CN110178069A - 显微镜设备、方法和系统 - Google Patents

Abstract

NIR激发光的脉冲光束以倾斜角度投射到样本(345)中，并由扫描元件扫描通过样本中的体积。双光子激发能激发样本内的荧光。无论扫描元件的取向如何，荧光都成像到保持静止的中间图像平面上。图像由光检测元件(392)的线性阵列、或矩形阵列的线性部分捕获。在扫描元件的任何给定位置处，线性阵列(或部分)同时对所有深度进行成像。针对扫描元件的多个不同取向中的每一个，捕获多个图像。控制扫描元件的取向以二维模式移动，这使得激发光光束扫掠出样本内的三维体积。

Description

显微镜设备、方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年11月12日提交的美国临时申请62/421,244的权益，所述申请的全部内容通过引用并入本申请中。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS094296、NS076628、NS063226和NS053684资助项的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

WO 2015/109323和US 2016/0327779中开发并描述了一种三维成像系统，其被称为扫掠共焦对准平面激发(SCAPE)显微镜术，其中WO 2015/109323和US 2016/0327779的全部内容均通过引用并入本文。SCAPE系统通过扫描激发光并对图像光进行解扫描，在光检测器上以高速形成三维显微图像，使得在每一个瞬间检测到样本的多个深度。

发明内容

在SCAPE的各种实施例中，双光子激发可以提供快速3D成像，使得能够以高分辨率探索活体解剖学。NIR激发光的脉冲光束以倾斜角度投射到样本中，并由扫描元件扫描通过样本中的体积。双光子激发能激发样本内的荧光。无论扫描元件的取向如何，荧光都成像到保持静止的中间图像平面上。图像由光检测元件的线性阵列、或矩形阵列的线性部分捕获。在扫描元件的任何给定位置处，线性阵列(或部分)同时对所有深度进行成像。针对扫描元件的多个不同取向中的每一个，捕获多个图像。控制扫描元件的取向以二维模式移动，这使得激发光光束扫掠出样本内的三维体积。

附图说明

图1显示了根据本文公开的许多实施例的模块化示意图，其体现了用于以高帧速率在深度上分辨图像的一系列设计备选方案。

图2显示了根据所公开主题的一个或多个实施例的采用行扫描和线性检测器进行深度分辨成像的配置。

图3显示了使激发光线扫描通过体积并使用线性阵列同时检测多个深度的实施例。

图4显示了使贝塞尔(Bessel)光束形激发光线扫描通过体积并使用线性阵列同时检测来自多个深度的双光子激发的实施例。

图5A显示了与图4的实施例类似的另一个实施例，但是线性检测器位于不同的位置。

图5B显示了与图5A的实施例类似的另一个实施例，但是线性检测器位于不同的位置并且移除了某些部件。

图6显示了与图4的实施例类似的另一个实施例，但是使用不同的技术来注入激发光光束。

图7显示了与图4的实施例类似的另一个实施例，但是增加了补充的非成像检测器。

以下参考附图对各种实施例进行详细描述，其中相同的附图标记表示相同的元件。

具体实施方式

扫掠共聚对准平面激发(SCAPE)显微镜术是一种用于活生物体中的高速三维显微镜术的技术。SCAPE能够以每秒超过20个体积的速度，对完整的活体样本进行成像，完整的活体样本包括完整的小鼠大脑和自由移动的生物体、诸如黑腹果蝇幼虫和斑马鱼心脏。

SCAPE是介于光片显微镜术和共焦扫描显微镜术之间的混合技术，其克服了这些现有技术的许多局限性。

SCAPE使用单个物镜进行照射和检测，使得样品的定位和对准比传统的光片成像要简单得多。

SCAPE使用倾斜光片，该倾斜光片使用扫描镜扫掠通过样品，从而在其扫掠时捕获光学分层的被照射平面的图像。这意味着SCAPE无需以物理方式平移物镜或样品，即可获取三维体积图像。这大大提高了可实现的成像速度，以及样品制备和多样性。

SCAPE的扫描和解扫描(de-scanning)光学器件意味着被照射平面始终与固定相机保持对准，从而在没有其他移动部件的情况下提供光学分层(optical sectioning)。在双向扫描时，没有占空比或额外开销，从而获得了一种具有非常高的体积成像速度的简单、价廉的系统。

所公开的主题的实施例涉及成像技术，在该成像技术中，同时从多个深度捕获来自对象的图像光以形成一个或多个图像，该成像技术在此被识别为深度分辨成像，包括已知为扫掠共聚对准平面激发(SCAPE)显微镜术的具体实施例。在包括SCAPE实施例的具体实施例中，将照射光束应用于关注的对象，使得光束横穿多个深度。可以选择照射光束的形状以便于特征辨别，例如，如光片或平面照射光束荧光显微镜术中的光片，或笔形光束。在应用照射光束的同时，从多个深度捕获由例如发射或反射产生的图像光并利用该图像光形成图像。通过产生例如呈平面光束形式的照射光束并在对所得到的图像光进行解扫描的同时扫描平面光束，可以按顺序横穿体积并快速成像。可以在多个轴上扫描笔形光束以获得类似的效果。这可以重复以捕获对象的运动和对象内的运动。图像捕获可以由检测器(诸如相机传感器)的二维阵列提供，或者由光电倍增器的线性阵列(例如行阵列)提供。

在实施例中，使用单个物镜对样品进行照射和检测。本文所使用的术语“照射”和“激发”是指在成像中使用的任何类型的出射光，无论其是激发或抑制用于构造图像的二次辐射的发射，还是通过一些物理现象(诸如反射、散射或任何其他手段)返回。因此，照射可以通过荧光激发、反射、散射、二次谐波产生、拉曼(Raman)散射和/或任何其他机制产生图像光。进一步地，照射能量可以在所需位置抑制图像光以提高分辨率。除了其他优点之外，与采用单独的光学部件用于投射照射光和用于接收成像光的光片成像(light-sheetimaging)相比，使用单个物镜来投射照射光和成像可以简化对象定位和对准。

在实施例中，光束沿着延伸到对象的多个深度中的细长狭窄的光束或平面光束，通过物镜投射到对象中，并且同时从多个深度捕获从对象返回的图像光并将该图像光用于对在多个深度处的特征进行成像。可以使光束扫描通过多个位置以允许形成三维图像。在采用呈平面光束形状的照射光的实施例中，可以对对象进行光学分层，并且对于所产生的来自被照射平面的图像光，能够在平面照射光束进行扫掠时通过相同的物镜捕获，或者能够以其他方式重新定位。在光束移动时，对返回的图像光进行解扫描并成像到光检测器(诸如相机、或检测器的线性阵列)上。解扫描将从多个深度返回的光保持投射到光检测器上。本文的解扫描是指在光检测器的检测范围内，逐级地或逐步地保持对对象中的光源的某种映射。例如，解扫描可以将扫掠照射平面光束保持聚焦在相机的图像平面上。实施例捕获或显示多个离散的或连续范围的平面图像以生成三维体积图像，而无需以物理方式平移物镜或对象，从而显著提高成像速度，同时避免与其他成像模态相关联的对象准备和选择限制。

在实施例中，描述了采用反射元件的扫描元件，但是在任何实施例中，可以采用其他机构以逐级地、递增地或不连续地移动光束。这些附加实施例可以使用其他光重定向设备(诸如，折射或衍射元件)，以扫描一个或窄的或平面的光束。这些光重定向设备可以包括镜子(mirror)、棱镜、声光偏转器、电子透镜、空间光调制器(SLM)、共振扫描仪、旋转棱镜或反射器扫描仪、光束转向镜或光学器件、柔性光学光导或光纤、其他类型的自适应光学器件、或者用于控制出射光和入射光的方向的任何其他机构。这些变型被视为可替代在任何公开的实施例(包括权利要求)中所识别的元件，并且所得到的实施例包括在本申请的所公开的主题中。

在所公开的主题的实施例中，扫描和解扫描光学器件配置成使得被照射的路径与固定的光检测器(例如，线性或二维光传感器)保持对准，该固定的光检测器被采样以提供光学分层。在实施例中，通过移动扫描镜(或多个镜或其他扫描设备)使平面照射光束扫掠通过对象，以改变照射光入射到物镜背面的角度(或多个角度)，从而致使其从物镜出射的位置或角度发生变化。请注意，代替片状光束，平面照射光束可以由多个离散的圆柱形光束形成，这些圆柱形光束通过扫描来横穿光片进行扫掠，或者通过使圆柱形光束变平的光学元件进行扫掠。平面照射光束也可以由在各个瞬间形成的多个离散的平行圆柱形光束形成。可以在两个十字轴(cross-axis)维度上扫描这样的光束以捕获体积(一次捕获每个位置的给定深度)。这种角度改变致使照射光束扫掠过对象。如上所指出的，其他照射图案可以形成二维或三维图像或者甚至是线性深度分辨检测。来自对象内的被照射区域的光(例如，经由荧光激发、反射、散射、二次谐波生成和/或拉曼散射)通过相同的物镜返回并进行解扫描。通过解扫描，即使光移动(或者更一般地，重新定位)通过对象，检测到的光也会形成静止的并且与被照射区域对准的被照射区域的图像，这与激光扫描共聚焦显微镜中的共焦针孔与扫描照射的焦点保持对准的方式大致相同。

解扫描可以采用多个光学部件来生成静止图像。相机可以在图像(中间图像)上聚焦以在光检测器上形成另一个图像。非聚焦相机可以瞄准图像。图像可以直接在光检测器上形成。光检测器可以包括高速sCMOS相机、CCD相机、光电倍增管阵列、线性检测器阵列或任何其他光检测或成像设备。另选地，成像设备或者成像设备的输入可以放置在图像平面上。在所公开的主题的实施例中，单个固定物镜配置与扫描/解扫描配置相结合，允许其以类似于其他立式或倒置显微镜的方式使用，或者作为对现有显微镜(诸如共焦显微镜)的添加或修改而提供。扫描和解扫描都可以理解为改变窄的笔形光束(即，低纵横比光束，例如圆形的光束)或平面光束中的一个或多个的角度、位置或角度和位置两者。

参照图1，示出了与成像系统100的实施例相关联的各种高阶特征。实施例可以包括图1中示出的一些或所有特征，以及图1中未具体示出的其他特征。在一些实施例中，图1中的一些特征可以相对于无论是示出还是未示出的其他特征进行省略或重新布置。而且，示出的特征是执行一个或多个功能的简化部件。基于对图1的总体讨论和以下对各种示例的详细讨论，用于执行由简化部件表示的一个或多个功能的许多备选方案对普通技术人员而言将是显而易见的。

在一个或多个实施例中，成像系统100可以通过显微或宏观的方式对对象106进行成像。除了其他方面之外，成像系统100可以包括第一光学模块102(即，照射模块)、第二光学模块103和第三光学模块104(即，检测模块)。照射模块102可以提供例如激光光束，并且对光进行预调节，使得光在对象106内形成线性或平面光束。光束的预调节可以使其在对象内形成狭窄的或平面的照射图案。光学器件本身可能不会形成光束或平面。SLM是一种例如经由用于贝塞尔光束形成等的自适应光学器件进行预调节光束以减少像差的选择。可以对照射光束进行时间调制，以在平面中形成空间图案或者以其他方式图案化以形成结构化照射，然后可以对结构化照射进行图像处理以生成“超分辨率”图像。照射模块102可以提供输入光134，用于经由一个或多个光学路径对第二光学模块103进行扫描。检测模块104可以响应于入射光，接收已经被对象106内的被照射平面反射、散射和/或发射的光135。

照射模块102可以包括一次照射源122，例如，激光光源或准直光束源。由一次照射源122产生的照射光束可以提供给光束调节模块120，光束调节模块120包括一个或多个用于调节光束以实现所需照射特性的照射光学器件和/或部件。例如，光束调节模块120的一个或多个照射光学器件和/或部件可以包括折射、反射和/或衍射光学器件，用于将光束形成为对象106内的线性或平面光束。例如，为了形成平面照射光束，折射、反射和/或衍射光学器件可以包括有源元件(诸如，扫描仪)或无源元件(诸如，柱面透镜)。另选地或另外地，光束调节模块120的一个或多个照射光学器件和/或部件可以包括光束调节部件，诸如波长选择性滤光片、偏振选择性或变更性部件、渐变中性密度滤光片、调制器等。另选地或另外地，光束调节模块120的一个或多个照射光学器件和/或部件可以包括孔径，该孔径在任何光束调节之前、在一些或全部光束调节之后、或者在沿着光源和对象之间的光学路径的任何其他点处，限制光束的大小。另选地或另外地，光束调节模块120的一个或多个照射光学器件和/或部件可以包括变焦透镜(未示出，但是可以设置在聚焦模块108之前，例如，在望远镜110内，具体取决于系统配置)，该变焦透镜可以用来改变第二模块103和/或电透镜(未示出)的放大率，该电透镜可以用来改变照射光相对于聚焦模块108的位置。另选地或另外地，光束调节模块120可以包括自适应光学器件，诸如空间光调制器(SLM)，其可以对光束进行预调节光束以减少像差。

请注意，在所公开的实施例中，由于系统在多个深度(相对于物镜的轴向位置)处获取并保持焦点的功能，可能会出现一种或多种类型的像差。这些像差可以包括色像差和球面像差，具体取决于设计者选择的配置。可以使用已知技术减少或消除这些像差，这些已知技术例如为非球面透镜、GRIN透镜、多元件光学器件或其他技术。在一些实施例中，通过使光透射通过透镜组件来补偿物镜中出现的像差，该透镜组件的特性被选择为完全或基本上补偿由物镜引入的像差。例如，可以使用与物镜相同的透镜组件。

在一些配置中，可以对一次照射源122进行时间调制，以在对象内的被照射平面中形成空间图案，或者以其他方式图案化以形成结构化照射光来增强分辨率(即，“超分辨率”)，诸如在晶格光片显微镜术中。另选地或另外地，一次照射源122可以生成一个或多个贝塞尔光束，该光束形成照射对象的平面照射光束。

