the sample container is 0 ⁇ m, the number of bacteria at the position of 0 ⁇ m increases with time. On the other hand, the number of bacteria at 200 ⁇ m from the bottom of the sample container decreases with time.
  • the decrease in the number of bacteria at a location 200 ⁇ m from the bottom of the sample container means that the bacteria did not settle naturally due to gravity, but the bacteria in the sample solution that originally moved were affected by the drug (for example, antibacterial agent). Loss of sex indicates that the activity of the bacteria itself has declined.
  • the effect of the antibacterial agent can be examined by analyzing the change over time of the distribution of the number of bacteria in the sample solution in the height direction depending on the culture time. Therefore, the data analysis unit 302 may output the determination result of the response of the drug to the bacteria from the information indicating the relationship between the spatial distribution of bacteria and the time.
  • FIG. 10 is another example of a screen displayed on the computer display by the data display processing unit 303.
  • the data analysis unit 302 calculates the number of bacteria at a plurality of Z positions at a first time (1 hour after bacterial suspension) and a plurality of bacteria at a second time (2 hours after bacterial suspension). The number of bacteria at the Z position may be calculated.
  • the screen shows the analysis result at the first time (1 hour after the suspension of bacteria) and the analysis result at the second time (2 hours after the suspension of bacteria). And a second region 1002 to be displayed.
  • a graph 1003 of the number of bacteria counted from the two-dimensional plane data with respect to the height from the bottom surface of the sample container and a total 1004 of the counted bacteria are displayed as a set.
  • the second area 1002 the same information as that in the first area 1001 is displayed.
  • temporal changes in the number of bacteria present on a plurality of height planes are displayed on the screen in a comparable format. Therefore, the response of the drug to the bacteria over time can be observed.
  • the bacterial observation apparatus includes a confocal optical system for measuring fine particles (bacteria, cells, etc.) present on the focal plane in the sample liquid in the sample container, and a three-dimensional scan in the sample liquid.
  • a drive mechanism (objective lens actuator 210 and XY stage 211) for driving a sample container and a part of the confocal optical system (objective lens) is provided.
  • the measurement result (observation image) by the detector 208 is converted into digital data and transferred to the computer 109.
  • the computer 109 converts the digital data into image information and displays the image information on a display.
  • the computer 109 displays the measurement results at a plurality of different times on the display.
  • the computer 109 performs image processing on the image information to calculate quantitative values such as the number, size, and shape of bacteria. Further, the computer 109 may measure the motility of the bacteria from the quantitative value and inspect the state change of the microparticles from the time change of the motility.
  • the degree of bacterial chemotaxis can be examined by measuring the extent of bacterial distribution in the liquid.
  • the initial concentration of bacteria is set to a low concentration by CLSI.
  • CLSI the concentration of bacteria
  • the conventional observation method only information on one plane can be obtained, and there is a possibility that sufficient information cannot be obtained.
  • the state of the whole bacteria in the liquid can be observed, and a lot of information can be acquired even in a test with a low concentration of bacteria.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a detection method of the bacteria observation apparatus according to the second embodiment.
  • a general OCT detection method is shown.
  • the detection method used is preferably a detection method using a confocal optical system.
  • the sample liquid 1101 is held by the sample container 1102.
  • a sample solution 1101 shown in FIG. 11 contains bacteria, nutrients necessary for the bacteria to grow as a solvent, and an antibacterial agent.
  • the bacteria observation apparatus includes a confocal optical system (here, OCT).
  • the bacteria observation apparatus includes a light source 1103, a beam splitter 1104, an objective lens 1105, a mirror 1106, and a detector 1107.
  • the light source 1103 may be a light source such as a super luminescence diode (SLD) that has a broad spectrum and low coherence and high luminance.
  • SLD super luminescence diode
  • Light emitted from the light source 1103 is divided into reflected light and transmitted light by the beam splitter 1104.
  • the light reflected by the beam splitter 1104 is collected in the sample liquid 1101 by the objective lens 1105.
  • the detector 1107 is, for example, a photodetector such as a photodiode or a CCD (charge coupled device).
  • the light transmitted from the light source 1103 through the beam splitter 1104 is reflected by the mirror 1106 and then reflected by the beam splitter 1104. This light is received by the detector 1107 simultaneously with the reflected light reflected from the bacteria. In the case of the light reflected by the object at the focal position, the light is amplified because the phase of the light reflected by the mirror 1106 and the light reflected by the bacteria in the sample liquid 1101 overlap. The amplified light is received by the detector 1107.
  • the light reflected from other than the bacteria in the sample liquid 1101 does not overlap the phase of the light reflected by the mirror 1106, the light is received by the detector 1107 without being amplified. Further, regarding the intensity of light reflected at the boundary surface between the solvent of the sample liquid 1101 and the bacteria surface, the refractive index displacement between the solvent and the bacteria surface is converted into the intensity of light.
  • the intensity of light reflected at the boundary surface between the solvent of the sample liquid 1101 and the bacteria surface is converted into the intensity of light.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of the bacteria observation device of this example.
  • the bacterial observation apparatus includes, as main components, a pedestal 1202, an SLD light source 1203, a beam splitter 1204, a vertical mirror 1205, an objective lens 1206, a reference light mirror 1207, a detector 1208, a computer 1209, A mirror actuator 1210 and an XY stage 1211 are provided.
  • the pedestal 1202 can hold the sample container 1201 and has a structure that allows light to enter from the bottom surface.
  • the SLD light source 1203, beam splitter 1204, objective lens 1206, reference light mirror 1207, and detector 1208 correspond to the light source 1103, beam splitter 1104, objective lens 1105, mirror 1106, and detector 1107 in FIG. 11, respectively.
  • the vertical mirror 1205 is a mirror that reflects the light reflected by the beam splitter 1204 toward the objective lens 1206 in the Z direction.
  • the mirror actuator 1210 is an actuator that moves the reference light mirror 1207, and is configured to displace the optical path length.
  • the computer 1209 has the same configuration as the computer 209 in FIG. That is, the computer 1209 includes the processing units illustrated in FIG.
  • the bottom surface of the sample container 1201 is desirably thin and smooth.
  • the sample container 1201 is fixed to the pedestal 1202.
  • Low coherent light is emitted from the SLD light source 1203.
  • Light from the SLD light source 1203 is reflected by the beam splitter 1204 and reflected by the vertical mirror 1205 in the Z direction (vertical direction).
  • the light reflected by the beam splitter 1204 and reflected by the vertical mirror 1205 is condensed into the sample liquid in the sample container 1201 by the objective lens 1206.
  • the light is reflected by bacteria in the sample solution.
  • the light reflected by the bacteria again passes through the objective lens 1206, is reflected by the vertical mirror 1205, passes through the beam splitter 1204, and is received by the detector 1208.
  • the light emitted from the SLD light source 1203 and transmitted through the beam splitter 1204 is reflected by the reference light mirror 1207, reflected by the beam splitter 1204, and received by the detector 1208.
  • the light reflected by the bacteria and the light reflected by the reference light mirror 1207 interfere with each other, whereby the intensity reflecting the relative refractive index of the bacteria is measured by the detector 1208.
  • Data measured by the detector 1208 (hereinafter “measurement data”) is transmitted to the computer 1209 as digital data.
  • the measurement data and information on the coordinates of the measurement data are stored in the storage device of the computer 1209.
  • the mirror actuator 1210 is driven when scanning a position in phase in the sample solution in the height direction.
  • the XY stage 1211 is driven.
  • the XY stage 1211 can scan the light collection position by the objective lens 1206 in the horizontal direction by moving the pedestal 1202 on which the sample container 1201 is placed in the X direction and the Y direction.
  • a signal from bacteria in the sample liquid can be detected as three-dimensional position information.