在一些配置中，一次照射源122可以包括多个光源，例如，具有不同中心波长的多个激光光源。在这些配置中，光束调节模块120可以进一步包括例如通过在适当的滤光片之间进行切换、通过选择性地激活特定激光器、或者通过将多个激光源之一(或对应的输入部件)移动到单个输入位置中来选择用于照射的波长的光学器件和/或部件。另选地或另外地，光束调节模块120可以包括用于将多个光束组合成单个光束的光学器件和/或部件。在这样的配置中，例如，可以通过包括多波段二向色作为分离模块112的一部分和/或通过采用陷波滤光器作为图像调节模块130的一部分，在照射模块102的下游提供附加的光学器件和/或部件，以适应同时的多波长照射和产生的检测到的光。另选地或另外地，多个光源的组合可以允许例如通过形成产生较窄的平面光束的平面光束的组合，来进行受激发射损耗(STED)成像。另选地或另外地，多个光源的组合可以允许进行类似于受激拉曼散射(SRS)成像和/或相干反斯托克斯(anti-Stokes)拉曼散射(CARS)成像的泵-探针成像。

除了以上具体讨论的那些之外，用于光束调节模块120的其他光学器件和/或部件在任何实施例中也是可行的。尽管本文已经描述了激光源，但是可以使用任何准直光源(或者能够被准直的光源)或光源组合，例如脉冲波或连续波。在实施例中，可以使用再生放大器从源122中产生一次照射。

可以将输入照射134提供给第二模块103的扫描模块116。扫描模块116可以包括一个或多个光学器件和/或部件，用于朝向对象106重定向输入照射134，并且以在对象内实现对所得到的平面照射光束的扫描。例如，扫描模块103可以包括一个或多个反射元件(例如，安装在检流计上的可移动镜)，用以改变输入照射134的光学路径。在通过扫描模块103重定向之后，照射光可以行进到分离模块112，在分离模块处，将被定向到对象的光与从对象返回的任何检测光分离。

在一些实施例中，分离模块112包括用于区分照射光和检测光的一个或多个光学部件。例如，分离模块112可以包括波长选择性分束器(例如，二向色镜/滤光片或介质镜/滤光片)或偏振选择性分束器，以便沿着单独的光学路径对照射光和检测光进行定向。在其他实施例中，分离模块112包括系统100内的其他模块的光学器件或部件的布置，这些光学器件或部件用于在不使用分束器的情况下以物理方式分离照射光和检测光。尽管图1已经示出了分离模块112沿着输入光路在扫描模块116之后，但是也可以预期分离模块112或其部件可以在扫描模块116之前(和/或沿着检测到的光路在解扫描模块118之后)。

从扫描模块116和分离模块112开始，输入平面照射光束行进到可选的望远镜模块110，该望远镜模块可以包括形成望远镜的一个或多个光学器件或部件，所述望远镜用于将输入照射光成像到聚焦模块108的后孔径上(或者后输入平面上，其可以与后孔径不同)。例如，可选的望远镜模块110可以将输入照射光成像到相对于物镜在某个点处静止的平面上，例如，后孔径、后焦平面、或者任何其他点，具体取决于所需的扫描图案。这种配置在最小化或至少减少扫描期间损失的光量方面可能是有利的。另选地或另外地，可选的望远镜模块110可以相对于扫描镜(例如，扫描模块116的扫描镜)的尺寸，将入射照射光的位置放大到物镜(例如，聚焦模块108的物镜)的后孔径的边缘上，使得可以相对于后孔径使用较小的扫描镜。由望远镜模块110提供的放大率得到的类似特征也可以应用于检测到的光138的任何解扫描镜(例如，解扫描模块118)。当提供可选的望远镜模块110时，该模块可以包括例如沿着光学路径设置的一对透镜。

聚焦模块108(例如，物镜或其他反射、衍射或折射聚焦光学部件)接收来自望远镜模块110的输入照射光，并且在物体106内将照射光以倾斜角度(即，相对于的物镜透镜的光轴)聚焦到平面光束137中(或者另选地，与轴(未示出)对准，使得对象内的多个深度被照射)。聚焦模块108还可以例如使用用于形成输入平面照射光束137的相同物镜透镜，接收来自对象106的光138。系统100可以配置成使得在扫描和检测期间，聚焦模块108的部件和对象106(或者至少成像体积，例如，当对象独立于成像体积移动时)可以保持基本静止。

来自对象106的光138可以经由聚焦模块108，在中途通过第二模块103的许多相同或类似的模块定向至检测模块104。例如，聚焦模块108可以将光138定向至望远镜模块110，在望远镜模块110处，其通过将输入照射光成像到聚焦模块108上的相同的望远镜透镜组进行处理。光138可以通过分离模块112(例如，用于分离的特定光学器件或部件，或者通过适当布置输入和输出光路)分离，并且通过解扫描模块118进行解扫描。另选地，如上所指出的，解扫描模块118的解扫描可以在分离模块112的分离之前发生。

尽管存在照射的扫描运动，但是模块118的解扫描可以将成像模块132的静止检测平面保持成对应于输入照射所照射的对象中的平面。解扫描模块118可以包括一个或多个光学器件和/或部件，用于重定向来自对象的光。解扫描模块118的重定向可以和扫描模块116的重定向同步，使得由系统100成像的检测到的平面对应于由系统100照射的平面。在一些实施例中，扫描模块116和解扫描模块118共享一些相同的部件(即，包括扫描/解扫描模块114)。在这些实施例中，扫描/解扫描可以由相同的镜子执行。在其他实施例中，扫描模块116和解扫描模块118仅使用分离的部件(例如，采用独立的镜子)。在这些实施例中，扫描可以由与进行解扫描的第二镜子分离的第一镜子执行，但是可以协调镜子的运动以在被照射平面和检测到的光之间保持所期望的对应。

在一些实施例中，扫描/解扫描模块114包括一个或多个反射表面，诸如偏斜的宏观尺度的镜子或多面镜的小平面。然而，根据一个或多个预期实施例，也可以使用用于有效扫描/解扫描的其他反射、衍射或折射光学部件。例如，扫描/解扫描可以由其他宏观尺度的光学部件(诸如，可变形镜或SLM)提供，或者由微观尺度的光学部件(诸如，MEMS镜和数字光处理器(DLP))提供。

来自第二模块103的所得到的检测光135可以由检测模块104接收，以进行进一步的光学处理和成像。例如，检测模块104可以包括图像形成模块126、可选的场旋转模块128、图像调节模块130和成像模块132。图像形成模块126可以设计成形成被照射平面的图像并/或补偿像差(例如，第二模块103可能引入的任何像差)。因此，图像形成模块126可以包括与可选的望远镜模块110和聚焦模块108的光学器件和/或部件类似或相同的光学器件和/或部件。

在一个或多个实施例中，图像形成模块126和聚焦模块108的光学器件和/或部件可以具有相应的放大率，选择该放大率以指示由成像形成模块126形成的中间图像平面的角度。例如，通过选择相应的放大率以在中间图像处产生总体1x放大率(并且考虑到用于模块108、126的物镜透镜的任何浸渍介质)，中间图像平面的角度可以和对象中的被照射平面相同，即，零旋转。改变相应的放大率以产生不同于1x的总放大率，可以改变所得到的图像平面角度并且可能会引入像差。因此，图像形成模块126与聚焦模块108和可选的望远镜模块112相结合，可以设计成以单位放大率或接近单位放大率产生对象106中的被照射平面的图像。根据一个或多个预期实施例，除了1x之外的其他放大率也可以例如用于旋转图像平面以增加光捕获或用于任何其他目的。

由图像形成模块126产生的所得到的图像相对于光轴成倾斜角度。如果利用检测器的检测平面对光轴执行成像，光将会形成被照射平面的图像，由于图像具有倾斜角度，因此该被照射平面在聚焦模块108(例如，主物镜)的焦平面的上方和下方模糊。在一些实施例中，这种模糊可以是能够接受的，和/或可以通过旋转检测器的检测平面以匹配或接近图像平面来解决。在其他实施例中，可选的场旋转模块128可以用来使该图像平面重新取向。例如，场旋转模块128可以使用一个或多个光学部件来完全或部分地旋转图像平面，以允许图像与检测器的检测平面重合，同时保持整个图像(并因此保持所有深度)聚焦。场旋转模块128的其他配置可以在不实际旋转图像平面的情况下解决深度分辨图像形成，并且将在下面进一步详细讨论。

在场旋转模块128之前、之内或之后(或者在未提供场旋转模块128时，在图像形成模块126之前、之内或之后)，可以提供具有一个或多个光学器件和/或部件的图像调节模块130，用于调节检测到的光(即，调整图像平面的位置、放大率和/或角度)，以便由成像模块132进行最终检测，该成像模块132可以是单个检测元件(例如，光电倍增管(PMT))、线性阵列(例如，线性检测器阵列或PMT的线性阵列)、或二维阵列(例如，CCD相机)。例如，图像形成模块130可以包括用于对检测到的光进行整形或调整数值孔径(例如，可调孔径或光圈(irises))的光学器件或部件、用于波长选择(例如，发射滤光片或多色成像部件)的光学器件或部件、和/或用于图像增强(例如，图像强化或可变幅度调整)的光学器件或部件。另选地或另外地，图像调节模块130可以包括用于例如通过将输出光聚焦到成像模块132的输入平面上，来将场旋转模块128(或者图像形成模块126)输出的光定向至成像模块132的光学器件和/或部件。

另选地或另外地，图像调节模块130和/或图像形成模块126可以包括一个或多个场透镜(未示出，但可设置在中间图像平面处或附近)、一个或多个楔形元件、和/或一个或多个用来改善光收集和图像形成的反射、折射或衍射元件(例如，镜子或空间光调制器)。由于形成中间图像的光的定向性以及进行图像成像的物镜的数值孔径，通过场旋转模块128旋转图像可能会导致光损失。场透镜可以对该光进行重定向，而不会改变其焦平面。在示例中，场透镜可以定位在场旋转模块的中继透镜组的焦平面处。

而且，根据一个或多个预期实施例，透镜和玻璃元件的各种组合，例如，在图像调节模块130中并入凹透镜和凸透镜的组合，可以用来改善像差、改变放大率和/或改善通过量。例如，即使当由第二模块103和图像形成模块126的组合产生的放大率产生了放大率为1x或接近1x的深度分辨图像时，图像调节模块130也可以产生不为一的放大率。特别地，图像调节模块130(与可选的场旋转模块128一起)可以放大中间1x图像，使得最终图像中的所期望的分辨率对应于检测器的各个像素的尺寸。

图像调节模块130还可以使用其他光学器件或部件，诸如，但不限于，镜子和镜子组合、棱镜、光栅、可变形镜和空间光调制器(SLM)，该空间光调制器可以使光重定向以在指定的位置和取向处形成图像。另选地或另外地，图像形成模块130可以包括一个或多个变焦透镜模块(未示出)。变焦透镜模块还可以允许变更检测模块104的放大率以例如匹配成像模块132的检测器的像素尺寸，从而以所期望的分辨率成像。变焦透镜模块或电透镜可以如此使用以适应聚焦模块108的主物镜的变化，例如，以改变放大率。在这样的配置中，变焦透镜模块或电透镜可以通过移动其上的输入照射光的位置来补偿不同的后孔径(或后焦平面特性)。另选地或另外地，可以通过平移扫描镜(例如，扫描模块116的扫描镜)上的光束来改变后孔径上的输入照射光的位置。

成像调节模块130还可以包括例如可偏移部件，可偏移部件改变物镜(例如，可选场旋转模块128的物镜)以在不同的期望放大率之间改变。因此，代替改变对象处的主物镜(例如，聚焦模块108的物镜)，可以通过简单地致动可移位部件(例如，具有不同放大率的物镜的转塔)而在不同的物镜中进行选择来改变最终图像的放大率。在这样的配置中，能够以相应的方式改变图像形成模块126的放大率，例如，如上所述以维持放大率为一或者接近一的条件。

根据一个或多个预期实施例，成像模块132可以包括各种类型的检测元件和/或配置。在一些实施例中，成像模块132可以包括具有二维检测元件阵列的高速(例如，至少1MHz像素速率，例如，300MHz)相机，诸如，CMOS成像器、sCMOS成像器或CCD成像器。另选地或另外地，成像模块132可以包括检测元件的线性阵列。在一些实施例中，成像模块132可以包括高灵敏度检测元件(诸如，光电倍增管、雪崩(avalanche)光电二极管或单光子雪崩二极管)的线性阵列或二维阵列。另选地或另外地，成像模块132可以包括一个或多个波导(例如，光纤)或导管，其将光引导到一系列单独的检测器或检测器元件阵列。

可以提供控制模块150，用于处理由成像模块132检测到的图像和/或用于协调系统100的操作。例如，控制模块150可以诸如通过扫描来自激光器的光束或者通过控制空间光调制器(SLM)，来控制照射模块102以形成输入照射134。另选地或另外地，控制模块150可以控制来自照射模块102的照射定时或照射模块102中的波长选择以例如调制照射来形成结构化照射。另选地或另外地，控制模块150可以控制扫描模块116以实现对象内的平面照射光束的扫描。控制模块150还可以控制解扫描模块118进行对检测到的光138的解扫描的同步。另选地，扫描模块116和解扫描模块118可以是相同的(例如，扫描/解扫描模块114)，并且控制模块150可以控制模块114以提供同时的扫描和解扫描。

在一个或多个预期实施例中，控制模块150可以配置成移动对象106(例如，经由机动载物台)和/或聚焦模块108(例如，主物镜)。在这样的配置中，可以从多个方向或多侧按顺序照射对象106，以提供更多的各向同性分辨率。

控制模块150可以进一步配置成基于成像模块132检测到的光以及在相应的检测期间扫描模块116和解扫描模块118的角度，构建一个或多个图像(例如，二维图像或将多个二维图像组合成三维图像)。另选地或另外地，控制模块150可以校正照射平面光束137在对象内的实际位置。例如，控制模块150可以使用来自扫描模块116和解扫描模块118的反馈信号，以确定照射光和检测到的光的实际角度和位置，以及系统100的光学器件和/或部件的模型。另选地或另外地，控制模块150可以配置成控制系统100以执行双光子成像、光学相干断层扫描(OCT)、结构化照射成像、受激发射损耗或任何其他成像模态。

控制模块150还可以配置成对图像进行进一步处理。特别地，控制模块150可以应用许多不同的分析和图像校正策略来改善例如分辨率、对比度和空间线性度。在一个或多个实施例中，成像几何结构(包括第一至第三模块102至104的各个模块的光学器件和部件)可以建模成将在扫描期间检测到的检测元素(例如，相机的像素)映射到物平面处的三维笛卡尔空间。该模型可以由控制模块150存储并用于生成预测的空间变化点扩散函数(PSF)，以便对所得数据进行完全去卷积，这可以改善所得图像的分辨率和分层。另选地或另外地，可以从数据集或使用标准物(例如，具有荧光珠的虚影)的表格标定(form calibration)来估计PSF，或者使用自动算法估计PSF。PSF的估计可以在转换到笛卡尔空间之前或之后进行。控制模块150的去卷积可以在侧向偏移调整之前或者侧向偏移调整之后应用，如下所述。

另选地或另外地，光传播的辐射传输型模型可以由控制模块150存储并且用于进一步校正光(例如，照射平面光束137和/或检测光138)的散射的影响，以重建校正后图像，这类似于层状光学断层扫描(LOT)或漫射光学断层扫描。

另选地或另外地，控制模块150还可以配置成例如通过在编译对象106的三维模型时对每个图像应用侧向偏移调整，而对图像进行处理。由于照射角度，将获取的图像堆叠成简单的立方体不会校正歪斜。换言之，在照射平面光束137的单个扫描位置处获取的每个深度层相对于上一层侧向偏移，这种偏移取决于照射平面光束137相对于光轴139的角度。控制系统150可以通过例如在一个或多个维度中对每个层进行侧向偏移，可选地利用非整数偏移插值法，解决这种歪斜。偏移量可以通过模拟、从所得图像进行估计、和/或使用物体校准进行确定，并且由控制模块150存储。在实施例中，将偏斜图像重新整形到笛卡尔坐标可以是基于模型进行的，或者通过应用侧向偏移调整来进行近似处理。

另选地或另外地，控制模块150可以配置成采用漫反射背景减法。为了补偿任何不期望的散射，系统100可以采用例如双光子成像(例如，使用较长波长的激发，这减少了激发光的散射并且由于双光子效应的非线性而产生较窄的平面光束)、结构化照射(例如，通过适当操纵一次照射源122和所得到的检测方案)、受激发射损耗(STED)成像(例如，通过选择性地对特定区域中的荧光团进行去活化，同时使中心焦点活跃以在对象中发射荧光)、HiLo成像(例如，通过利用均匀和结构化的照射获取连续图像，并且借助融合来自两个图像的高、低空间频率信息来合成单个图像)、高通滤光(例如，以突出较高分辨率的结构)、低通滤光(例如，以从图像中减去低通滤光数据来突出较高分辨率的结构)、时空识别(例如，通过区分具有不同时间波动模式的特征，类似于光活化定位显微镜术(PALM)到随机光学重建显微镜术(STORM))、通过提取图像中的动态变化的数学校正和/或使用漫反射背景减法的数学校正。例如，控制模块150可以识别所获得的每个连续图像中的共同图案，该共同图案在扫描期间可能会侧向偏移。可以从每个图像(例如，后续获得的图像)偏移、扩展和减去共同图案，以隔离每个测量之间的对应于选择性对象平面的差异。

在一些实施例中，系统100可以设置有可选的二次照射源124。例如，二次照射源124可以用来独立于一次照射源122或者与来自一次照射源122的光相结合地提供对对象的光学处理、受激发射损耗(STED)或者任何其他所期望的效果。二次照射源124可以设置有其他光学器件或部件(未示出)，以操纵来自源124的光(例如，光束转向或整形)，从而提供所期望的照射效果。例如，二次照射源124可以设置有空间光调制器(SLM)、光束转向镜或光学器件、声光偏转器、相位板、自适应光学器件或任何其他光学部件，以实现所期望的效果。控制模块150还可以结合系统100的其他模块102至104来控制二次照射源124的操作。

在一些配置(例如，光学处理配置)中，来自源124的二次照射可以直接提供给聚焦模块108(例如，沿着光束路径136a)，用于照射对象106，从而绕过第二模块103的其他模块。从简单地将激光聚焦在聚焦模块的焦平面上到利用检流计镜、声光扫描仪、MEM扫描仪、DLP设备或SLM进行扫描，光学操纵光(photo-manipulation light)可以由任何光束整形光学部件产生。例如，可以使用SLM生成光学处理的任意三维图案，该图案可以在成像期间动态变更。光学处理可以包括，但不限于，细胞的光遗传激发或抑制、光学镊除、光凝固、光漂白、光学诱导的细胞死亡或损伤(即，光栓疗法)、用于从微米颗粒或纳米颗粒进行光致释放的光学空化、光解笼锁(photo-uncaging)、燃烧、活性氧类生成或使用电磁辐射的任何其他处理。

另选地或另外地，来自源124的二次照射可以沿着完全相同或部分相同的路径或相邻路径，通过第二模块103传播到一次照射的路径或相邻路径。例如，在STED配置中，来自源124的二次照射可以沿着路径136b定向至第二模块103的输入端，并且沿着与输入平面照射光束134类似的光束路径行进到对象106。STED是一种超分辨率技术，其采用受激发射损耗来减小衍射极限光斑或平面的尺寸。在实施例中，STED可以通过对准二次光源124以产生围绕、限制或邻近一次照射的光束来实现。因此，对于点扫描，可以在一次照射的焦点周围产生二次照射的环形束斑。对于线扫描，可以在一次线照射周围提供拉伸的环形形状的二次照射。对于平面光束扫描，可以在一次照射平面照射光束的两侧提供二次照射的两个平面光束。根据一个或多个预期实施例，用于一次和二次照射的其他配置也是可能的。根据一个或多个预期实施例，除了用于光学处理和STED之外的二次照射源的配置和使用也是可能的。

尽管已经在图1中示出了某些特征，但是应当理解，根据一个或多个预期实施例，可以将附加特征添加到具体示出的那些特征。另外，还应当理解，可以根据一个或多个预期实施例，省略、替换或修改某些特征。虽然已经在图1中示出了特征的特定顺序和配置，但是所公开的主题的实施例不限于此。而是，可以根据一个或多个预期实施例对特征进行重新排序，以实现不同的配置。例如，扫描模块116和解扫描模块118可以定位在分离模块112和望远镜模块110之间的光学路径中，而不是定位在照射和检测模块102、104与分离模块112之间，如图1所示。对于本领域普通技术人员而言，图1中示出的特征和模块的其他重新布置和重新配置将是显而易见的，并且落入本公开的范围内。

而且，根据各个实施例，系统100可以体现为许多不同的配置。例如，系统100可以配置成显微镜系统，其中聚焦模块108提供一个或多个显微镜物镜，用于对由显微镜载物台保持的对象106进行成像。在另一个示例中，系统100可以配置成宏观(即，无放大率)成像系统，其中聚焦模块108提供一个或多个高数值孔径聚焦透镜用于对对象进行成像。在又一个示例中，系统100可以针对某些应用进行小型化(例如，通过采用微制造的部件，例如使用微机电系统(MEMS)设备和/或小型化成像器(例如，半导体芯片成像器)和/或小型化光源(例如，激光二极管或发光二极管(LEDS))。例如，光学部件可以包含在内窥镜中，用于对生物体内部的结构进行成像，其中由系统获取的光由内窥镜内的检测器进行处理，或者通过例如一根或多根光纤被引导至远程检测器(诸如PMT阵列)。

在一个或多个实施例中，可以使用线性检测器执行深度分辨成像。在这些配置中，可以扫描线光束(窄光束)而不是扫描平面光束。这种配置在图2中示出，并且例如对于双光子成像尤其有用。激发光源202(例如，脉冲近红外激光源)生成激发光束201，该激发光束201可以穿过孔径204并且在穿过二向色分束器208之后入射在第一扫描镜206上。第一扫描镜206可以配置成在侧向Y维度上扫掠。所得到的照射线可以定向至第二扫描镜210。第二扫描镜210可以配置成在扫描维度上(例如，在X-Z平面中)对照射进行扫掠。所得到的扫描光束可以通过由透镜212、214形成的望远镜映射到物镜216的后焦平面上，并且聚焦到对象中以形成照射光束220。发射光222(例如，通过2个或更多个光子在对象内激发荧光团而生成的400至500nm范围内的荧光)可以由物镜216捕获，并通过由透镜212、214形成的望远镜映射到第二扫描镜210上。扫描镜210和206对发射光进行解扫描并将其定向到分束器208。

在通过镜206和210进行解扫描之后，图像光被分束器208反射，然后检测到的光通过由透镜224、226形成的另一个望远镜映射到成像物镜228上，以形成与光轴形成一角度的中间图像平面230，这与上述其他实施例类似。然后，中间图像平面230可以通过透镜232和透镜238聚焦(和/或滤光，例如，通过发射滤光片236)到线性检测器240的像素上。请注意，与上述实施例中的一些实施例相反，检测器240是线性检测器阵列，而不是二维成像阵列。在这种情况下，中间图像平面230处的图像是对角照射光束220在Z-X平面中的线性映射，在Z-X平面中，物镜216捕获双光子发射光222。镜206和210的扫描和解扫描横穿对象区域的体积。在一些实施例中，线性检测器240是光电倍增管元件阵列。在一些实施例中，线性检测器240是光电二极管阵列。由线性检测器240的每个元件生成的信号对应于给定线扫描的对象内的深度。

图3显示了成像系统的另一个实施例，该成像系统对线(其在深度方向上穿透样本)进行扫描并进行解扫描，以实现对来自被扫描线的返回光的深度分辨点测量，其中通过具有用于高帧速率和高灵敏度的各种特征的线性阵列392的多个光电倍增器单元进行了多次点测量。激光器300生成近红外(NIR)光的脉冲光束，该光束由镜315引导通过二向色分束器320，使得其由检流计镜对325a进行扫描。检流计镜对325a进行操作以在样本345中横向地(side to side)以及朝向和远离主物镜光轴扫掠所得到的笔形光束342a，以扫掠通过样本中的体积。因此，第一扫掠方向在附图的平面之外。请注意，在备选实施例中，代替使用检流计镜对325a，可以使用能够在两个不同轴上移动的单个检流计镜。NIR笔形光束342a激发样本345中的双光子荧光(例如，绿光)。

在笔形光束被检流计镜对325a扫描和解扫描时，高带宽线性检测器阵列392(诸如具有光电倍增器元件(例如十个元件)的高带宽线性检测器阵列)接收深度分辨光。经由检流计镜对325a利用第一物镜340和透镜332和331捕获图像，检流计镜对325a对图像进行解扫描，从而维持样本中高带宽线性检测器阵列392上的照射水平线。另外的透镜351和355与第二物镜360组合形成中间图像平面370，该中间图像平面370由第三物镜380成像，并在穿过滤光片381之后由透镜382投射到高带宽线性检测器阵列392上，该滤光片381使较短波长(例如，绿色)穿过并阻挡激发光(例如，NIR)。

尽管显示了一种用于图像旋转的机构，但是可以代替使用本文描述的任何机构。高带宽线性检测器阵列392的每个检测器接收来自样本中不同深度的光。每道光可以由时钟并行的单独信号通道处理，以增加通过量和扫描速度。另外，可以提供独立选择的增益，以允许针对完整线性深度分辨“图像”的每个深度优化接收的变化亮度。也就是说，来自较深深度的光具有较低的强度，并且因此可以以比来自较浅深度的光更高的增益来进行补偿。

图4描绘了与图3实施例类似的另一个实施例，但是增加了光束整形。在该实施例中，光源400生成输出光束。在一些优选实施例中，光源400是脉冲近红外(NIR)激光器。脉冲在双光子系统的背景下是有利的，因为它增加了双光子与样本中的荧光团相互作用的可能性。并且NIR优于波长较短的光，因为NIR的穿透深度比可见波长更深。在一些实施例中，用于激发的光的波长至少为1μm(例如，1.3μm或1.6μm)。然而，在备选实施例中，也可以使用波长至少为620nm的光。

脉冲NIR激光器400的输出通过光束整形光学器件410进行路由。光束整形光学器件410将光源400生成的输出光束整形为激发光的贝塞尔光束形光束。可以使用用于生成激发光的贝塞尔光束形光束的各种方法中的任何一种。例如，在一些实施例中，光束整形光学器件可以通过使用轴棱锥透镜聚焦高斯(Gaussian)光束来产生贝塞尔-高斯光束。在其他实施例中，光束整形光学器件可以使用备选方法(例如，使用轴对称衍射光栅，通过使用静态相位板或SLM，或者通过在远场中放置窄环形孔径)操作。

相关领域的技术人员可以很容易地设想用于将光源400的输出光束整形为贝塞尔光束形的激发光光束的各种备选方法。例如，可以使用相位调制器(例如，SLM)和傅里叶变换透镜来生成环形光束轮廓，接着通过空间滤光片来净化傅立叶平面处的环形光束轮廓。随后，使光穿过望远镜(例如，由两个凸透镜形成)，该望远镜将环形光束(经由中间部件)成像到以下描述的扫描元件425上。在这些实施例中，偏心环形光最终成像到第一物镜的后焦平面，以使出射光束440偏斜。