  • test Method and Result Output The flowchart of the test method for the bacterial specimen of this example is the same as the example shown in FIGS. 4A and 4B. Therefore, the description is omitted.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining a method of observing the inside of the sample liquid.
  • a sample container 1301 contains a sample solution 1302 that is a mixed solution of a culture solution in which bacteria and a drug (for example, an antibacterial agent) are suspended.
  • a drug for example, an antibacterial agent
  • the XY plane is scanned at a certain Z position, and one two-dimensional XY plane data 1303 is measured.
  • the two-dimensional XY plane data 1303 is measured by the detector 2108.
  • the two-dimensional XY plane data 1303 is stored in the storage device of the computer 1209.
  • the inside of the sample liquid 1302 may be measured from the bottom surface of the sample container 1301.
  • two-dimensional XY plane data 1303 at a position 50 ⁇ m away from the bottom surface of the sample container 1301 is acquired.
  • the XY stage 1211 is driven to scan only in the Y direction, and this scanning is performed at a plurality of Z positions by driving the mirror actuator 1210. Thereby, the YZ plane is scanned, and one two-dimensional YZ plane data 1304 is measured.
  • the two-dimensional YZ plane data 1304 is stored in the storage device of the computer 1209.
  • FIGS. 14A to 14C are schematic diagrams of two-dimensional plane data obtained by scanning the sample liquid on the XY plane or the YZ plane.
  • white circular images indicate bacteria.
  • FIG. 14A shows the two-dimensional XY plane data closest to the bottom surface of the sample container 1301.
  • FIG. 14B is two-dimensional YZ plane data of a chemotactic bacterium.
  • FIG. 14C is two-dimensional YZ plane data of bacteria without chemotaxis.
  • FIG. 15 is an example of a screen displayed on the computer display by the data display processing unit 303.
  • the screen shows a horizontal plane image and a depth plane image at a first time (1 hour after bacterial suspension) and a horizontal direction at a second time (2 hours after bacterial suspension).
  • a plane image and a depth plane image are displayed.
  • two-dimensional XY plane data at a position 50 ⁇ m away from the bottom surface of the sample container 1301 and two-dimensional YZ plane data at a certain X position are acquired. Each two-dimensional plane data is converted into image information.
  • the screen includes a first area 1501 displaying 2D XY plane data and 2D YZ plane data at a first time (one hour after bacterial suspension), and a second time (from bacterial suspension).
  • the image group in the first area 1501 and the image group in the second area 1502 are arranged side by side so that the respective images can be compared. Further, in the first area 1501, the image information 1503 of the two-dimensional YZ plane data and the analysis result 1504 of the image information are displayed as a set.
  • the image information 1505 of the two-dimensional XY plane data and the analysis result 1506 of the image information are displayed so as to form a set.
  • the analysis results 1504 and 1506 are the numbers of bacteria.
  • the second area 1502 the same information as that in the first area 1501 is displayed. The number of bacteria present in different planes is displayed on the screen of this embodiment.
  • the data analysis unit 302 may obtain the information described with reference to FIGS. 8A, 8B, and 9.
  • the data analysis unit 302 may calculate the information shown in FIGS. 8A and 8B from the two-dimensional YZ plane data.
  • the data analysis unit 302 may obtain the information described with reference to FIG. 9 from the temporal change of the two-dimensional YZ plane data.
  • the data analysis unit 302 may determine the motility (motility) of bacteria from the two-dimensional XY plane data and the two-dimensional YZ plane data.
  • the bacterial observation apparatus includes a confocal optical system for measuring fine particles (bacteria, cells, etc.) present on the focal plane in the sample liquid in the sample container, and a three-dimensional scan in the sample liquid.
  • a driving mechanism mirror actuator 1210 and XY stage 1211 for driving the sample container and a part of the confocal optical system (reference light mirror) is provided.
  • the measurement result (observation image) by the detector 1208 is converted into digital data and transferred to the computer 1209.
  • the computer 1209 converts the digital data into image information and displays it on the display.
  • the computer 1209 displays the measurement results on a plurality of different planes on the display.
  • the computer 1209 displays the measurement results on a plurality of different planes on a display at a plurality of different time points.
  • the exact number and shape of the fine particles that cannot be obtained by observing only the bottom surface of the sample container can be quantified.
  • the motility of the fine particles can be measured from the quantitative values of the number, size, and shape of the fine particles, and the change in the state of the fine particles can be inspected from the time change of the motility.
  • the total number of bacteria in the depth direction when the number of bacteria at the initial stage of culture is low and the bacterial density is low is counted, and the depth direction after a certain time has passed The total number of bacteria can be counted.
  • temporal changes in the number of bacteria having a high SN can be monitored, and the effect of the antibacterial agent can be confirmed quickly.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the above embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment.
  • the structure of another Example can also be added to the structure of a certain Example.
  • another configuration can be added, deleted, or replaced.
  • the data analysis unit 302 may determine the shape of bacteria from the distribution of bacteria in the liquid in the direction in which gravity is applied (for example, the Z direction).
  • the data analysis unit 302 may calculate the sedimentation rate of bacteria from the distribution of bacteria in the liquid in the Z direction, and determine the shape of the bacteria based on the calculated sedimentation rate.
  • the Stokes law can be used as an example of the relationship between the settling velocity and the particle size.
  • the inspection of bacteria is mainly described, but the above-described embodiment can be applied to the inspection of other fine particles.
  • this embodiment can be applied as an apparatus for determining the shape of fine particles. Conventionally, when determining the particle shape based on the sedimentation speed, a centrifuge was used, but by using the above embodiment, the particle shape was determined based on the sedimentation speed without using a centrifuge. can do.
  • the various processes in the computers 209 and 1209 described above can also be realized by software program codes that realize these functions.
  • a storage medium in which the program code is recorded is provided to the system or apparatus, and the computer (or CPU or MPU) of the system or apparatus reads the program code stored in the storage medium.
  • the program code itself read from the storage medium realizes the functions of the above-described embodiments, and the program code itself and the storage medium storing it constitute the present invention.
  • a storage medium for supplying such program code for example, a flexible disk, CD-ROM, DVD-ROM, hard disk, optical disk, magneto-optical disk, CD-R, magnetic tape, nonvolatile memory card, ROM Etc. are used.
  • control lines and information lines indicate what is considered necessary for the explanation, and not all the control lines and information lines on the product are necessarily shown. All the components may be connected to each other.