由光束整形光学器件410整形的激发光的光束进入分束器420(例如，二向色分束器)，并且入射光束由分束器420朝向扫描元件425反射。扫描元件425扫描激发光光束并且还将该光束重新路由至激发臂中。在一些实施例中，扫描元件425包括具有两个自由度的快速移动的检流计镜，该检流计镜提供XY扫描。在备选实施例中，扫描元件425可以使用快速移动的棱镜或包括MEMS光导、SLM等的多种备选设计中的任一种来实现，这些备选设计对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。在备选实施例中，代替使用单个检流计镜或者以两个自由度移动的单个棱镜，可以组合一对检流计镜或一对棱镜(每一个均以单个自由度移动)以获得类似的结果。

在通过扫描元件425重新路由之后，光束通过第一组光学部件(例如，透镜431、432和第一物镜440)在从近侧到远侧的方向上继续沿着激发臂向下。然后，光束以倾斜角度进入组织样本445，以沿着Z轴穿透组织样本，而产生光束442。当扫描元件425移动时(例如，由于扫描元件425的运动)，它致使光束442在样本内的位置平移。因此，激发光光束在样本内的位置依据扫描元件425的取向而变化。扫描元件425提供光的二维扫描，并且控制扫描元件425的取向，以使线形激发光光束的位置扫掠出样本445内的三维体积(其中深度方向通过线形激发光光束442传播通过样本而提供)。

在一些实施例中，光束腰部的位置可以上下扫掠，以增加光束最窄部分的范围。这可以和检测同步完成以提供更好的分层，或者可以足够快地完成以随时间推移进行效果平均。这可以使用可电调谐透镜来变更光束的发散，从而改变焦深(光束腰部位置)。

由多个轴向定位的贝塞尔光束(或类似物)组成的光束(例如，一个浅，一个中间和一个深)可以提供比一个长光束更好的分辨率性能。这可以使用一个或多个SLM并且然后合并输入光束以生成一个较细的长光束来实现。可以使用SLM生成贝塞尔图案，然后可以将该光束分开，发散引入到一个或多个光束，并且然后可以将光束重新合并。

激发光的线形光束442在样本445中激发双光子荧光，并且对源自被照射区域的荧光进行成像。值得注意的是，由于双光子荧光的性质，检测光的波长将短于激发光的波长。这还可以生成二次谐波发生光、来自上转换的光(例如，来自基于镧系元素的纳米颗粒，其甚至可以具有CW光源的非线性激发特性)或拉曼散射相关的相互作用。图像对比可以通过内在荧光，或通过引入荧光标记、微珠、染料和其他物质来提供。

检测光从样本到检测器的路径首先在从远侧到近侧的方向上穿过第一组光学部件431至440，并且返回到扫描元件425。从扫描元件，检测光穿过二向色分束器420，并且进入检测臂。检测臂包括第二组光学部件(例如，透镜451、455和第二物镜460)。检测光在从近侧到远侧的方向上穿过这些部件451至460，并且形成中间图像平面470。(该中间图像平面470是对在SCAPE的备选实施例中当光片层扫描通过样本时产生的中间图像平面的一维模拟。)请注意，在这些实施例中，因为激发光线被投射到样本中(与激发光的平面相对)并且光束的运动的解扫描是在x和y维度上发生，所以形成了中间图像平面(与中间图像平面相对)。因为激发光光束442以倾斜角度进入样本，所以对应于由光束442照亮的样本的部分的中间图像平面将相对于透镜451、455的光轴偏斜。这种配置的其中一个优点是无论激发光光束442在样本内的位置如何改变，中间图像平面470的位置都保持静止。

在一些实施例中，激发臂中的第一组光学部件431至440与检测臂中的第二组光学部件451至460相匹配。在激发路径和检测路径中均使用相同的扫描元件425。在其他实施例中，通过调整每个臂中的放大率以生成等于样本浸渍介质的折射率除以介质在中间图像平面处的折射率的比率的放大率，可以适应具有不同浸渍介质的物镜。这些配置是有利的，因为它们消除了使用备选方法难以消除的某些光学失真。例如，如果由于检测臂中的第二组光学部件451至460的放大率比激发臂中的第一组光学部件431至440的放大率高得多而导致不符合条件，则偏斜的中间图像平面470处出现的图像可能会失真。然而，在一些情形下，这种失真可能是可接受的或者甚至是期望的(例如，当放大率的差用于减小偏斜的中间图像平面的角度时)。例如，在线性激发光束的情况下，这种失真是可以能够容忍的，因为图像的x和y分辨率主要是由样本处双光子激发光束的质量决定的。唯一将受影响的部分是轴向采样(因为其将在层间重叠)。然而，如果深度平面的数量与传统的SCAPE相比相对较小(例如，如果我们具有30微米而不是更常见的1至2微米的有效平面厚度)，那么这种影响可能是无关紧要的。这样做的好处是将捕获更多的光(用于更高的有效放大率)，或者能够容纳具有比所期望的样本密度更大的元件的检测器(例如，用于在中间图像平面处的直接检测，如下面与图5A和5B相关的描述)。

在一些优选实施例中，每个透镜431是f＝50mm的球面双合透镜；每个透镜432是f＝150mm的球面双合透镜；451为f＝60mm并且455为f＝150mm，第一物镜440为NA＝1的20x水浸渍物镜，其有效焦距为9mm；第二物镜460是NA＝0.75的20x空气物镜，其有效焦距为10；第三物镜480可以变化以为所选检测器提供所期望的放大率。分束器420是710nm的短通二向色镜。在备选实施例中，可以使用Plossl透镜代替单个透镜来获得有效的50mm焦距。在一些实施例中，可以使用椭圆镜代替透镜。可选地，可以包括预调节以解决脉冲激光的光束直径不同的问题。

为了捕获偏斜的中间图像平面470处出现的图像，可以使用各种方法。在图4的实施例中，线性检测器490位于远离中间图像平面的位置，并且光学部件用于(a)将光从中间图像平面470路由至线性阵列490以及(b)提供放大率。更具体地，光学部件480、482用作放大器，其放大图像并将该图像路由至线性光检测器阵列490。该放大器包括第三物镜480和附加的光学部件(例如，透镜482)。可选地，短通滤光片481可以包括在扫描元件425和线性检测器490之间的光路中的某处。该短通滤光片481阻挡激发光(例如，NIR光)波长的光，但使荧光(例如，绿光)波长的光通过。可选地，可以通过沿着线性阵列并排放置图像，或者通过使用两个阵列，来包括用于双色检测的图像分割器。在一些实施例中，光栅或棱镜可用作备选图像分割器。在一些实施例中，可以使用可转向的滤光片或光栅/棱镜与另一个镜子组合，以按顺序将不同发射波长的光定向至线性阵列。在一些实施例中，可以按顺序引入滤光片(例如，布置在滤光轮中)以便依次看到不同的波长。

线性光检测器阵列490捕获偏斜的中间图像平面470的图像。线性光检测器阵列490包括多个光检测元件，并且每个光检测元件对荧光波长敏感。在任何给定瞬间，线性光检测器阵列将同时捕获整条线的图像(其对应于样本内的多个深度)。由于扫描元件425的运动引起线在样本内移动，因此线性阵列490按顺序捕获中间图像平面的多个荧光波长图像，每个荧光波长图像对应于扫描元件425的不同取向。

由检测器490捕获的图像抵达图像处理器/控制器492，图像处理器/控制器492使用各种公知技术中的任何一种来处理那些图像。图像处理器/控制器492还为整个系统提供控制功能，包括生成控制扫描元件425的二维图案的信号。另外，图像处理器/控制器492基于用户界面494从用户接收的命令，从用户界面494接收信号。用户界面494还基于源自图像处理器/控制器492的数据向用户提供反馈。

在一些实施例中，线性光检测器阵列包括sCMOS相机芯片上的元件的线性阵列。在变型中，可以使用与侧向像素一样多的深度(例如，sCMOS相机上成像800个深度)。可选地，可以使用额外的行来实现线的去卷积，以增强分辨率和信噪比。

在备选实施例中，线性光检测器阵列490包括光电二极管的线性阵列。在备选实施例中，线性光检测器阵列490包括光电倍增管(PMT)元件的线性阵列。由于PMT阵列的灵敏度和速度较高，这可以实现较高速度的读出。在备选实施例中，系统还可以使用一排光纤作为高速检测器的尾纤。

线性阵列490内的每个检测器元件对应于样本内的深度平面(或深度范围)。采样率等于标准x-y扫描所需的采样率。与典型的相机型检测器阵列相比，PMT允许高时域带宽并允许快速的读出时间。例如，对于具有标准点激发的1MHz像素速率，可以以每秒25帧的速率对单个200×200平面成像。通过以该速率读出N个检测器/深度像素中的每一个，可以以25FPS(以及25VPS的体积速率)并行地对N个平面成像。在具有PMT的实施例中，甚至有6个检测器(深度)，这将是对现有技术的状态(例如，点扫描双光子显微镜，其必须进行深度扫描并伴随较慢的体积捕获或较短的像素积分时间)的显著改进。

在该图4的实施例中(以及还在下面描述的图5至7的实施例中)，扫描元件425与第一物镜440的后焦平面和第二物镜460共轭。通过该过程可以提供有效的激发光束数值孔径(例如，～0.04)。通过使第一物镜440的后焦平面处的光束偏心，使得双光子线激发倾斜。由于X-Y扫描元件425的解扫描，双光子荧光发射(形成线)的图像在第二物镜460之后是静态的；通过移动扫描元件425(例如，以X-Y图案或以不同图案)使激发线442扫掠通过样本来获取图像。可以使用标准共焦/双光子显微镜中已知的技术使线扫掠通过样本。然而，在本文描述的实施例的上下文中，每个检流计位置捕获多个深度，因此单个x-y扫描图案对样本体积进行成像。

在该图4的实施例中，与高斯光束激发相比，贝塞尔光束激发将允许具有较小光束腰部的大焦深，并因此改善图像分辨率。双光子贝塞尔激发也会抑制贝塞尔旁瓣，从而增强x-y分辨率。

光学狭缝468可以位于扫描元件425和线性阵列490之间的图像平面处的检测光的光学路径中。可选地，光学狭缝468可以是可切换的或者可调整的。狭缝468可以有利地消除进入检测器阵列的光，从而提高分辨率，这种光不直接源自组织中的激发线。在所示的配置中，光学狭缝468恰好位于中间图像平面470之前。但是在备选实施例中，光学狭缝468可以位于沿着扫描元件425和线性阵列490之间的检测光的光学路径的其他点处(例如，在透镜451和455之间；或者恰好在线性阵列490之前)。

在备选实施例中，代替使用贝塞尔光束形激发光束，使用了具有备选形状的激发光束。示例包括但不限于一系列不同深度的光斑、设计用于提供目标位置(例如，在活体内)的光遗传刺激的定制三维图案、对高斯光束的改进、以及整形为使表面处的激发最小化的光束等。这些备选形状可以例如使用SLM生成。可选地，当激发光束是不同深度处的一系列光斑时，该系列的间隔可以是可调整的，以促进形成光遗传刺激的三维图案。

图4中描绘的实施例依赖于第三组光学部件480至482来将偏斜的中间图像平面470旋转到检测器490上。但是由于光学部件相对于第二组光学部件451至460的光轴以相当大的角度定位，因此相当大的光量会损失，并且从不进入第三物镜480。作为依赖于第三组光学部件480至482进行旋转的备选方案，一些备选实施例使用与第二组光学部件451至460的光轴对准的相位调制元件(例如，SLM)，并且将检测器定位在与相同光轴对齐的相位调制元件之外。相位调制元件引入了受控像差，以便当在检测器处测量时，使焦平面处、上方和下方的点的点扩散函数均匀化。利用这种配置，离开第二组光学部件的大部分光将抵达检测器，这可以改善信噪比。

有利地，图4的实施例在任何给定瞬间都获取具有深度方向的完整像素线。与其中只能在任何给定时刻对单个深度进行成像的竞争技术相比，这提供了显著的速度优势。因为被成像的对象要么移动(例如，在心脏的情况下)，要么至少容易移动，所以该速度优势对于体内成像特别有用。

值得注意的是，因为图4的实施例在轴向(z)维度上延伸了照射光，所以通过提供多个机会用于使光子与荧光团相互作用并且更好地保持时间相干性，它需要的激光功率比竞争技术(例如，点扫描双光子)更少。图4的实施例还提供了对“轴向延伸的”双光子方法的显著改进，这些方法使用在x和y中扫描的轴向延伸的贝塞尔光束，获取所得发射光的总和来产生平均强度折叠二维堆。这是因为总和Bessel成像不提供三维深度辨别。相反，图4的实施例提供真正的三维深度分辨图像，甚至在密集标记的哺乳动物大脑中也是如此。

在图4的实施例中，如果信号的相对深度进行空间编码，则不需要复杂的深度编码策略。通过以倾斜角度偏斜照射光束并利用解扫描，这些实施例将该扩展光束的静止图像创建到线性检测器阵列上，即使在样本处以x和y扫描光束时也是如此。值得注意的是，在线性阵列的一侧检测到的信号将来自深层组织，而另一侧的信号表示浅层组织。这些信号可以并行读出，从而与其他信号实现2D平面x-y成像相同的速度提供多深度成像。并且不需要物镜或样本的z平移、图像重建或解混来生成完整的三维图像。

结果，图4的实施例可以以视频速率实现大脑的深度分辨双光子成像，并且可以在以每秒10个体积(VPS)成像64个深度的假设下，实现以下参数：x-y像素速率(所有深度)为1MHz；10VPS(典型值)下的样本体积像素(x-y-z)为316×316×64；衍射极限x-y分辨率<2微米；采样轴向分辨率为5至20微米；成像深度>500微米；和成像深度范围为160至400微米。在备选实施例中，以10VPS在至少256×256×8的分辨率(分别在X、Y和Z方向上)下捕获图像。优选的是，在该配置中确保返回光(和激发光)的高效透射以使SNR最大化。

与SCAPE的其他实施例不同，图4的实施例使用x-y扫描的笔形光束而不是扫描的光片层。这种扫描方法具有多个益处，特别是在双光子激发的情况下。一个益处是照射轴向延伸的贝塞尔光束所需的激光功率远低于形成双光子光片层所需的激光功率。使用标准双光子激光器可以实现以10Hz的体积速率成像。除了“重新使用光子”之外，与轴向延伸的光束并行成像所有深度的另一个优点是积分时间优势：以10VPS对300×300×64体积进行点扫描将允许每个像素仅为17ns(一个80MHz激光脉冲)，而图4的实施例对于相同的体积速率将在每个体素1.1μs(90个脉冲)的条件下对信号积分。

另一个益处是笔形光束的XY扫描允许使用贝塞尔光束，贝塞尔光束的特殊特性包括应使穿透最大化的长景深和光束治疗(beam-healing)。可选地，可以使用空间光调制器(SLM)提供定制的光束形状，以为较深层组织提供较亮的照射，对像差提供波前校正，以及在不同的轴向范围(例如，在整个400μm范围内，或在300μm的深度处在150μm范围内)上改变焦点。在备选实施例中，可以使用沿着轴向范围在不同深度处形成离散照射点来区分信号与体积内的较窄轴向平面，其将依次被成像到单个检测器元件。

又一个益处涉及散射效应。与宽场方法相比，图4的实施例可以通过影响两个特性来克服发射光散射。首先，在任何时间点，光束仅照射组织中的窄轴向线，从而将激发仅限制到该线(借助于双光子效应的非线性)。因此，从组织中出射的光的散射将仅影响轴向分辨率。其次，解扫描几何结构进一步使得能够使用非常像共焦针孔的狭缝468，狭缝468可以限制对来自组织中的被照射线的光的检测，这是对竞争性“宽场”双光子方法的一种改进。

又一个益处是图4的实施例实现了三维成像，而没有物镜透镜或样本的物理z平移。除了标准的每秒4000行的检流计扫描之外，每秒10个体积(VPS)的成像不需要机械运动。这个益处对于研究清醒的有行为表现的生物体而言特别重要。它还可以避开清醒的有行为表现的动物中的运动伪影，因为完整的三维体积被快速采样，从而实现三维配准并避免二维平面的结构损失。

可选地，可以将形成通过物镜的倾斜光束对失真和像差进行波前校正并入图4的实施例中。可选地，可以调节激发光光束，以在较深的深度处传递较高的峰值强度以对抗衰减。

尽管80MHz Ti：蓝宝石激光器可能足以用于图4的实施例，但较低的激光重复速率可以显著改善双光子信号。例如，通过将重复速率从80MHz降低到1MHz，每个脉冲中的光子数可以增加80倍，这将对实现大量双光子激发的几率产生显著影响。

图5A类似于上述图4的实施例，不同之处在于，代替将线性检测器490置于远离中间图像平面的位置，图5A的实施例中的线性阵列590位于与中间图像平面470重合的位置。该方法也可以在使用二维相机图像传感器的线性部分时完成。该方法可以捕获更多的光，但是，如本领域技术人员将观察到的，依据上游光学器件，该方法可能会遭受一些像差，诸如色差。图5A的实施例与上面讨论的图4实施例的优点相同。

当检测器元件间隔得足够靠近，使得由第一组光学部件431至440和第二组光学部件451至460提供的放大率在中间图像平面470处产生提供合理的分辨率的图像时，将线性阵列590定位成与中间图像平面470重合的效果最佳。例如，如果10个检测器元件以50μm的间距间隔开，那么在中间图像平面470处产生的跨度将是0.5mm。

如果检测器元件的间距明显较大(例如，1mm)，那么如果将线性检测器590移动到不同位置，则仍然可以使用直接入射到线性检测器590上的概念。例如，如果将线性检测器590移动到透镜451和455之间的位置(相对于透镜451和455之间的光轴显著偏斜)，则用焦距较短的透镜替换透镜451以缩小所得到的图像平面，并因此减小其偏斜以匹配检测器元件的间距，并且去除在远侧超出透镜451之外的所有部件，我们最终得到图5B中所示的配置。

在图5B的实施例中，线性检测器590将能够捕获在远侧出现在透镜451’之外的不完美图像。可选地，可以使用相位板、SLM或其他方法将该图像尽可能地平整到线性检测器590上。尽管该图像将包含显著的像差，但这可能不成问题，特别是当深度方向上的分辨率低时(例如，深度方向上为8或16个大像素)。在备选实施例中，代替将实施例中的线性检测器590以相对于透镜451’的光轴显著偏斜定位(如图5B中所示)，线性检测器590可以垂直于该轴定位。并且尽管该定位可能会增加像差，但是当深度方向上的分辨率足够低时(例如，深度方向上为6或8个像素)，这些像差可能是不成问题的。

图6与图4的实施例类似，不同之处在于，代替经由图4的分束器420(其设置在第二组光学部件451至460的近端和扫描元件425之间)将激发光光束引入到系统中，省略了分束器，并且通过经由第二物镜460注入光束，将激发光光束引入到系统中，使得光束在从远侧到近侧的方向上穿过第二组光学部件451至460。

图6中描绘了实现其的一种方法，该方法使用光源600，接着是贝塞尔整形光学器件610来形成激发光光束。该图6的实施例中的光源600和光束整形光学器件610的操作类似于上述图4的实施例中的相应部件400、410。然后将激发光光束引入到第四物镜620。激发光光束穿过第四物镜620并进入第二组光学元件451至460的远端。然后激发光光束在从远侧到近侧的方向上穿过第二组光学部件451至460，直到其到达扫描元件425。随后，该图6的实施例的操作类似于上述图4的实施例的操作。然而，在该实施例中，可调整狭缝可能必须重新定位到远离中间图像平面170的位置。例如，狭缝668可以恰好位于线性检测器490之前。图6的实施例具有上面讨论的图4实施例的优点。但是另外，如图6所示，将激发光光束引入系统可能也有助于在优化波长相关的通过量之后减少像差。

图7类似于图4的实施例，不同之处在于，图7的实施例添加了非成像检测器710，其定位成检测以其他形式损失的光。更具体地，穿过固定的偏斜中间图像平面的返回光的第一部分到达图像传感器490，如上面结合图4所述。返回光的第二部分到达非成像光检测器710。可以使用来自非成像检测器710的信号形成没有深度分辨率的平面图像，其中，由成像检测器490通过沿着激发光束的长度对光进行成像来分辨深度。然后可以组合来自由非成像光检测器710和成像传感器490接收的光的信号，以增强返回光在由从成像传感器490接收的信号指示的组织中的分布的三维表示。在一些实施例中，该增强包括响应于沿着由三维表示指示的非深度轴的变化，调整在检测的三维分布中的总变化，由此降低三维表示中的信噪比。可选地，响应于来自非成像检测器710和成像传感器490的信号，可以在显示器上同时输出平面图像和三维表示。图7的实施例提供了这些优点以及上面讨论的图4实施例的优点。

在上述任何双光子实施例中，在近红外波长处减少的散射使得双光子激光扫描显微镜术(2PLSM)能够更深地成像到散射生物组织中。与2PLSM的传统点扫描实现方式(其受到慢速体积成像速率的限制)相反，本文描述的架构有助于在活体内(包括，例如，清醒的有行为表现的小鼠或狨猴大脑)捕获快速的三维动态。独特的单物镜几何结构和扫描-解扫描方法可以使被照射平面快速移动通过样本，而无需物镜或样本进行物理平移。请注意，在上述双光子实施例中，所有透镜优选地被选择/涂覆以解决NIR和可见光的共同透射问题。还请注意，上述技术可以扩展到3-光子激发、SHG、拉曼、上转换(up-conversion)等。

在上述任何双光子实施例中，检测器490可以由两个或更多个检测器以及位于那些检测器之前的波长相关分束器所代替。波长相关分束器配置成将各个不同波长的光定向至到相应的检测器。当激发光束激发多光谱荧光时，这种配置是有用的，在这种情况下，每个相应的检测器将响应不同波长的荧光。

与单光子实施例相比，上述双光子实施例能够提供延伸的穿透深度和改善的背景抑制和对比度。请注意，在上述所有双光子实施例中，双光子激发的概率非常低，并且激发的荧光依赖于光强度的二次方。可以使用包括但不限于利用图案化激发和新型脉冲激光源的传统技术，以增加双光子激发荧光的速率。

在本发明的范围内，可以对所公开的实施例的特征进行组合、重新布置、省略等，以产生附加实施例。此外，有时可以有利地使用某些特征，而无需对应地使用其他特征。因此，显而易见的是，根据本公开提供了成像设备、方法和系统。本公开实现了许多备选方案、修改和变型。虽然已经详细示出和描述了具体实施例来说明本发明原理的应用，但是应当理解，在不脱离这些原理的情况下，本发明可以以其他方式实施。因而，申请人旨在涵盖处于本发明的精神和范围内的所有这些备选方案、修改、等同方案和变型。

根据实施例，所公开的主题包括具有图像阵列的成像装置，该图像阵列具有光电检测器阵列。成像光学器件位于样本空间和图像阵列之间，以将来自样本空间的光成像到图像阵列上。成像光学器件具有物镜，通过该物镜接收来自样本空间的光，并且激发光通过该物镜由光束投射器沿着光束路径投射，使得由激发光生成的二次光被传送到图像阵列。成像光学器件布置成将来自沿着光束路径的相应间隔的二次光传送到光电检测器中的每一个。光束投射器和成像光学器件包括扫描元件和解扫描元件，扫描元件和解扫描元件由可编程的扫描控制器控制，并且横向扫掠通过样本空间的光束路径。解扫描元件的控制对于维持图像阵列上的样本区域的图像是有效的。读出控制器，其对来自光电检测器的信号进行采样以划分对光束路径的每次扫掠，从而从每个光电检测器中产生沿着与光束路径正交的相应轴产生的像素阵列，使得每个像素对应于样本空间的层。对应于每个像素阵列的空间分辨率比每个层的厚度高出多倍，该厚度对应于沿着光束路径的相应间隔。

在前述成像装置的变型中，将读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成10次扫描。

在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，将读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成20次扫描。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，将读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成25次扫描。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，激发光限定了笔形光束。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，笔形光束比层的深度窄。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，可编程的图像处理器编程为根据从激发光的一次或多次扫掠获得的一组样本构建三维模型。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，读出控制器连接到图像阵列，以同时对所有光电检测器进行采样。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，激发光的波长是二次光的波长的整数倍。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，光电检测器包括光电倍增管。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，光电检测器包括光电二极管。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，每个光电检测器包括光电二极管阵列的相应光电二极管集合体。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，层的数量是6、20、60、100、500或800。

在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，光束投射器包括激发光源和光学部件，所述光学部件布置成将光施加到物镜的后孔径的一部分。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，扫描元件和解扫描元件是由一个或多个马达驱动的移动反射元件的部分。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，扫描元件和解扫描元件由一个或多个电动马达移动。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，激发光从物镜倾斜射出，物镜的有效数值孔径小于物镜的标称数值孔径，这是由于激发光未充满物镜的后孔径。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，有效数值孔径小于0.1。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，有效数值孔径小于0.05。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，通过物镜从激发光形成的光束是笔形光束。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，物镜具有光轴，并且笔形光束在其扫掠期间在至少一个点处相对于光轴倾斜。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，物镜具有光轴，并且笔形光束在其扫掠期间在每一个点处相对于光轴倾斜。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，激发光具有比二次光更长的波长。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，持续多秒地连续重复扫描和解扫描，以生成允许样本体积每秒成像至少10次的数据。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，持续多秒地连续重复扫描和解扫描，以生成允许样本体积每秒成像至少20次的数据。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，持续多秒地连续重复扫描和解扫描，以生成允许样本体积每秒成像至少25次的数据。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，持续多秒地连续重复扫描和解扫描，以生成允许样本体积每秒成像至少50次的数据。

在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，图像阵列是可扩展互补金属-氧化物半导体(sCMOS)相机的一部分。在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，可编程的图像处理器编程为根据从激发光的一次或多次扫掠获得的一组样本构建三维模型，用户界面连接成向图像处理器施加命令，图像处理器编程为选择性地对来自光电检测器的信号进行求和，以允许样本体积中的选定数量的层容许用户通过选择性地损害沿着光束路径的分辨率并响应于从用户界面接收的用户输入来增加扫描和解扫描的速度，而增加来自样本体积的激发光的采样速度。

在前述成像装置中的任一个的另外的变型中，扫描控制器连接成接收来自用户界面的命令，以允许扫描和解扫描的步长还容许选择图像的横向分辨率。

根据实施例，所公开的主题包括具有第一组光学部件的另一种成像装置，该第一组光学组件具有近端和远端，其中，第一组光学部件包括第一物镜，第一物镜设置在第一组光学部件的远端。第二组光学部件具有近端和远端。光源生成具有第一波长的脉冲输出光束。第三组光学部件布置成将由光源生成的输出光束整形为激发光光束，该光束的形状包括波瓣。扫描元件提供光的二维扫描，该扫描元件相对于第一组光学部件的近端设置在近侧，并且相对于第二组光学部件的近端设置在近侧。扫描元件布置成对激发光光束进行路由，使得激发光光束将在从近侧到远侧的方向上穿过第一组光学部件，并且投射到位于第一组光学部件的远端之外的远侧的样本中，其中，激发光光束以倾斜角度投射到样本中，并且其中，激发光光束在依据扫描元件的取向而变化的位置处投射到样本中。第一组光学部件在从远侧到近侧的方向上将来自样本的检测光路由回到扫描元件，其中，检测光具有比第一波长短的第二波长。扫描元件还布置成对经由第一组光学部件到达的检测光进行路由，使得检测光将在从近侧到远侧的方向上穿过第二组光学部件，并且在静止位置处形成中间图像平面，静止位置在第二组光学部件的远端之外的远侧。光检测元件的线性阵列，其中，每一个光检测元件对第二波长敏感，其中，线性阵列布置成捕获中间图像平面的多个第二波长图像，该多个第二波长图像分别对应于扫描元件的多个不同取向或者激发光束的多个不同位置。提供了用于减少由波瓣中的激发光产生的检测光的光量的机构。控制扫描元件的取向以使激发光光束的位置扫掠出样本内的三维体积。