  • Data display processing section 304 ... Control unit 1101... Sample solution 1102... Sample container 1103... Light source 1104 Beam splitter 1105... Objective lens 1106... Mirror 1107... Detector 1201... Sample container 1202... pedestal 1203... SLD light source 1204... Beam splitter 1205... Vertical mirror 1206... Objective lens 1207... Reference beam mirror 1208... Detector 1209 Computer 1210... Mirror actuator 1211... XY stage

Abstract

観察装置は、サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子を測定する共焦点光学系と、前記サンプル液中を3次元に走査するために前記サンプル容器及び前記共焦点光学系の一部を駆動させる駆動機構と、前記共焦点光学系及び前記駆動機構を制御し、複数の異なる時間に関して複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を取得する制御装置と、を備え、前記制御装置は、前記複数の焦点面での前記微粒子に関する情報の時間的な変化を表す情報を求める。

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関する。
　液体中の細胞などの微粒子を測定する方法には、主に光の散乱を解析する光散乱法と、粒子を顕微鏡などで撮像する画像イメージング法がある。光散乱法は、高濃度の粒子の大きさや個数を簡便に測定できる。光散乱法は、細菌に対する薬剤活性を検査する手法として、一般に用いられている。例えば、細菌が含まれている液体に光を照射し、細菌によって入射光が散乱され、透過した光量の減衰を測定する。これにより、細菌の増殖状態を計測する。また、顕微鏡観察で細胞の大きさや個数だけではなく、細胞の形状まで測定する画像イメージング法が近年盛んに用いられている。
　細胞の状態を画像イメージングにより観察する方法として、光学顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、CARS（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）顕微鏡、OCT（3次元光干渉断層計）などが知られている。最も一般的で簡便な方法は光学顕微鏡である。しかし、細胞は透明であり、細胞の形状を認識することが困難な場合がある。蛍光顕微鏡は細胞に蛍光物質を用いることで、通常の光学顕微鏡よりも高感度に細胞を認識できる。蛍光顕微鏡は細胞を蛍光物質で染色する必要があるため、観察対象である細胞のありのままを観察できない場合がある。また、蛍光物質として導入した分子やタンパク質が生体分子の活動に影響を与えるおそれもある。薬剤活性を検査する上では、細胞のありのままの状態を観察する必要がある。
　そのために、蛍光物質などの標識を用いないCARS顕微鏡やOCTなどの無標識での観察法が開発されている。また、これらの観察方法は共焦点光学系であり、焦点から外れた像は排除される。したがって、デフォーカスした像が無い画像が得られる。焦点が合ったシャープな像のみであるため、画像から細胞の大きさや形状を定量評価することが可能となる。また、この特徴から断層撮影した画像となるため、異なる平面の2次元画像を重ね合わせることにより、3次元イメージを生成することができる。CARS顕微鏡は、1細胞内の微小な領域の観察に用いられている。また、OCTは、角膜の厚みなどの組織片の形状の観察に用いられている（特許文献１）。
　細胞に対する薬剤活性を検査するためには、薬剤を細胞に導入後、細胞の位置などの変化を時間的に観察することが必要になる。また、細胞をありのままの状態で観察することを考慮すれば、細胞を、限定された空間に閉じ込めることはできない。したがって、3次元イメージを観察する技術が必要とされている。
　細菌に関して、抗菌剤の細菌への効果、つまり抗菌剤により細菌の増殖が抑制されることを検査する装置（感受性検査装置）が存在する。例えば、感受性検査装置では、光散乱法を用いて、細菌の数を計数する。しかし、光散乱法は感度が低く、一昼夜の培養が必要になる。感度を向上させる方法として、細菌の培養初期濃度を上げる方法が考えられるが、細菌の初期濃度はCLSI（the Clinical and Laboratory Standards Institute）により、5×105CFU/mlという低濃度に定められおり、細菌濃度を変更することはできない。
　その他に、感度を向上させ、かつ培養時間を短縮する方法として、画像イメージング法がある。撮像によって1細菌の増殖過程を観察する。しかし、細菌の中には走性を有するもの（例えば、大腸菌）があり、サンプル溶液のある1平面に存在する細菌のみを観察するだけでは、サンプル溶液中の細菌の全体の状態を把握することはできない。画像イメージングを薬剤の細菌に対する検査に用いるためには、3次元イメージを観察する技術が必要となる。そこで、液体中の細菌も観察できる顕微鏡観察法が提案されている（特許文献２）。
　細菌が走性を有している場合、細菌は、サンプル容器底面だけでなく、液体中にも分布する。底面に存在する細菌と液体中を運動している細菌との間では、状態が異なり、底面に存在する細菌は多くの死菌を含んでいる。よって、底面上の細菌を観察だけでは、サンプル溶液内全体の細菌の状態を正確に捉えられない。
特開２０１０－２６８９１６号公報 特表２０１３－５１３０８７号公報
　OCTなどによる断層画像から3次元形状を観察する方法は、表面形状や断層像からの組織の大きさなどを計測できるだけであり、液体中でばらばらに存在する細菌に関する情報（例えば、個数）を測定することはできなかった。また、従来の観察方法では、液体中でばらばらに存在する細菌の空間分布を観察することができなかった。
　また、液体中に焦点面を形成させる光学顕微鏡を用いると液体中の細菌分布を計測することができるが、光学顕微鏡は共焦点光学系ではないので、観察画像にはデフォーカスした像が写りこむ。したがって、焦点面に存在する細菌の情報を精度よく測定することができなかった。
　そこで、本発明は、液体中にばらばらに存在する微粒子（細胞、細菌など）の情報を精度よく取得できる技術を提供する。
　例えば、上記課題を解決するために、特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子を測定する共焦点光学系と、前記サンプル液中を3次元に走査するために前記サンプル容器及び前記共焦点光学系の一部を駆動させる駆動機構と、前記共焦点光学系及び前記駆動機構を制御し、複数の異なる時間に関して複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を取得する制御装置と、を備え、前記制御装置は、前記複数の焦点面での前記微粒子に関する情報の時間的な変化を表す情報を求める、観察装置が提供される。
　また、他の例によれば、サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子を測定する共焦点光学系と、前記サンプル液中を3次元に走査するために前記サンプル容器及び前記共焦点光学系の一部を駆動させる駆動機構と、前記共焦点光学系及び前記駆動機構を制御し、少なくとも第１の時間及び第２の時間に関して複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を取得する制御装置と、前記複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を、前記第１の時間及び前記第２の時間の間の時間的な変化が比較できる形式で表示する表示装置と、を備える観察装置が提供される。
　本発明によれば、液体中にばらばらに存在する微粒子（細胞、細菌など）の情報を精度よく取得できる。本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
第１実施例に係る観察装置の検出法を示す模式図である。 第１実施例に係る観察装置のシステム全体を示した模式図である。 コンピュータの各種処理部を説明する図である。 細菌検体の検査方法を示したフローチャートである。 図４Ａの測定データ出力のステップの内容を示したフローチャートである。 サンプル液中を観察する方法を説明する図である。 サンプル容器の底面に最も近い2次元平面データである。 サンプル容器の底面から50μm離れた2次元平面データである。 サンプル容器の底面から100μm離れた2次元平面データである。 コンピュータのディスプレイに表示される画面の一例である。 サンプル容器の底面からの高さに対する、2次元平面データから計数した細菌数のグラフである。 サンプル容器の底面からの高さに対する、2次元平面データから計数した細菌数のグラフである。 サンプル容器の底面からの高さに対する細菌数の分布の経時変化をプロットしたグラフである。 コンピュータのディスプレイに表示される画面の別の例である。 第２実施例に係る観察装置の検出法を示す模式図である。 第２実施例に係る観察装置のシステム全体を示した模式図である。 サンプル液中を観察する方法を説明する図である。 サンプル容器の底面に最も近い2次元XY平面データである。 走性のある細菌の2次元YZ平面データである。 走性のない細菌の2次元YZ平面データである。 コンピュータのディスプレイに表示される画面の別の例である。
　以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
　以下の実施例は、薬剤が含まれた液体中を浮遊する微粒子の空間分布及びその空間分布の時間変化から、微粒子の薬剤活性を検査する手法又は装置に関する。ここで、微粒子とは、細菌、細胞などを含む。各実施例について、（１）検出法の概略、（２）観察装置の測定方法の概略、（３）検査方法と結果出力を説明する。
　以下の説明においては、XYZ直交座標系を設定する。水平面内の所定方向をX方向、水平面内においてX方向と直交する方向をY方向、X方向及びY方向のそれぞれに直交する方向（すなわち鉛直方向）をZ方向とする。
［第１実施例］
１．検出法の概略
　図１は、第１実施例に係る細菌観察装置の検出法を示す模式図である。図１は、一般的なOCT（3次元光干渉断層計）検出法を示す。ここで用いる検出法は共焦点光学系を用いた検出法が望ましい。共焦点光学系を用いることにより、観察像にデフォーカスした像が写りことがなく、焦点面に存在する細菌を正確に測定することができる。なお、他の共焦点光学系としては、CARS顕微鏡などが挙げられる。
　サンプル液101は、サンプル容器102によって保持される。サンプル液101は、細菌と、溶媒として細菌が増殖するのに必要な栄養素と、抗菌剤とを含む。細菌観察装置は、共焦点光学系（ここでは、OCT）を備える。細菌観察装置は、光源103と、ビームスプリッタ104と、対物レンズ105と、ミラー106と、検出器107とを備える。
　光源103は、コヒーレンス光であるレーザ光を発振する。レーザ光は、ビームスプリッタ104によって、反射する光と透過する光に分けられる。ビームスプリッタ104によって反射した光は、対物レンズ105によりサンプル液101中に集光される。集光された位置に細菌が存在する場合、溶媒と細菌表面との境界面で入射光が反射される。細菌からの反射光は、ビームスプリッタ104を透過し、検出器107に受光される。検出器107は、例えば、フォトダイオード、CCD（charge coupled device）などの光検出器である。
　光源103からビームスプリッタ104を透過した光は、ミラー106で反射され、その後、ビームスプリッタ104で反射される。この光は、細菌からの反射された反射光と同時に検出器107に受光される。焦点位置にある物体により反射された光の場合、ミラー106で反射された光とサンプル液101中の細菌で反射された光の位相が重なるため、光が増幅される。増幅された光は、検出器107によって受光される。
　サンプル液101中の細菌以外で反射された光はミラー106で反射された光と位相が重ならないため、光は増幅されることなく検出器107によって受光される。サンプル液101の溶媒と細菌表面との境界面で反射された光の強度に関しては、その溶媒と細菌表面の屈折率の変位が光の強度に変換される。光の強度を検出器107で測定することにより、対物レンズ105の焦点位置にある細菌の存在の有無の情報が得られる。また、細菌が存在した場合、細菌の形状及び屈折率の変位の情報が得られる。対物レンズ105をサンプル液101の深さ方向に走査することにより、サンプル液101内の深さ方向の細菌の状態を計測することができる。
２．観察装置の測定方法の概略
　図２は、本実施例の細菌観察装置の概略図を示す。細菌観察装置は、主要な構成要素として、台座202と、コヒーレンス光源203と、ビームスプリッタ204と、鉛直ミラー205と、対物レンズ206と、参照光ミラー207と、検出器208と、コンピュータ（制御装置）209と、対物レンズアクチュエータ210と、XYステージ211とを備える。
　台座202は、サンプル容器201を保持することができ、底面から光が入射できる構造を有する。コヒーレンス光源203は、コヒーレンス光であるレーザ光を発振する。コヒーレンス光源203、ビームスプリッタ204、対物レンズ206、参照光ミラー207、及び検出器208は、それぞれ、図１の光源103、ビームスプリッタ104、対物レンズ105、ミラー106、検出器107に対応する。鉛直ミラー205は、ビームスプリッタ204で反射した光を、対物レンズ206に向かってZ方向に反射させるミラーである。対物レンズアクチュエータ210は、対物レンズ206をZ方向に移動させるアクチュエータであり、対物レンズ206の焦点位置をサンプル容器201の深さ方向に走査することができる。XYステージ211は、サンプル容器201を載せた台座202をX方向及びY方向に移動できるように構成される。
　コンピュータ209は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などのプロセッサと、メモリなどの記憶部と、ハードディスクなどの記憶装置を少なくとも備える。また、コンピュータ209は、ユーザからの入力を受け付ける入力装置（マウス、キーボードなど）と、測定結果を表示する表示装置（ディスプレイなど）とを備える。
　測定する細菌と抗菌剤を懸濁したサンプル液が入ったサンプル容器201を準備する。サンプル容器201の底面は薄く、平滑であることが望ましい。サンプル容器201を台座202に固定する。コヒーレンス光源203からレーザ光が発振される。レーザ光は、ビームスプリッタ204で反射され、鉛直ミラー205でZ方向（鉛直方向）に反射される。レーザ光は、対物レンズ206によってサンプル容器201のサンプル液中に集光される。レーザ光は、サンプル容器201のサンプル液中の細菌により反射される。細菌により反射されたレーザ光は、再び対物レンズ206を通り、鉛直ミラー205で反射され、ビームスプリッタ204を透過し、検出器208に受光される。
　コヒーレンス光源203から発振され、ビームスプリッタ204を透過した光は、参照光ミラー207で反射され、ビームスプリッタ204で反射され、検出器208に受光される。細菌により反射された光と参照光ミラー207により反射された光とが干渉し、これにより、細菌の相対屈折率を反映した強度が検出器208によって測定される。検出器208で測定されたデータ（以下、「測定データ」）は、デジタルデータとして、コンピュータ209に送信される。測定データと、測定データの座標の情報は、コンピュータ209の記憶装置に保存される。
　対物レンズアクチュエータ210は、対物レンズ206をZ方向に移動させることにより、サンプル液中の高さ方向に対物レンズ206の焦点位置を走査することができる。XYステージ211は、サンプル容器201を載せた台座202をX方向及びY方向に移動させることにより、対物レンズ206による集光位置を水平方向に走査することができる。対物レンズアクチュエータ210とXYステージ211を駆動させることによって、サンプル液中の細菌からの信号が、立体的な位置情報として検出される。
　図３は、コンピュータ109の各種処理部を説明する図である。コンピュータ109は、共焦点光学系及び駆動機構（対物レンズアクチュエータ210とXYステージ211）を制御し、複数の異なる時間に関して複数の焦点面での細菌に関する情報を取得する。また、コンピュータ109は、取得した情報から、細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報を求める。この機能を実現するため、コンピュータ109は、データ取得部301と、データ解析部302と、データ表示処理部303と、制御部304とを備える。
　データ取得部301は、検出器208で測定された測定データを取得するモジュールである。データ取得部301は、例えば、検出器208で測定された測定データを2次元平面データにする。
　また、データ解析部302は、データ取得部301で取得された測定データを入力情報とし、測定データの解析結果を出力するモジュールである。例えば、データ解析部302は、測定データである2次元平面データを画像情報に変換してもよい。データ解析部302は、複数の異なる時間に関して、複数の焦点面での画像情報を生成してもよい。
　また、データ解析部302は、画像情報を解析し、細菌の数、細菌の形状、細菌の大きさ、焦点面における細菌が占める割合の少なくとも１つの定量値を算出してもよい。一例として、データ解析部302は、画像情報の所定の輝度値以上の部分の数を計数し、細菌の数を求めてもよい。細菌の形状、細菌の大きさ、及び、焦点面における細菌が占める割合についても、画像情報の所定の輝度値以上の部分のサイズから求めてもよい。
　なお、焦点面における細菌が占める割合を算出するのは、以下の理由からである。細菌は、細胞分裂をした後、連鎖したままの状態を維持する種類も存在する。また、細菌は、個体差で大きさが異なる場合もある。したがって、細菌の数を用いて細菌量の評価値とするのではなく、2次元平面データにおける細菌が占める面積を評価値としてもよい。