在前述另外的成像装置的另外的变型中，用于减少的机构包括脉冲输出光束的选定波长和瞬时强度。在另外的前述成像装置中的任一个的另外的变型中，用于减少的机构包括光学狭缝，该光学狭缝位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中，该光学狭缝阻挡来自波瓣的图像光和散射光。狭缝还可以提供可以提高分辨率的附加点扩散函数。在一种方法中，提供了另一前述成像装置中的任一个，并且该方法包括：选择脉冲输出光束的波长和瞬时强度，使得来自波瓣的图像光的光量小于从光束的主要部分接收的光的光量的百分之一。前述方法可以是这样的选择，该选择使得从波瓣接收的图像光的光量为零。

在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，第一波长至少为620nm。在另一前述成像装置的任一个的另外的变型中，光学狭缝位于中间图像平面附近。在另一前述成像装置的任一个的另外的变型中，第三组光学部件生成贝塞尔光束或贝塞尔-高斯光束。在另一前述成像装置的任一个的另外的变型中，第三组光学部件通过使用轴棱锥透镜聚焦高斯光束来操作。在另一前述成像装置的任一个的另外的变型中，第三组光学部件包括空间光调制器。在另一前述成像装置的任一个的另外的变型中，线性阵列位于与中间图像平面重合的位置处。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，线性阵列位于远离中间图像平面的位置处，并且其中，成像装置进一步包括光学部件，光学部件布置成(a)将来自中间图像平面的光路由至线性阵列，以及(b)提供放大率。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，波长选择性滤光片位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中，该波长选择性滤光片防止具有第一波长的光到达线性阵列。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，线性阵列的每一个光检测元件包括光电二极管或光电倍增管元件。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，分束器布置成(a)将由第三组光学部件整形的激发光朝向扫描元件路由；以及(b)将从扫描元件到达的检测光路由通过第二组光学部件。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，第二组光学部件包括第二物镜，第二物镜设置在第二组光学部件的远端处。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，提供的光学部件包括第三物镜，该第三物镜布置成将由第三组光学部件整形的激发光路由至第二物镜的远端中，使得激发光将在从远侧到近侧的方向上朝向扫描元件行进通过第二组光学部件。在另一前述成像装置中的任一个的另外的变型中，第一波长至少为1μm。

根据实施例，所公开的主题包括成像方法。该方法包括：以足够的强度将NIR激发光的脉冲贝塞尔光束以倾斜角度投射到样本中，以在样本内诱导荧光的双光子激发。该方法进一步包括：以足以使激发光光束以每秒至少10个体积扫掠通过样本的三维区域的速度，使激发光光束扫描通过样本中的体积，每个体积中的分辨率在X、Y和深度方向上分别为至少256×256×8。该方法进一步包括：将源自激发光光束的位置的荧光成像到中间图像平面上，该中间图像平面在扫描激发光束的情况下保持静止。该方法进一步包括使用光检测元件的线性阵列捕获中间图像平面的多个图像，该多个图像分别对应于多个不同的扫描取向。荧光在到达光检测元件的线性阵列之前穿过光学狭缝。

在包括NIR激发光的前述实施例中的任一个中，NIR激发光可以具有至少为1μm的波长。

根据实施例，所公开的主题包括具有光源的又一成像装置，该光源以第一波长生成激发光的脉冲贝塞尔光束，其中第一波长至少为620nm。光学系统(a)将激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，激发光光束在样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，扫描元件提供光的二维扫描；以及(b)由源自激发光光束的位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止，并且其中，检测光具有比第一波长短的第二波长。提供了光检测元件的线性阵列。每一个光检测元件对第二波长敏感，其中，线性阵列布置成捕获中间图像平面的多个第二波长图像，多个第二波长图像分别对应于扫描元件或激发光束的多个不同取向或位置。光学狭缝位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中。控制扫描元件的取向以使激发光光束的位置扫掠出样本内的三维体积。光学狭缝位于中间图像平面附近。使用空间光调制器生成贝塞尔激发光光束。线性阵列位于与中间图像平面重合的位置处。线性阵列位于远离中间图像平面的位置处，并且其中，成像装置进一步包括光学部件，该光学部件布置成(a)将来自中间图像平面的光路由至线性阵列，以及(b)提供放大率。

在还另外的前述成像装置中的任一个的另外的变型中，波长选择性滤光片位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中，该波长选择性滤光片防止具有第一波长的光到达线性阵列。在还另外的前述成像装置中的任一个的另外的变型中，线性阵列的每一个光检测元件包括光电二极管或光电倍增管元件。在还另外的前述成像装置的另外的变型中，第一波长至少为1μm。

根据附加实施例，所公开的主题包括具有第一组光学部件的成像装置，该第一组光学部件具有近端和远端，其中，第一组光学部件包括第一物镜，第一物镜设置在第一组光学部件的远端。第二组光学部件具有近端和远端。光源生成具有第一波长的脉冲输出光束，其中，第一波长至少为620nm。第三组光学部件布置成将由光源生成的输出光束整形为激发光的贝塞尔光束形光束。扫描元件提供光的二维扫描，扫描元件相对于第一组光学部件的近端设置在近侧，并且相对于第二组光学部件的近端设置在近侧。扫描元件布置成对激发光光束进行路由，使得激发光光束将在从近侧到远侧的方向上穿过第一组光学部件，并且投射到位于第一组光学部件的远端之外的远侧的样本中，其中，激发光光束以倾斜角度投射到样本中，并且其中，激发光光束在依据扫描元件的取向而变化的位置处投射到样本中。第一组光学部件在从远侧到近侧的方向上将来自样本的检测光路由回到扫描元件，其中，检测光具有比第一波长短的第二波长。扫描元件还布置成对经由第一组光学部件到达的检测光进行路由，使得检测光将在从近侧到远侧的方向上穿过第二组光学部件，并且在静止位置处形成中间图像平面，静止位置在第二组光学部件的远端之外的远侧。提供了光检测元件的线性阵列，其中，每一个光检测元件对第二波长敏感，其中，线性阵列布置成捕获中间图像平面的多个第二波长图像，该多个第二波长图像分别对应于扫描元件的多个不同位置和/或取向或者激发光束的多个不同位置和/或取向。光学狭缝位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中。控制扫描元件的取向以使激发光光束的位置扫掠出样本内的三维体积。

在附加实施例的变型中，狭缝位于中间图像平面附近。在附加实施例的变型中，第三组光学部件生成贝塞尔-高斯光束，并通过使用轴棱锥透镜聚焦高斯光束来操作。在附加实施例的变型中，第三组光学部件包括空间光调制器。在附加实施例的变型中，线性阵列位于与中间图像平面重合的位置处。

在附加实施例的变型中，线性阵列位于远离中间图像平面的位置处，并且成像装置进一步包括光学部件，光学部件布置成(a)将来自中间图像平面的光路由至线性阵列，以及(b)提供放大率。在附加实施例的变型中，波长选择性滤光片位于扫描元件和线性阵列之间的检测光的光学路径中，该波长选择性滤光片防止具有第一波长的光到达线性阵列。在附加实施例的变型中，线性阵列的每一个光检测元件包括光电二极管或光电倍增管元件。在附加实施例的变型中，分束器布置成(a)将由第三组光学部件整形的激发光朝向扫描元件路由；以及(b)将从扫描元件到达的检测光路由通过第二组光学部件。

在附加实施例的变型中，第二组光学部件包括第二物镜，该第二物镜设置在第二组光学部件的远端处。在附加实施例的变型中，提供的光学部件包括第三物镜，第三物镜布置成将由第三组光学部件整形的激发光路由至第二物镜的远端中，使得激发光将在从远侧到近侧的方向上朝向扫描元件行进通过第二组光学部件。在附加实施例的变型中，第一波长至少为1μm。

根据实施例，所公开的主题包括一种成像方法。该方法包括：以足够的强度将NIR激发光的脉冲光束以倾斜角度投射到样本中，以在样本内诱导荧光的双光子激发。该方法包括：以足以使激发光光束以每秒至少10个体积扫掠通过样本的三维区域的速度，使激发光光束扫描通过样本中的体积，每个体积中的分辨率在X、Y和深度方向上分别为至少256×256×8。该方法包括：使源自激发光光束的位置的荧光成像到中间图像平面上，该中间图像平面在扫描激发光光束的情况下保持静止。该方法包括使用光检测元件的线性阵列捕获中间图像平面的多个图像，该多个图像分别对应于多个不同的扫描取向。荧光在到达光检测元件的线性阵列之前穿过光学狭缝。

在前述方法的变型中，NIR激发光具有至少1μm的波长。在前述方法的另外的变型中，光束是贝塞尔光束。

根据实施例，所公开的主题包括具有光源的成像装置，该光源以第一波长生成光的脉冲光束，其中第一波长至少为620nm。光束整形光学器件将来自光源的光的光束整形成激发光光束，该激发光光束包括一系列不同深度的光斑。光学系统(a)将激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，激发光光束在样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，扫描元件提供光的二维扫描；以及(b)由源自激发光光束的位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止，并且其中，检测光具有比第一波长短的第二波长。提供了光检测元件的阵列，其中，每一个光检测元件对第二波长敏感，其中，阵列布置成捕获中间图像平面的多个第二波长图像，多个第二波长图像分别对应于扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向。在两个维度上控制扫描元件的取向，以使激发光光束的位置扫掠出样本内的三维体积。

在前述成像装置的实施例中，光束整形光学器件可以包括空间光调制器。在前述成像装置的实施例中，阵列可以包括位于与中间图像平面重合的位置处的线性阵列。阵列可以包括位于远离中间图像平面的位置处的线性阵列，并且其中，成像装置进一步包括光学部件，光学部件布置成(a)将来自中间图像平面的光路由至线性阵列，以及(b)提供放大率。不同深度处的一系列光斑可以以可调整间隔间隔开，以促进形成用于光遗传学刺激的三维图案。

根据实施例，所公开的主题包括成像方法。该方法包括：以至少为620nm的第一波长生成脉冲光束；该方法包括：将光束整形成激发光光束，该激发光光束包括一系列不同深度的光斑。该方法包括：将激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，激发光光束在样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，并且其中，在两个维度上控制扫描元件的取向，以使激发光光束的位置扫掠出样本内的三维体积。该方法包括：控制一系列不同深度的光斑的位置，以实现对活生物体中至少一个目标位置的光遗传学刺激。该方法包括由源自激发光光束的位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止，并且其中检测光具有比第一波长短的第二波长。该方法包括捕获中间图像平面的多个第二波长图像，该多个第二波长图像分别对应于扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向。整形包括使用空间光调制器。

在前述方法的变型中，捕获包括使用位于与中间图像平面重合的位置处的线性阵列。在前述方法的变型中，该捕获使用位于远离中间图像平面的位置处的线性阵列。

根据实施例，所公开的主题包括一种光学成像方法。该方法包括经由第一光学路径朝向物镜传输激发光，其中第一光学路径包括分束器和第一光扫描元件。该方法包括：朝向物镜的周边区域重定向激发光，使得激发光穿过物镜并且在组织中形成倾斜光束，其中，倾斜成像平面在组织内的位置依据第一光扫描元件的取向而变化。该方法包括：路由来自倾斜成像平面的返回光，并且通过对返回光进行解扫描，使返回光穿过静止的偏斜中间图像平面。该方法包括：将穿过静止的偏斜中间图像平面的返回光的第一部分通过成像光学器件传送到图像传感器，并且将返回光的第二部分传送到非成像光电检测器。

在变型中，该方法进一步包括：使用来自非成像检测器的信号形成没有深度分辨率的平面图像，其中，由成像检测器通过对沿着激发光束的长度的光进行成像来分辨深度。在另外的变型中，前述方法包括：组合来自由非成像光电检测器和成像传感器接收的光的信号，以增强在由从成像传感器接收的信号指示的组织中的返回光分布的三维表示。在另外的变型中，前述方法使得所述增强包括响应于沿着由三维表示指示的非深度轴的变化，调整在检测的三维分布中的总变化，由此降低三维表示中的信噪比。在另外的变型中，前述方法包括：响应于来自非成像检测器和成像传感器的信号，在显示器上同时输出平面图像和三维表示。

请注意，可以组合引用共同的独立权利要求的任何以下从属权利要求的任何限制，以对附加实施例进行限定。纯粹出于实际原因，没有提供对这些组合的明确叙述。这些附加的限制组合被视为由发明人公开。

应当理解，上述模块、过程、系统和部分可以以硬件、由软件编程的硬件、存储在非暂态计算机可读介质上的软件指令或上述的组合来实现。例如，可以使用配置成执行存储在非暂态计算机可读介质上的编程指令序列的处理器，实现对完整生物结构的成像方法。例如，处理器可以包括但不限于个人计算机或工作站或其他这样的计算系统，该计算系统包括处理器、微处理器、微控制器设备，或者由包括集成电路(诸如，例如，专用集成电路(ASIC))的控制逻辑组成。可以根据诸如Java、C++、C#.net等之类的编程语言提供的源代码指令来编译指令。指令还可以包括根据例如Visual Basic^TM语言、LabVIEW或其他结构化或面向对象取向的编程语言提供的代码和数据对象。编程指令序列和与其相关联的数据可以存储在非暂态计算机可读介质中，诸如计算机存储器或存储设备，其可以是任何合适的存储器装置，诸如但不限于只读存储器(ROM)、可编程只读存储器(PROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、随机存取存储器(RAM)、闪存、磁盘驱动器等。