　また、データ解析部302は、算出された定量値を統計処理し、細菌の空間分布に関する情報を算出してもよい。一例として、細菌の空間的分布の情報は、サンプル容器の底面からの距離と、細菌の数との関係を表す情報である。また、データ解析部302は、複数の焦点面での複数の画像情報から算出された定量値を統計処理し、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報（例えば、細菌の数の空間的な分布の時間的な変化）を求めてもよい。
　また、データ解析部302は、細菌の空間的分布の情報から、細菌の運動性に関する情報を求めてもよい。また、データ解析部302は、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報から、細菌の運動性の時間的変化に関する情報を求めてもよい。例えば、サンプル容器の底面から離れた位置での細菌の数が減少した場合、走性を有する細菌に薬剤が影響したと判断でき、薬剤の細菌への応答を検出することができる。
　上記のように、データ解析部302は、細菌に関する情報の時間的な変化から、細菌の状態変化を検査できる統計ソフトウェアを備えてもよい。
　データ表示処理部303は、データ解析部302からの解析結果をコンピュータ109のディスプレイに表示するモジュールである。例えば、データ表示処理部303は、複数の焦点面での細菌に関する情報を、時間的な変化が比較できる形式でディスプレイ上に表示する。
　また、データ表示処理部303は、細菌に関する情報の時間的な変化の解析結果をディスプレイ上に表示してもよい。例えば、データ表示処理部303は、細菌の運動性に関する判定結果、及び薬剤の細菌への応答に関する情報をディスプレイ上に表示してもよい。
　制御部304は、細菌観察装置の各構成要素を制御するモジュールである。例えば、制御部304は、細菌観察装置の各構成要素を制御して、測定の開始及び測定の終了を管理することができる。また、制御部304は、測定データを取得する際に、対物レンズアクチュエータ210の駆動及びXYステージ211の駆動を制御することができる。
　なお、上記で説明した処理部は、コンピュータ109上で実行されるプログラムの機能として実現されてもよい。上記の処理部は、各処理に対応するプログラムコードがメモリに格納され、プロセッサが各プログラムコードを実行することによって実現されてもよい。なお、上記の処理部の一部が、専用の回路基板などのハードウェアによって構成されてもよい。
３．検査方法と結果出力
　図４Ａは、細菌検体の検査方法を示したフローチャートである。まず、血液などから分離培養された細菌である検体を入手する（401）。通常細菌量が少ないため、前培養を行う（402）。次に、細菌への応答を検査する薬剤と培養液との混合液（サンプル溶液）を準備する（403）。細菌を薬剤が混ざったサンプル溶液に懸濁する（404）。このとき、細菌への薬剤応答は最短でも数時間を要するため、薬剤が入っていない培養液のみのサンプル溶液であるコントロールも用意しておく。細菌入りのサンプル溶液をサンプル容器に分注する（405）。次に、サンプル容器を本実施例の観察装置にセットする（406）。観察装置での測定を開始する（407）。その後、温度コントロール及び計測を行いながら、測定データを取得する（408）。取得した測定データは、コンピュータ109によって解析処理が行われる。解析処理後に薬剤が細菌にどのような影響を与えたかの検査結果をコンピュータ109上に出力する（409）。
　図４Ｂは、図４Ａのステップ408の内容を示したフローチャートである。データ取得部301は、検出器208で測定された測定データを取得する（401）。このとき、制御部304は、XYステージ211を駆動し、対物レンズ206の集光位置をXY平面で走査する。データ取得部301は、ある集光位置（焦点位置）に対する2次元平面データを取得する。さらに、制御部304は、対物レンズアクチュエータ210を駆動し、対物レンズ206の集光位置をZ方向に変化させる。制御部304は、変化後のZ方向位置で、XYステージ211を駆動し、対物レンズ206の集光位置をXY平面で走査する。したがって、データ取得部301は、複数の焦点面での複数の2次元平面データを取得する。
　データ解析部302は、データ取得部301で取得された2次元平面データを解析する（412）。一例として、データ解析部302は、2次元平面データを画像情報に変換してもよい。別の例として、データ解析部302は、画像情報を解析し、細菌の数、細菌の形状、細菌の大きさ、及び焦点面での細菌が占める割合の少なくとも１つの定量値を算出してもよい。また、データ解析部302は、算出された定量値を統計処理し、細菌の空間分布に関する情報を算出してもよい。また、データ解析部302は、算出された定量値から、細菌の運動性を測定してもよい。また、データ解析部302は、細菌に関する情報の時間的な変化から細菌の状態変化を検査してもよい。
　データ解析部302は、解析結果を出力する（413）。なお、この時点で、データ表示処理部303が、データ解析部302からの解析結果をコンピュータ109のディスプレイに表示してもよい。
　次に、測定を終了するかを判定する（414）。終了しない場合は、測定間隔だけ待機し（415）、ステップ411に戻る。したがって、本実施例では、データ解析部302は、サンプル液に薬剤を入れた後の複数の異なる時間について、複数の焦点面での2次元平面データを解析する。データ解析部302は、細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報から、前記薬剤の前記細菌への応答に関する情報を求めることができる。例えば、データ解析部302は、薬剤の入れた後の１時間後（第１の時間）の測定データの解析結果と、２時間後（第２の時間）の測定データの解析結果を出力する。その後に実施される図４Ａのステップ409では、データ表示処理部303が、第１の時間での測定データの解析結果と、第２の時間での測定データの解析結果をコンピュータ109のディスプレイに表示することができる。
　なお、データ取得部301が、サンプル液に薬剤を入れる前及び後についての複数の焦点面での2次元平面データを取得し、データ解析部302が、薬剤を入れる前及び後についての細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報を求めてもよい。この場合、データ解析部302が、薬剤を入れる前及び後についての情報から、薬剤の細菌への応答に関する情報を求める。
　図５は、サンプル液中を観察する方法を説明する図である。サンプル容器501には、細菌と薬剤（例えば抗菌剤）が懸濁された培養液の混合液であるサンプル液502が入っている。サンプル液502中の細菌全体を観察するために、XYステージ211を駆動する。あるZ位置でXY平面を走査し、1つの2次元平面データ503を測定する。2次元平面データ503は、検出器208で測定される。2次元平面データ503は、コンピュータ209の記憶装置に格納される。
　次に、対物レンズアクチュエータ210によって対物レンズ206をZ方向に移動させる。このとき、焦点位置を被写界深度程度でZ方向に移動させて、複数の2次元平面データ503を測定する。一例として、20倍対物レンズでNA=0.45の場合、被写界深度を考慮して、Z方向に5μmずつ移動させる。なお、共焦点光学系がOCTの場合、サンプル容器501の表面の反射光が減衰した位置からOCTによる測定を開始することが望ましい。サンプル容器501の底面とサンプル液502の界面での反射光の影響によりSN比が低下するため、例えば、2次元平面データ503の測定位置は、サンプル容器501の底面から液体中に30μm以上離れた位置（サンプル容器501の底面からZ方向に30μm以上離れた位置）から測定することが望ましい。
　図６Ａ～図６Ｃは、サンプル液中をXY平面に走査した2次元平面データの模式図を示す。図６Ａ～図６Ｃでは、白い円状の像が細菌を示している。図６Ａは、サンプル容器501の底面に最も近い2次元平面データである。図６Ｂは、サンプル容器501の底面から50μm離れた2次元平面データである。図６Ｃは、サンプル容器501の底面から100μm離れた2次元平面データである。このように、複数のZ位置で複数の2次元平面データを取得することにより、細菌の分布を検出することが可能となる。
　図７は、データ表示処理部303によってコンピュータ209のディスプレイに表示される画面の一例である。図７の例では、サンプル容器の底面から50μm、100μm、150μm離れた位置で2次元平面データが取得されている。複数の焦点面での複数の2次元平面データは、それぞれ、画像情報に変換される。
　画面は、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）での複数のZ位置での画像群を表示する第１の領域601と、第２の時間（細菌の懸濁から２時間後）での複数のZ位置での画像群を表示する第２の領域602とを備える。第１の領域601の画像群と第２の領域602の画像群とは、それぞれの画像が比較できるように並んで配置される。また、画面では、2次元平面データの画像情報603と、その画像情報の解析結果604とが組になるように表示される。この例において、解析結果604は、細菌の数である。なお、画面は、実験条件表示部605及び測定条件表示部606を備えてもよい。本実施例の画面には、複数の高さの平面に存在する細菌数が表示される。また、異なる時間での細菌数の情報が、細菌数の時間変化を比較できる形式で並んで表示される。したがって、時間経過による薬剤の細菌への応答を観察することができる。
　なお、図７の例では、２つの異なる時間での細菌に関する情報（画像群及び細菌の数）を表示したが、３つ以上の異なる時間での細菌に関する情報を比較できる形式で画面に表示してもよい。
　図８Ａ及び図８Ｂは、サンプル容器の底面からの高さに対する、2次元平面データから計数した細菌数のグラフである。データ解析部302は、複数のZ位置での複数の2次元平面データから、サンプル容器の底面の高さに対する細菌数の変化を算出してもよい。図８Ａ及び図８Ｂのグラフは、その2次元平面データを測定した底面からの高さ（Z方向位置）を縦軸とし、横軸を細菌数としたグラフである。
　図８Ａは、サンプル容器の底面からの高さに対して、走性を示す大腸菌の存在数をプロットしたグラフである。大腸菌は、運動するため、底面に局在せず、サンプル容器の底面から離れた位置にも存在する。一方、図８Ｂは、サンプル容器の底面からの高さに対して、走性を示さない黄色ブドウ球菌の存在数をプロットしたグラフである。黄色ブドウ球菌は、運動しない。黄色ブドウ球菌は、熱拡散の影響で底面から離れた位置にも少なからず存在するが、主に底面に局在する。
　したがって、サンプル液中の細菌数の高さ方向の分布を解析することによって、細菌の走性を判定することができる。データ解析部302は、サンプル容器の底面からの高さに対して、細菌数を算出し、細菌数の変化をもとに細菌の走性に関する情報を出力してもよい。一例として、データ解析部302は、図８Ａ及び図８Ｂのような情報を出力してもよい。また、データ解析部302は、図８Ａ及び図８Ｂのようなグラフを解析し、細菌の走性の有無の判定結果を出力してもよい。一例として、データ解析部302は、図８Ａ及び図８Ｂのようなグラフの傾きから、細菌の走性の有無の判定結果を出力してもよい。別の例として、データ解析部302は、ある閾値となるZ位置より高い位置に一定数の細菌がいるかを判定し、細菌の走性の有無の判定結果を出力してもよい。また、データ解析部302は、ある閾値となるZ位置より高い位置にいる細菌数を算出し、その細菌がどの程度走性を有するかの評価値として出力してもよい。
　また、データ解析部302は、図８Ａ及び図８Ｂのようなグラフから別の情報を出力してもよい。一例として、データ解析部302は、図８Ａ及び図８Ｂのようなグラフの積分値から総細菌数を算出してもよい。
　図９は、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報である。詳細には、図９は、サンプル容器の底面からの高さに対する細菌数の分布の時間的な変化をプロットしたグラフである。図９のグラフでは、縦軸を細菌数とし、横軸を、底面からの高さ（Z方向位置）とし、奥行きの軸を、培養時間（例えば、サンプル液を準備してからの経過時間など）とする。一例として、データ解析部302は、図９のような情報を出力してもよい。サンプル容器の底面を0μmとすると、0μmの位置での細菌数は、時間が経つにつれて増加している。一方、サンプル容器の底面から200μmの場所の細菌数は、時間が経つにつれて減少している。
　サンプル容器底面から200μmの場所で細菌数が減少したことは、細菌が重力によって自然沈降したのではなく、元々運動していたサンプル液中の細菌が、薬剤（例えば、抗菌剤）の影響で走性を失って、細菌自体の活動が低下したことを示している。サンプル液中の細菌数の高さ方向の分布の培養時間による経時変化を解析することによって、抗菌剤の効果を検査することができる。したがって、データ解析部302は、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報から、薬剤の細菌への応答の判定結果を出力してもよい。
　図１０は、データ表示処理部303によってコンピュータのディスプレイに表示される画面の別の例である。データ解析部302は、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）での複数のZ位置での細菌数と、第２の時間（細菌の懸濁から２時間後）での複数のZ位置での細菌数とを算出してもよい。
　画面は、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）での解析結果を表示する第１の領域1001と、第２の時間（細菌の懸濁から２時間後）での解析結果を表示する第２の領域1002とを備える。第１の領域1001には、サンプル容器の底面からの高さに対する、2次元平面データから計数した細菌数のグラフ1003と、計数された細菌の合計1004とが組となるように表示される。第２の領域1002についても、第１の領域1001と同様の情報が表示される。本実施例によれば、複数の高さの平面に存在する細菌数の時間変化が、比較できる形式で画面上に表示される。したがって、時間経過による薬剤の細菌への応答を観察することができる。
　以上の実施例の細菌観察装置は、サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子（細菌、細胞など）を測定する共焦点光学系と、サンプル液中を3次元に走査するためにサンプル容器及び共焦点光学系の一部（対物レンズ）を駆動させる駆動機構（対物レンズアクチュエータ210とXYステージ211）とを備える。検出器208による測定結果（観察像）をデジタルデータに変換し、コンピュータ109に転送する。コンピュータ109は、デジタルデータを画像情報に変換し、その画像情報をディスプレイに表示する。ここで、コンピュータ109は、異なる複数の時間での測定結果をディスプレイに表示する。また、コンピュータ109は、画像情報を画像処理することにより、細菌の個数、大きさ、形状などの定量値を算出する。さらに、コンピュータ109は、その定量値から細菌の運動性を測定し、その運動性の時間変化から微粒子の状態変化を検査してもよい。
　以上の実施例によれば、微粒子（細胞又は細菌など）の液体中の空間分布を測定することができ、かつ、デフォーカスした像が無い画像を取得することができる。液体中の全体の微粒子の状態を観測することによって、サンプル容器底面だけの観察では得られない微粒子の正確な数や形状を定量できる。また、光軸方向の微粒子数分布を測定することによって、動画撮影をすることなく、静止画像で微粒子の運動性の情報を得ることができる。また、薬剤（例えば、抗菌剤）を作用させた後、この細菌数分布の時間変化から、細菌の抗菌剤への効果を検査することができる。
　また、細菌の空間的な分布から、細菌が走性を有するか、さらに、どの程度走性を有するかを測定することができる。また、液体中への細菌の分布の広がりの程度を測定することによって、細菌の走性の程度を検査することができる。
　また、上述したように、細菌の初期濃度はCLSIにより低濃度に定められている。従来の観察手法では、一平面での情報しか得られず、十分な情報を得られない可能性もある。本実施例によれば、液体中の全体の細菌の状態を観測することができ、低濃度の細菌での試験においても多くの情報を取得することができる。
［第２実施例］
１．検出法の概略
　図１１は、第２実施例に係る細菌観察装置の検出法を示す模式図である。一般的なOCT検出法を示す。ここで、用いる検出法は共焦点光学系を用いた検出法が望ましい。
　サンプル液1101は、サンプル容器1102によって保持される。図１１に示すサンプル液1101は、細菌と、溶媒として細菌が増殖するのに必要な栄養素と、抗菌剤とを含む。細菌観察装置は、共焦点光学系（ここでは、OCT）を備える。細菌観察装置は、光源1103と、ビームスプリッタ1104と、対物レンズ1105と、ミラー1106と、検出器1107とを備える。
　光源1103として、低コヒーレンス性光源を使用する。光源1103は、スーパールミネッセンスダイオード（SLD）のような、ブロードなスペクトルを持つ低コヒーレント性と高輝度性を持ち合わせた光源でもよい。光源1103から射出された光は、ビームスプリッタ1104によって、反射する光と透過する光に分けられる。ビームスプリッタ1104によって反射した光は、対物レンズ1105によりサンプル液1101中に集光される。集光された位置に細菌が存在する場合、溶媒と細菌表面との境界面で入射光が反射される。細菌からの反射光は、ビームスプリッタ1104を透過し、検出器1107に受光される。検出器1107は、例えば、フォトダイオード、CCD（charge coupled device）などの光検出器である。
　光源1103からビームスプリッタ1104を透過した光は、ミラー1106で反射され、その後、ビームスプリッタ1104で反射される。この光は、細菌からの反射された反射光と同時に検出器1107に受光される。焦点位置にある物体により反射された光の場合、ミラー1106で反射された光とサンプル液1101中の細菌で反射された光の位相が重なるため、光が増幅される。増幅された光は、検出器1107によって受光される。
　サンプル液1101中の細菌以外で反射された光はミラー1106で反射された光と位相が重ならないため、光は増幅されることなく検出器1107によって受光される。また、サンプル液1101の溶媒と細菌表面との境界面で反射された光の強度に関して、その溶媒と細菌表面の屈折率の変位が光の強度に変換される。光の強度を検出器107で測定することにより、対物レンズ1105の焦点位置にある細菌の存在の有無の情報が得られる。また、細菌が存在した場合、細菌の形状及び相対屈折率の情報が得られる。また、本例では、ミラー1106を走査することによって、光路長を変位させる。これにより、サンプル液1101内の深さ方向の細菌の状態を計測することができる。