此外，模块、过程、系统和部分可以实现为单个处理器或分布式处理器。进一步地，应当理解，上述步骤可以在单个或分布式处理器(单核和/或多核)上执行。并且，在以上实施例的各个图中描述的过程、模块和子模块可以分布在多个计算机或系统上，或者可以共同位于单个处理器或系统中。下文提供了适合于实现本文中所描述的模块、部分、系统、装置或过程的示例性结构实施例的备选方案。

上述模块、处理器或系统可以实现为例如编程的通用计算机、用微代码编程的电子设备、硬连线模拟逻辑电路、存储在计算机可读介质或信号上的软件、光学计算设备、电子和/或光学设备的联网系统、专用计算设备、集成电路设备、半导体芯片、以及存储在计算机可读介质或信号上的软件模块或对象。

该方法和系统(或其子部件或模块)的实施例可以在通用计算机、专用计算机、编程微处理器或微控制器和外围集成电路元件、ASIC或其他集成电路、数字信号处理器、硬连线电子或逻辑电路(诸如分立元件电路)、编程的逻辑电路(诸如可编程逻辑器件(PLD)、可编程逻辑阵列(PLA)、现场可编程门阵列(FPGA)、可编程阵列逻辑(PAL)设备)等上实现。一般而言，能够实现本文中所描述的功能或步骤的任何过程都可以用于实现方法、系统或计算机程序产品(存储在非暂态计算机可读介质上的软件程序)的实施例。

此外，所公开的方法、系统和计算机程序产品的实施例可以使用例如提供可以在多种计算机平台上使用的便携式源代码的对象或面向对象的软件开发环境，容易地以软件完全地或部分地实现。另选地，所公开的方法、系统和计算机程序产品的实施例可以使用例如标准逻辑电路或超大规模集成(VLSI)设计，以硬件部分地或完全地实现。依据系统的速度和/或效率要求、特定功能、和/或所利用的特定软件或硬件系统、微处理器或微计算机，可以使用其他硬件或软件实现实施例。根据本文中所提供的功能描述并且利用控制系统、光学器件、以及组织固定和/或计算机编程技术的一般基础知识，本领域普通技术人员可以使用任何已知的或后期开发的系统或结构、设备和/或软件，以硬件和/或软件实现该方法、系统和计算机程序产品的实施例。

而且，所公开的方法、系统和计算机程序产品的实施例可以以在编程的通用计算机、专用计算机、微处理器等上执行的软件实现。

因此，显而易见的是，根据本公开提供了成像设备、方法和系统。本公开实现了许多备选方案、修改和变型。在本发明的范围内，可以对所公开的实施例的特征进行组合、重新布置、省略等，以产生附加实施例。此外，有时可以有利地使用某些特征，而无需对应地使用其他特征。因而，申请人旨在涵盖处于本发明的精神和范围内的所有这些备选方案、修改、等同方案和变型。

Claims (102)

1.一种成像装置，包括：

图像阵列，所述图像阵列具有光电检测器的阵列；

成像光学器件，所述成像光学器件位于样本空间和所述图像阵列之间，以将来自所述样本空间的光成像到所述图像阵列上；

所述成像光学器件具有物镜，来自所述样本空间的二次光穿过所述物镜，并且激发光通过所述物镜由光束投射器沿着光束路径投射，使得由所述激发光生成的二次光被传送到所述图像阵列；

所述成像光学器件布置成将来自沿着所述光束路径的相应间隔的二次光传送到所述光电检测器中的每一个；

所述光束投射器和所述成像光学器件包括扫描元件和解扫描元件，所述扫描元件和解扫描元件由可编程的扫描控制器控制，并且横向扫掠通过所述样本空间的所述光束路径；

在扫描使所述激发光移动的情况下，控制所述解扫描元件有效地将来自所述样本区域的光保持在所述图像阵列的相应光电检测器上；

读出控制器，所述读出控制器对来自所述光电检测器的信号进行采样；

针对至少一次扫描中的每一次，处理来自所述读出控制器的数据，以在扫描期间估计所述样本空间中的所述二次光的分布，以形成与在和所述光电检测器的数量对应的层中分离的体素对应的数据。

2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述至少一次扫描是多次扫描。

3.根据权利要求1所述的装置，其中，将所述读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成10次扫描。

4.根据权利要求1所述的装置，其中，将所述读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成20次扫描。

5.根据权利要求1所述的装置，其中，将所述读出控制器调整成以一定速率对所述光电检测器进行采样，以便每秒对所述样本区域完成25次扫描。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中，所述激发光限定了轴向延伸的低圆形笔形光束。

7.根据权利要求5所述的装置，其中，所述笔形光束比所述层的深度窄。

8.根据权利要求6所述的装置，进一步包括可编程的图像处理器，所述图像处理器编程为根据从所述激发光的一次或多次扫掠获得的一组样本构建三维模型。

9.根据权利要求1所述的装置，其中，所述读出控制器连接到所述图像阵列，以同时对所有所述光电检测器进行采样，由此在每次扫描期间在每个瞬间捕获来自多个层的体素。

10.根据权利要求1所述的装置，其中，所述激发光被选择为生成提供所述二次光的双光子发射。

11.根据权利要求1所述的装置，其中，所述光电检测器包括光电倍增管。

12.根据权利要求1所述的装置，其中，所述光电检测器包括光电二极管。

13.根据权利要求1所述的装置，其中，每个光电检测器包括光电二极管阵列的相应光电二极管集合体。

14.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为6。

15.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为20。

16.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为60。

17.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为100。

18.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为500。

19.根据权利要求1所述的装置，其中，层的数量为800。

20.根据权利要求1所述的装置，其中，所述光束投射器包括激发光源和光学部件，其布置成将光施加到所述物镜的后孔径的一部分。

21.根据权利要求1所述的装置，其中，所述扫描元件和解扫描元件是由一个或多个马达驱动的移动反射元件的部分。

22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述扫描元件和解扫描元件由一个或多个电动马达移动。

23.根据权利要求1所述的装置，其中，所述激发光从所述物镜倾斜射出，所述物镜的有效数值孔径小于所述物镜的标称数值孔径，这是由于所述激发光未充满所述物镜的后孔径。

24.根据权利要求22所述的装置，其中，所述有效数值孔径小于0.1。

25.根据权利要求22所述的装置，其中，所述有效数值孔径小于0.05。

26.根据权利要求1所述的装置，其中，通过所述物镜从所述激发光形成的光束是笔形光束。

27.根据权利要求26所述的装置，其中，所述物镜具有光轴，并且所述笔形光束在其扫掠期间在至少一个点处相对于所述光轴倾斜。

28.根据权利要求26所述的装置，其中，所述物镜具有光轴，并且所述笔形光束在其扫掠期间在每个点处相对于所述光轴倾斜。

29.根据权利要求1所述的装置，其中，所述激发光通过荧光体的双光子激发而生成所述二次光。

30.根据权利要求1所述的装置，其中，持续多秒地连续重复所述扫描和解扫描，以生成允许所述样本体积每秒成像至少10次的数据。

31.根据权利要求1所述的装置，其中，持续多秒地连续重复所述扫描和解扫描，以生成允许所述样本体积每秒成像至少20次的数据。

32.根据权利要求1所述的装置，其中，持续多秒地连续重复所述扫描和解扫描，以生成允许所述样本体积每秒成像至少25次的数据。

33.根据权利要求1所述的装置，其中，持续多秒地连续重复所述扫描和解扫描，以生成允许所述样本体积每秒成像至少50次的数据。

34.根据权利要求1所述的装置，其中，所述图像阵列是可扩展互补金属氧化物半导体(sCMOS)相机的一部分。

35.根据权利要求1所述的装置，进一步包括可编程的图像处理器和用户界面，所述图像处理器编程为根据从所述激发光的一次或多次扫掠获得的一组样本构建三维模型，所述用户界面连接成向所述图像处理器施加命令，所述图像处理器编程为选择性地对来自所述光电检测器的信号进行求和，以允许所述样本体积中的选定数量的层容许用户通过选择性地损害沿着所述光束路径的分辨率并响应于从所述用户界面接收的用户输入来增加扫描和解扫描的速度，而增加来自所述样本体积的激发光的采样速度。

36.根据权利要求35所述的装置，其中，所述扫描控制器连接成接收来自所述用户界面的命令，以允许扫描和解扫描的步长还容许选择图像的横向分辨率。

37.一种成像装置，包括：

第一组光学部件，所述第一组光学部件具有近端和远端，其中，所述第一组光学部件包括第一物镜，所述第一物镜设置在所述第一组光学部件的所述远端；

第二组光学部件，所述第二组光学部件具有近端和远端；

光源，所述光源生成具有第一波长的脉冲输出光束；

第三组光学部件，所述第三组光学部件布置成将由所述光源生成的所述输出光束整形为具有波瓣的贝塞尔光束；

扫描元件，所述扫描元件提供光的二维扫描，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的所述近端设置在近侧，并且相对于所述第二组光学部件的所述近端设置在近侧，

其中，所述扫描元件布置成对所述激发光光束进行路由，使得所述激发光光束将在从近侧到远侧的方向上穿过所述第一组光学部件，并且投射到定位在所述第一组光学部件的所述远端之外的远侧的样本中，其中，所述激发光光束以倾斜角度投射到所述样本中，并且其中，所述激发光光束在依据所述扫描元件的取向而变化的位置处投射到所述样本中，

其中，所述第一组光学部件在从远侧到近侧的方向上将来自所述样本的检测光路由回到所述扫描元件，其中，所述检测光具有第二波长，以及

其中，所述扫描元件还布置成对经由所述第一组光学部件到达的所述检测光进行路由，使得所述检测光将在从近侧到远侧的方向上穿过所述第二组光学部件，并且在静止位置处形成中间图像平面，所述静止位置在所述第二组光学部件的所述远端之外的远侧；以及

光检测元件的线性阵列，其中，每一个所述光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述线性阵列布置成捕获所述中间图像平面的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向；以及

用于减少由所述波瓣中的激发光产生的检测光的光量的机构；

其中，控制所述扫描元件的取向以使所述激发光光束的位置扫掠出所述样本内的三维体积。

38.根据权利要求37所述的成像装置，其中，用于减少的所述机构包括所述脉冲输出光束的选定波长和瞬时强度。

39.根据权利要求37所述的成像装置，其中，用于减少的所述机构包括光学狭缝，所述光学狭缝位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的光学路径中，所述光学狭缝阻挡来自所述波瓣的图像光。

40.一种使用根据权利要求37所述的成像装置的方法，包括：提供根据权利要求37所述的装置，并且选择所述脉冲输出光束的波长和瞬时强度，使得来自所述波瓣的图像光的光量小于从所述激发光束的主要部分接收的光的光量的百分之一。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述选择使得从所述波瓣接收的所述图像光的光量为零。

42.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述第一波长至少为620nm。

43.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述光学狭缝位于所述中间图像平面附近。

44.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述第三组光学部件生成贝塞尔光束或贝塞尔-高斯光束。

45.根据权利要求44所述的成像装置，其中，所述第三组光学部件通过使用轴棱锥透镜聚焦高斯光束来操作。

46.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述第三组光学部件包括空间光调制器。

47.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于与所述中间图像平面重合的位置处。

48.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于远离所述中间图像平面的位置处，并且其中，所述成像装置进一步包括光学部件，所述光学部件布置成(a)将来自所述中间图像平面的光路由至所述线性阵列，以及(b)提供放大。

49.根据权利要求37所述的成像装置，进一步包括波长选择性滤光片，所述波长选择性滤光片位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的所述光学路径中，所述波长选择性滤光片防止具有所述第一波长的光到达所述线性阵列。

50.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述线性阵列的光检测元件的每一个包括光电二极管或光电倍增管元件。

51.根据权利要求37所述的成像装置，进一步包括：分束器，所述分束器布置成(a)将由所述第三组光学部件整形的所述激发光朝向所述扫描元件路由；以及(b)将从所述扫描元件到达的所述检测光路由通过所述第二组光学部件。

52.根据权利要求37所述的成像装置，其中，所述第二组光学部件包括第二物镜，所述第二物镜设置在所述第二组光学部件的所述远端处。

53.根据权利要求37至52中任一项所述的成像装置，进一步包括：

光学部件，所述光学部件包括第三物镜，所述第三物镜布置成将由所述第三组光学部件整形的所述激发光路由至所述第二物镜的所述远端中，使得所述激发光将在从远侧到近侧的方向朝向所述扫描元件行进通过所述第二组光学部件。

54.根据权利要求53所述的成像装置，其中，所述第一波长至少为1μm。

55.一种成像方法，包括：

以足够的强度将NIR激发光的脉冲光束以倾斜角度投射到样本中，以在所述样本内诱导荧光的双光子激发；

以足以使所述激发光光束以每秒至少10个体积扫掠通过所述样本的三维区域的速度，使所述激发光光束扫描通过所述样本中的体积，每个体积中的分辨率在X、Y和深度方向上分别为至少256×256×8；

将源自所述激发光光束的位置的荧光成像到中间图像平面上，所述中间图像平面在扫描所述激发光光束的情况下保持静止；并且

使用光检测元件的线性阵列捕获所述中间图像平面的多个图像，所述多个图像分别对应于多个不同的扫描取向。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述荧光在到达所述光检测元件的线性阵列之前穿过光学狭缝。

57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述荧光在到达所述光检测元件的线性阵列之前穿过可调整狭缝。