２．観察装置の測定方法の概略
　図１２は、本実施例の細菌観察装置の概略図を示す。細菌観察装置は、主要な構成要素として、台座1202と、SLD光源1203と、ビームスプリッタ1204と、鉛直ミラー1205と、対物レンズ1206と、参照光ミラー1207と、検出器1208と、コンピュータ1209と、ミラーアクチュエータ1210と、XYステージ1211とを備える。
　台座1202は、サンプル容器1201を保持することができ、底面から光が入射できる構造を有する。SLD光源1203、ビームスプリッタ1204、対物レンズ1206、参照光ミラー1207、及び検出器1208は、それぞれ、図１１の光源1103、ビームスプリッタ1104、対物レンズ1105、ミラー1106、検出器1107に対応する。鉛直ミラー1205は、ビームスプリッタ1204で反射した光を、対物レンズ1206に向かってZ方向に反射させるミラーである。ミラーアクチュエータ1210は、参照光ミラー1207を移動させるアクチュエータであり、光路長を変位させるように構成される。
　コンピュータ1209は、図２のコンピュータ209と同様の構成である。すなわち、コンピュータ1209は、図３に示す各処理部を備える。
　測定する細菌と抗菌剤を懸濁したサンプル液が入ったサンプル容器1201を準備する。サンプル容器1201の底面は薄く、平滑であることが望ましい。サンプル容器1201を台座1202に固定する。SLD光源1203から低コヒーレント光が射出される。SLD光源1203からの光は、ビームスプリッタ1204で反射され、鉛直ミラー1205によりZ方向（鉛直方向）に反射される。ビームスプリッタ1204で反射し、鉛直ミラー1205により反射した光は、対物レンズ1206によって、サンプル容器1201のサンプル液中に集光される。光は、サンプル液中の細菌により反射される。細菌により反射された光は、再び対物レンズ1206を通り、鉛直ミラー1205で反射され、ビームスプリッタ1204を透過し、検出器1208に受光される。
　SLD光源1203から射出され、ビームスプリッタ1204を透過した光は、参照光ミラー1207で反射され、ビームスプリッタ1204で反射され、検出器1208に受光される。細菌により反射された光と参照光ミラー1207により反射された光とが干渉し、これにより、細菌の相対屈折率を反映した強度が検出器1208によって測定される。検出器1208で測定されたデータ（以下、「測定データ」）は、デジタルデータとして、コンピュータ1209に送信される。測定データと、測定データの座標の情報は、コンピュータ1209の記憶装置に保存される。
　本例では、サンプル液中の高さ方向に位相が合う位置を走査する場合には、ミラーアクチュエータ1210を駆動させる。水平方向に走査する場合にはXYステージ1211を駆動させる。XYステージ1211は、サンプル容器1201を載せた台座1202をX方向及びY方向に移動させることにより、対物レンズ1206による集光位置を水平方向に走査することができる。ミラーアクチュエータ1210とXYステージ1211を駆動させることによって、サンプル液中の細菌からの信号を立体的な位置情報として検出することができる。
３．検査方法と結果出力
　本例の細菌検体の検査方法のフローチャートは、図４Ａ及び図４Ｂで示した例と同様である。したがって、説明を省略する。
　図１３は、サンプル液中を観察する方法を説明する図である。サンプル容器1301には、細菌と薬剤（例えば抗菌剤）が懸濁された培養液の混合液であるサンプル液1302が入っている。サンプル液1302中の細菌全体を観察するために、XY平面とYZ平面を走査する。
　XYステージ1211を駆動することにより、あるZ位置でXY平面を走査し、1つの2次元XY平面データ1303を測定する。2次元XY平面データ1303は、検出器2108で測定される。2次元XY平面データ1303は、コンピュータ1209の記憶装置に格納される。ここで、2次元XY平面データ1303について、サンプル容器1301の底面とサンプル液1302の界面の反射光が強いため、サンプル容器1301の底面からサンプル液1302中を測定してもよい。通常の培養液とポリスチレンのサンプル容器1301を使用する場合、サンプル容器1301底面から50μm離れた位置の2次元XY平面データ1303を取得する。
　次に、あるX位置に固定した状態でXYステージ1211を駆動してY方向のみを走査し、この走査を、ミラーアクチュエータ1210を駆動することにより複数のZ位置で行う。これにより、YZ平面を走査し、1つの2次元YZ平面データ1304を測定する。2次元YZ平面データ1304は、コンピュータ1209の記憶装置に格納される。
　図１４Ａ～図１４Ｃは、サンプル液中をXY平面又はYZ平面に走査した2次元平面データの模式図を示す。図１４Ａ～図１４Ｃでは、白い円状の像が細菌を示している。図１４Ａは、サンプル容器1301の底面に最も近い2次元XY平面データである。図１４Ｂは、走性のある細菌の2次元YZ平面データである。図１４Ｃは、走性のない細菌の2次元YZ平面データである。
　図１５は、データ表示処理部303によってコンピュータのディスプレイに表示される画面の一例である。画面には、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）における水平方向平面の画像及び深さ方向平面の画像と、第２の時間（細菌の懸濁から２時間後）における水平方向平面の画像及び深さ方向平面の画像とが表示される。図１５の例では、サンプル容器1301底面から50μm離れた位置の2次元XY平面データと、あるX位置での2次元YZ平面データが取得されている。各2次元平面データは、画像情報に変換される。
　画面は、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）での2次元XY平面データ及び2次元YZ平面データを表示する第１の領域1501と、第２の時間（細菌の懸濁から２時間後）での2次元XY平面データ及び2次元YZ平面データを表示する第２の領域1502とを備える。第１の領域1501の画像群と第２の領域1502の画像群とは、それぞれの画像が比較できるように並んで配置される。また、第１の領域1501には、2次元YZ平面データの画像情報1503と、その画像情報の解析結果1504とが組になるように表示される。また、第１の領域1501には、2次元XY平面データの画像情報1505と、その画像情報の解析結果1506とが組になるように表示される。この例において、解析結果1504, 1506は、細菌の数である。第２の領域1502についても、第１の領域1501と同様の情報が表示される。本実施例の画面には、異なる平面に存在する細菌数が表示される。
　上記の例では、異なる平面での細菌の分布の情報が、時間的な変化が比較できる形式で表示される。したがって、時間経過による薬剤の細菌への応答を観察することができる。なお、本実施例に関しても、データ解析部302は、図８Ａ、Ｂ及び図９で説明した情報を求めてもよい。例えば、データ解析部302は、2次元YZ平面データから図８Ａ、Ｂで示した情報を算出してもよい。データ解析部302は、2次元YZ平面データの時間的変化から図９で説明した情報を求めてもよい。また、データ解析部302は、2次元XY平面データ及び2次元YZ平面データから、細菌の運動性（走性）を判定してもよい。
　以上の実施例の細菌観察装置は、サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子（細菌、細胞など）を測定する共焦点光学系と、サンプル液中を3次元に走査するためにサンプル容器及び共焦点光学系の一部（参照光ミラー）を駆動させる駆動機構（ミラーアクチュエータ1210とXYステージ1211）とを備える。検出器1208による測定結果（観察像）をデジタルデータに変換し、コンピュータ1209に転送する。コンピュータ1209は、デジタルデータを画像情報に変換し、ディスプレイに表示する。ここで、コンピュータ1209は、異なる複数の平面における測定結果をディスプレイに表示する。また、コンピュータ1209は、異なる複数の平面における測定結果を、複数の異なる時点に関してディスプレイに表示する。
　以上の実施例によれば、液体中の全体の微粒子の状態を観測することによって、サンプル容器底面だけの観察では得られない微粒子の正確な数や形状を定量できる。また、微粒子の個数、大きさ、及び形状の定量値から微粒子の運動性を測定し、その運動性の時間変化から微粒子の状態変化を検査することができる。また、走性のない細菌に対しても、培養初期の菌数の少なく、細菌密度が小さい状態での深さ方向の総菌数を計数し、ある一定の時間が経った後の深さ方向の総菌数を計数することができる。これらの深さ方向の総菌数を統計処理することで、SNの高い菌数の時間的変化をモニタすることができ、迅速に抗菌剤の効果を確認できる。
　本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることもできる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加・削除・置換することもできる。
　なお、上述では各種画像処理及び統計処理を説明したが、上述した例に限定されない。例えば、物体の形状の違いにより、物体の液体中の沈降速度が異なることが知られている。物体に掛かる力の方向、例えば重力の掛かる方向の液体中の物体の分布が分かれば、物体の形状が球に近いか、フィラメント状になっているかなどの形状を推定することができる。したがって、データ解析部302は、重力の掛かる方向（例えば、Z方向）の液体中の細菌の分布から、細菌の形状を判定してもよい。データ解析部302は、Z方向の液体中の細菌の分布から細菌の沈降速度を計算し、算出された沈降速度に基づいて細菌の形状を判定してもよい。沈降速度と粒子径との関係は、一例としてストークスの法則を用いることができる。
　上述では、主に細菌の検査について説明したが、他の微粒子の検査についても上記の実施例を適用することができる。上記の通り、本実施例は、微粒子の形を判定する装置として適用可能である。従来では、沈降速度によって粒子の形を判定する場合、遠心分離機を使用していたが、上記の実施例を用いることにより、遠心分離機を使用することなく、沈降速度によって粒子の形を判定することができる。
　上述したコンピュータ209,1209での各種処理は、それらの機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、プログラムコードを記録した記憶媒体をシステム或は装置に提供し、そのシステム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施例の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。このようなプログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。
　ここで述べたプロセス及び技術は本質的に如何なる特定の装置に関連することはなく、コンポーネントの如何なる相応しい組み合わせによってでも実装できる。更に、汎用目的の多様なタイプのデバイスが使用可能である。ここで述べた処理を実行するのに、専用の装置を構築するのが有益である場合もある。つまり、上述したコンピュータ209,1209での各種処理の一部が、例えば集積回路等の電子部品を用いたハードウェアにより実現されてもよい。
　さらに、上述の実施例において、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。全ての構成が相互に接続されていても良い。
101　　…サンプル液
102　　…サンプル容器
103　　…光源
104　　…ビームスプリッタ
105　　…対物レンズ
106　　…ミラー
107　　…検出器
109　　…コンピュータ
201　　…サンプル容器
202　　…台座
203　　…コヒーレンス光源
204　　…ビームスプリッタ
205　　…鉛直ミラー
206　　…対物レンズ
207　　…参照光ミラー
208　　…検出器
209　　…コンピュータ
210　　…対物レンズアクチュエータ
211　　…XYステージ
301　　…データ取得部
302　　…データ解析部
303　　…データ表示処理部
304　　…制御部
1101　…サンプル液
1102　…サンプル容器
1103　…光源
1104　…ビームスプリッタ
1105　…対物レンズ
1106　…ミラー
1107　…検出器
1201　…サンプル容器
1202　…台座
1203　…SLD光源
1204　…ビームスプリッタ
1205　…鉛直ミラー
1206　…対物レンズ
1207　…参照光ミラー
1208　…検出器
1209　…コンピュータ
1210　…ミラーアクチュエータ
1211　…XYステージ

Claims (17)

  1. 　サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子を測定する共焦点光学系と、
    　前記サンプル液中を3次元に走査するために前記サンプル容器及び前記共焦点光学系の一部を駆動させる駆動機構と、
    　前記共焦点光学系及び前記駆動機構を制御し、複数の異なる時間に関して複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を取得する制御装置と、
    を備え、
    　前記制御装置は、前記複数の焦点面での前記微粒子に関する情報の時間的な変化を表す情報を求めることを特徴とする観察装置。
  2. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記時間的な変化を表す情報は、前記微粒子の空間的分布の情報と、時間との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  3. 　請求項２に記載の観察装置において、
    　前記微粒子の空間的分布の情報は、前記サンプル容器の底面からの距離と、前記微粒子の数との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  4. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記微粒子は細菌であり、前記時間的な変化を表す情報は、前記細菌の空間的分布の情報と、時間との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  5. 　請求項４に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記時間的な変化を表す情報から、前記細菌の運動性に関する情報を求めることを特徴とする観察装置。
  6. 　請求項４に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記サンプル液に薬剤を入れた後の複数の異なる時間についての前記時間的な変化を表す情報から、前記薬剤の前記細菌への応答に関する情報を求めることを特徴とする観察装置。
  7. 　請求項４に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記サンプル液に薬剤を入れる前及び後についての前記時間的な変化を表す情報から、前記薬剤の前記細菌への応答に関する情報を求めることを特徴とする観察装置。
  8. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記微粒子に関する情報は、前記微粒子の数、前記微粒子の大きさ、前記微粒子の形状、及び、前記焦点面における前記微粒子が占める割合の少なくとも１つであることを特徴とする観察装置。
  9. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記共焦点光学系は、OCT（3次元光干渉断層計）を備えることを特徴とする観察装置。
  10. 　請求項９に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記サンプル容器の表面の反射光が減衰した位置から前記OCTによる測定を開始することを特徴とする観察装置。
  11. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記サンプル液中の水平方向平面及び深さ方向平面について前記微粒子に関する情報を取得し、前記水平方向平面及び前記深さ方向平面についての前記時間的な変化を表す情報を求めることを特徴とする観察装置。
  12. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記時間的な変化を表す情報を表示する表示装置をさらに備えることを特徴とする観察装置。
  13. 　サンプル容器内のサンプル液中の焦点面に存在する微粒子を測定する共焦点光学系と、
    　前記サンプル液中を3次元に走査するために前記サンプル容器及び前記共焦点光学系の一部を駆動させる駆動機構と、
    　前記共焦点光学系及び前記駆動機構を制御し、少なくとも第１の時間及び第２の時間に関して複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を取得する制御装置と、
    　前記複数の焦点面での前記微粒子に関する情報を、前記第１の時間及び前記第２の時間の間の時間的な変化が比較できる形式で表示する表示装置と、
    を備えることを特徴とする観察装置。
  14. 　請求項１３に記載の観察装置において、
    　前記表示装置は、前記第１の時間における前記複数の焦点面での画像群と、前記第２の時間における前記複数の焦点面での画像群とを表示することを特徴とする観察装置。
  15. 　請求項１３に記載の観察装置において、
    　前記表示装置は、前記第１の時間での前記微粒子の空間的分布の情報と、前記第２の時間での前記微粒子の空間的分布の情報とを表示することを特徴とする観察装置。
  16. 　請求項１３に記載の観察装置において、
    　前記微粒子の空間的分布の情報は、前記サンプル容器の底面からの距離と、前記微粒子の数との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  17. 　請求項１３に記載の観察装置において、
    　前記表示装置は、前記第１の時間における水平方向平面の画像及び深さ方向平面の画像と、前記第２の時間における水平方向平面の画像及び深さ方向平面の画像とを表示することを特徴とする観察装置。
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