58.根据权利要求55所述的方法，其中，所述荧光在到达所述光检测元件的线性阵列之前穿过固定狭缝。

59.根据权利要求54所述的成像装置，其中，所述NIR激发光的波长至少为1μm，并且所述光束是贝塞尔光束。

60.一种成像装置，包括：

光源，所述光源以第一波长生成激发光的脉冲光束，其中，所述第一波长至少为620nm；

光学系统，所述光学系统(a)将所述激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，所述激发光光束在所述样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，所述扫描元件提供光的二维扫描；以及(b)由源自所述激发光光束的所述位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论所述扫描元件的所述取向如何，所述中间图像平面都保持静止，并且其中，所述检测光具有比所述第一波长短的第二波长；以及

光检测元件的线性阵列，其中，每一个所述光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述线性阵列布置成捕获所述中间图像平面的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向；以及

光学狭缝，所述光学狭缝位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的光学路径中，

其中，控制所述扫描元件的所述取向以使所述激发光光束的所述位置扫掠出所述样本内的三维体积。

61.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述光学狭缝位于所述中间图像平面附近。

62.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述光束是使用空间光调制器生成的激发光的贝塞尔光束。

63.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于与所述中间图像平面重合的位置处。

64.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于远离所述中间图像平面的位置处，并且其中，所述成像装置进一步包括光学部件，所述光学部件布置成(a)将来自所述中间图像平面的光路由至所述线性阵列，以及(b)提供放大率。

65.根据权利要求60所述的成像装置，进一步包括波长选择性滤光片，所述波长选择性滤光片位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的所述光学路径中，所述波长选择性滤光片防止具有所述第一波长的光到达所述线性阵列。

66.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述线性阵列的每一个所述光检测元件包括光电二极管或光电倍增管元件。

67.根据权利要求60所述的成像装置，其中，所述第一波长至少为1μm。

68.一种成像装置，包括：

第一组光学部件，所述第一组光学部件具有近端和远端，其中，所述第一组光学部件包括第一物镜，所述第一物镜设置在所述第一组光学部件的所述远端；

第二组光学部件，所述第二组光学部件具有近端和远端；

光源，所述光源生成具有第一波长的脉冲输出光束，其中，所述第一波长至少为620nm；

第三组光学部件，所述第三组光学部件布置成将由所述光源生成的所述输出光束整形为激发光的贝塞尔光束形光束；

扫描元件，所述扫描元件提供光的二维扫描，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的所述近端设置在近侧，并且相对于所述第二组光学部件的所述近端设置在近侧，

其中，所述扫描元件布置成对所述激发光光束进行路由，使得所述激发光光束将在从近侧到远侧的方向上穿过所述第一组光学部件，并且投射到位于所述第一组光学部件的所述远端之外的远侧的样本中，其中，所述激发光光束以倾斜角度投射到所述样本中，并且其中，所述激发光光束在依据所述扫描元件的取向而变化的位置处投射到所述样本中，

其中，所述第一组光学部件在从远侧到近侧的方向上将来自所述样本的检测光路由回到所述扫描元件，其中，所述检测光具有比所述第一波长短的第二波长，以及

其中，所述扫描元件还布置成对经由所述第一组光学部件到达的所述检测光进行路由，使得所述检测光将在从近侧到远侧的方向上穿过所述第二组光学部件，并且在静止位置处形成中间图像平面，所述静止位置在所述第二组光学部件的所述远端之外的远侧；以及

光检测元件的线性阵列，其中，每一个所述光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述线性阵列布置成捕获所述中间图像平面的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向；以及

光学狭缝，所述光学狭缝位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的光学路径中，

其中，控制所述扫描元件的所述取向以使所述激发光光束的所述位置扫掠出所述样本内的三维体积。

69.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述光学狭缝位于所述中间图像平面附近。

70.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述第三组光学部件生成贝塞尔-高斯光束，并通过使用轴棱锥透镜聚焦高斯光束来操作。

71.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述第三组光学部件包括空间光调制器。

72.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于与所述中间图像平面重合的位置处。

73.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述线性阵列位于远离所述中间图像平面的位置处，并且其中，所述成像装置进一步包括光学部件，所述光学部件布置成(a)将来自所述中间图像平面的光路由至所述线性阵列，以及(b)提供放大率。

74.根据权利要求68所述的成像装置，进一步包括波长选择性滤光片，所述波长选择性滤光片位于所述扫描元件和所述线性阵列之间的所述检测光的所述光学路径中，所述波长选择性滤光片防止具有所述第一波长的光到达所述线性阵列。

75.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述线性阵列的每一个所述光检测元件包括光电二极管或光电倍增管元件。

76.根据权利要求68所述的成像装置，进一步包括：分束器，所述分束器布置成(a)将由所述第三组光学部件整形的所述激发光朝向所述扫描元件路由；以及(b)将从所述扫描元件到达的所述检测光路由通过所述第二组光学部件。

77.根据权利要求68所述的成像装置，其中，所述第二组光学部件包括第二物镜，所述第二物镜设置在所述第二组光学部件的所述远端处。

78.根据权利要求68至77中任一项所述的成像装置，进一步包括：

光学部件，所述光学部件包括第三物镜，所述第三物镜布置成将由所述第三组光学部件整形的所述激发光路由至所述第二物镜的所述远端中，使得所述激发光将在从远侧到近侧的方向上朝向所述扫描元件行进通过所述第二组光学部件。

79.根据权利要求78所述的成像装置，其中，所述第一波长至少为1μm。

80.一种成像方法，包括：

以足够的强度将NIR激发光的脉冲光束以倾斜角度投射到样本中，以在所述样本内诱导荧光的双光子激发；

以足以使所述激发光光束以每秒至少10个体积扫掠通过所述样本的三维区域的速度，使所述激发光光束扫描通过所述样本中的体积，每个体积中的分辨率在X、Y和深度方向上分别为至少256×256×8；

使源自所述激发光光束的所述位置的荧光成像到中间图像平面上，所述中间图像平面在扫描激发光光束的情况下保持静止；以及

使用光检测元件的线性阵列捕获所述中间图像平面的多个图像，所述多个图像分别对应于多个不同的扫描取向，

其中，所述荧光在到达所述光检测元件的线性阵列之前穿过光学狭缝。

81.根据权利要求80所述的成像装置，其中，所述NIR激发光的波长至少为1μm。

82.根据权利要求80所述的装置，其中，所述激发光束是贝塞尔光束。

83.一种成像装置，包括：

光源，所述光源以第一波长生成光的脉冲光束，其中，所述第一波长至少为620nm；

光束整形光学器件，所述光束整形光学器件将来自所述光源的所述光的光束整形成激发光光束，所述激发光光束包括一系列不同深度的光斑；

光学系统，所述光学系统(a)将所述激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，所述激发光光束在所述样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，所述扫描元件提供光的二维扫描；以及(b)由源自所述激发光光束的所述位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论所述扫描元件的所述取向如何，所述中间图像平面都保持静止，并且其中，所述检测光具有比所述第一波长短的第二波长；以及

光检测元件的阵列，其中，每一个所述光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述阵列布置成捕获所述中间图像平面的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向；以及

其中，在两个维度上控制所述扫描元件的所述取向，以使所述激发光光束的所述位置扫掠出所述样本内的三维体积。

84.根据权利要求83所述的成像装置，其中，所述光束整形光学器件包括空间光调制器。

85.根据权利要求83所述的成像装置，其中，所述阵列包括线性阵列，所述线性阵列位于与所述中间图像平面重合的位置处。

86.根据权利要求83所述的成像装置，其中，所述阵列包括线性阵列，所述线性阵列位于远离所述中间图像平面的位置处，并且其中，所述成像装置进一步包括光学部件，所述光学部件布置成(a)将来自所述中间图像平面的光路由至所述线性阵列，以及(b)提供放大率。

87.根据权利要求83所述的成像装置，其中，所述一系列不同深度的光斑具有可调整的间距，以促进形成用于光遗传学刺激的三维图案。

88.一种成像方法，包括：

以至少为620nm的第一波长生成脉冲光光束；

将所述光束整形成激发光光束，所述激发光光束包括一系列不同深度的光斑；

将所述激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，所述激发光光束在所述样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，并且其中，在两个维度上控制所述扫描元件的所述取向，以使所述激发光光束的所述位置扫掠出所述样本内的三维体积；

控制所述一系列不同深度的光斑的位置，以实现对活生物体中至少一个目标位置的光遗传学刺激；

由源自所述激发光光束的所述位置的检测光在中间图像平面处形成图像，其中，无论所述扫描元件的所述取向如何，所述中间图像平面都保持静止，并且其中，所述检测光具有比所述第一波长短的第二波长；以及

捕获所述中间图像平面的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件或激发光束的多个不同位置和/或取向。

89.根据权利要求88所述的成像方法，其中，所述整形包括使用空间光调制器。

90.根据权利要求88所述的成像方法，其中，所述捕获包括使用位于与所述中间图像平面重合的位置处的线性阵列。

91.根据权利要求88所述的成像方法，其中，所述捕获包括使用位于远离所述中间图像平面的位置处的线性阵列。

92.一种光学成像方法，包括：

经由第一光学路径朝向物镜传输激发光，其中，所述第一光学路径包括第一光扫描元件；

朝向所述物镜的周边区域重定向所述激发光，使得所述激发光穿过所述物镜并且在组织中形成倾斜光束，其中，倾斜成像平面在所述组织内的位置依据所述第一光扫描元件的取向而变化；

路由来自所述倾斜成像平面的返回光，并且通过对所述返回光进行解扫描，使所述返回光穿过静止的偏斜中间图像平面；以及

将穿过所述静止的偏斜中间图像平面的所述返回光的第一部分通过成像光学器件传送到图像传感器，并且将所述返回光的第二部分传送到非成像光电检测器。

93.根据权利要求92所述的方法，进一步包括：使用来自所述非成像检测器的信号形成没有深度分辨率的平面图像，其中，由所述成像检测器通过对沿着所述激发光束的长度的光进行成像来分辨深度。

94.根据权利要求92所述的方法，进一步包括：组合来自由所述非成像光电检测器和所述成像传感器接收的所述光的信号，以增强在由从所述成像传感器接收的所述信号指示的所述组织中的返回光分布的三维表示。

95.根据权利要求94所述的方法，其中，所述增强包括响应于沿着由所述三维表示指示的非深度轴的所述变化，调整在所检测的三维分布中的总变化，由此增加所述三维表示中的信噪比。

96.根据权利要求92或93所述的方法，进一步包括：响应于来自所述非成像检测器和所述成像传感器的信号，在显示器上同时输出平面图像和三维表示。

97.一种成像装置，包括：

第一组光学部件，所述第一组光学部件具有近端和远端，其中，所述第一组光学部件包括第一物镜，所述第一物镜设置在所述第一组光学部件的所述远端；

凸透镜，所述凸透镜具有近端和远端；

光源，所述光源生成具有第一波长的脉冲输出光束，其中，所述第一波长至少为620nm；

扫描元件，所述扫描元件提供光的二维扫描，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的所述近端设置在近侧，并且相对于所述凸透镜的所述近端设置在近侧，

其中，所述扫描元件布置成对所述激发光光束进行路由，使得所述激发光光束将在从近侧到远侧的方向上穿过所述第一组光学部件，并且投射到位于在所述第一组光学部件的所述远端之外的远侧的样本中，其中，所述激发光光束以倾斜角度投射到所述样本中，并且其中，所述激发光光束在依据所述扫描元件的取向而变化的位置处投射到所述样本中，

其中，所述第一组光学部件在从远侧到近侧的方向上将来自所述样本的检测光路由回到所述扫描元件，其中，所述检测光具有比所述第一波长短的第二波长，以及

其中，所述扫描元件还布置成对经由所述第一组光学部件到达的所述检测光进行路由，使得所述检测光将在从近侧到远侧的方向上穿过所述凸透镜，并且在静止位置处形成中间图像线，所述静止位置在所述凸透镜的所述远端之外的远侧；以及

光检测元件的线性阵列，其中，每一个所述光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述线性阵列布置成捕获所述中间图像线的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件的多个不同取向；以及

其中，控制所述扫描元件的所述取向以使所述激发光光束的位置扫掠通过所述样本内的三维体积。

98.根据权利要求97所述的成像装置，其中，所述凸透镜具有光轴，并且所述线性阵列相对于所述凸透镜的所述光轴偏斜。

99.根据权利要求97或98所述的成像装置，其中，所述凸透镜具有光轴，并且所述线性阵列垂直于所述凸透镜的所述光轴。

100.一种成像装置，包括：

光源，所述光源以第一波长生成激发光的脉冲光束，其中，所述第一波长至少为620nm；

光学系统，所述光学系统(a)将所述激发光光束以倾斜角度投射到样本中，其中，所述激发光光束在所述样本内的位置依据扫描元件的取向而变化，所述扫描元件提供光的二维扫描；以及(b)由源自所述激发光光束的所述位置的检测光在中间图像线处形成图像，其中，无论所述扫描元件的所述取向如何，所述中间图像线都保持静止，并且其中，所述检测光具有比所述第一波长和第三波长短的第二波长；

波长选择性分束器，所述波长选择性分束器将所述第二波长的光路由至第一位置并且将所述第三波长的光路由至第二位置；

第一光检测元件的第一阵列，所述第一阵列位于所述第一位置处，其中，每一个所述第一光检测元件对所述第二波长敏感，其中，所述第一阵列布置成捕获所述中间图像线的多个第二波长图像，所述多个第二波长图像分别对应于所述扫描元件的多个不同取向；

第二光检测元件的第二阵列，所述第二阵列位于所述第二位置处，其中，每一个所述第二光检测元件对所述第三波长敏感，其中，所述第二阵列布置成捕获所述中间图像线的多个第三波长图像，所述多个第三波长图像分别对应于所述扫描元件的多个不同取向；

其中，在两个维度上控制所述扫描元件的所述取向，以使所述激发光光束的所述位置扫掠通过所述样本内的三维体积。

101.根据权利要求100所述的成像装置，进一步包括光束整形光学器件，所述光束整形光学器件将所述激发光光束整形为贝塞尔光束。

102.根据权利要求100或101所述的成像装置，其中，所述第一波长至少为1μm。