CN102436061A - 高速三维荧光成像显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高速三维荧光成像显微镜，其包括点光源、准直透镜及二向色镜；被所述二向色镜反射的荧光传播光路上设有光电探测器；准直透镜相对点光源的另一侧设有振镜，所述振镜将光线转向后的光路上设有汇聚透镜；所述汇聚透镜与振镜间设有波前调制器，被振镜反射转向的光束经过波前调制器后变为实心细光束及与所述实心细光束同心的圆环形光束；所述光束通过汇聚透镜聚焦，并在焦点内形成沿着光轴方向成余弦分布的光强分布；通过波前调制器调节圆环形光束的半径，调节焦点光强分布的余弦函数周期，并同时用光电探测器记录被二向色镜反射得荧光的强度序列。本发明结构紧凑，使用方便，提高了三维荧光成像速率及适应性，安全可靠。

Description

高速三维荧光成像显微镜

技术领域

本发明涉及一种显微镜，尤其是一种高速三维荧光成像显微镜，属于三维成像显微镜的技术领域。

背景技术

共聚焦扫描显微镜是现有进行三维荧光成像的唯一实用商业技术，此类显微镜工作时样品被一个由物镜所形成的聚焦光探针进行照明，所激发的荧光被同一个物镜收集，并被一个放置在其后焦平面上的带有针孔光电探测器所接收。由于共聚焦扫描显微镜中后焦面上的针孔可以有效地降低离焦荧光的强度，因此共聚焦扫描显微镜具有对样品进行分层成像的能力，可以对样品进行三维成像，其结构如图1所示。图1中，点光源1发出的发散光经准直透镜3后变为平行光，所述平行光经振镜4转向后入射到汇聚透镜5上，并被聚焦于样品6内，光线在样品6上激发出荧光，其中一部分荧光光线经原路返回准直透镜3，并被二向色镜2反射到带针孔光电探测器7上并被记录，从而完成对样品6内激发光聚焦点所在位置的成像。振镜4可以在一定范围转动扫描，从而可以让焦点在样品平面内扫描，实现二维成像。但若需要三维成像时，就必须要沿着光轴方向移动扫描台8以进行三维空间的逐点扫描。由于其需要对样品在三维空间中进行逐点的扫描，因此速度不可能很快。对于单焦点扫描的激光共聚焦扫描显微镜来说，较为典型的速度大概是每秒可以产生几帧512×512像素的图像，即使是对于采用旋转盘(spinning disk)技术进行并行扫描，Olympus等国际大公司推出的商用产品也只能达到每秒15帧左右的速度(http://www.olympusamerica.com/segsection/product.asp？product＝1009)，这对生物医学研究中的很多所谓快过程来说还是不够的。目前，因此对大多数生物样品来说产生一个三维的荧光图像往往需要花费较长的时间，而且如果成像对象是活动的细胞等样品，由于成像速度跟不上样品变化，所得到的图像往往被严重扭曲。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种高速三维荧光成像显微镜，其结构紧凑，使用方便，提高了三维荧光成像速度，拓宽了三维荧光显微成像技术的应用范围。

按照本发明提供的技术方案，所述高速三维荧光成像显微镜，包括点光源；在所述点光源射出光线传播的光路上设置有准直透镜；所述准直透镜与点光源间设置二向色镜；被所述二向色镜反射的荧光传播光路上设有光电探测器；准直透镜相对点光源的另一侧设有振镜，所述振镜将光线转向后的光路上设有汇聚透镜；所述汇聚透镜与振镜间设有波前调制器，被振镜反射转向的光束经过波前调制器后变为实心细光束及与所述实心细光束同心的圆环形光束；所述光束通过汇聚透镜聚焦，并在焦点内形成沿着光轴方向成余弦分布的光强分布；通过波前调制器调节圆环形光束的半径，调节焦点光强分布的余弦函数周期，并同时用光电探测器记录被二向色镜反射得荧光的强度序列。

所述光电探测器采集得到的荧光强度序列为焦点内荧光团分布的余弦变换，通过对光电探测器采集得到的荧光强度序列进行反余弦变换得到光轴方向的荧光团空间分布信息实现三维成像。

本发明的优点：振镜与汇聚透镜间设有波前调制器，所述波前调制器能调节圆环形光束的半径，从而调节在被测样品上激发光焦点的光强分布周期；在振镜转动从而实现在平面内扫描焦点的同时，通过反余弦变换得到被测样品内部荧光图的z向分布，即通过二维的扫描实现三维成像；由于没有扫描台的机械运动，避免了机械扫描速度的限制，波前调制器具有较高的开关速度，从而提高了三维荧光成像速度及适应性，结构紧凑，使用方便，安全可靠。

附图说明

图1为现有三维荧光焦点扫描成像显微镜的结构示意图。

图2为本发明的结构示意图。

图3为本发明焦点编码形成的示意图。

图4为本发明圆环形光束的会聚角在不同角度时形成编码焦点的轴向强度分布。

图5为本发明实验分析原理图。

图6为本发明成像分析仿真示意图。

附图标记说明：1-点光源、2-二向色镜、3-准直透镜、4-振镜、5-汇聚透镜、6-被测样品、7-光电探测器、8-扫描台及9-波前调制器。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

如图2所示：为了克服现有三维荧光成像显微镜的缺点，和够提高三维荧光显微镜的成像速率；本发明的三维荧光成像显微镜包括点光源1，在所述点光源1射出光线传播的光路上设置有准直透镜3，所述准直透镜3与点光源1间设置二向色镜2，在被所述二向色镜2反射的荧光传播光路上设有光电探测器7；准直透镜3对应于与点光源1的另一侧设有振镜4，所述振镜4将光线转向后的光路上设有汇聚透镜5；所述汇聚透镜5与振镜4间设有波前调制器9，被振镜4反射转向的光束经过波前调制器9后变为实心细光束及圆环形光束，所述两部分光束通过汇聚透镜5聚焦，实心细光束与圆环形光束干涉后在焦点内形成沿着光轴方向成余弦分布的光强分布；所述余弦函数的周期随着圆环形光束的半径增加而增加；用波前调制器9可以调节圆环形光束的半径。根据荧光激发的性质，如果在圆环形光束半径增大的同时用光电探测器7同步记录下所激发荧光的强度序列。所述带电探测器7采集得到的荧光强度序列为焦点内荧光团分布的余弦变换，通过对光电探测器7采集得到的荧光强度序列进行反余弦变换得到光轴方向的荧光团空间分布信息，即够得到相应的三维荧光成像信息。波前调制器9本质上是光电开关，可以有每秒几千次的开关速度，通过波前调制器9能够快速调节圆形光束的半径，以此得到相应周期的焦点强度分布。

上述三维成像的可行性，可以通过下述分析得到。如附图3所示，入射到汇聚透镜5上的照明光为两部分组成，第一部分是位于汇聚透镜5中心的实心细光束，第二部分是位于所述实心细光束外周的同心圆环形光束，两束光具有相同的偏振方向。所述实心细光束与圆环形光束干涉后所形成焦点的强度将沿着光轴方呈余弦函数变化，且余弦函数的周期可以随着圆环形光束半径的增大而增加。这样在任意照明位置处，将圆环形光束的半径由小变大时，所记录下的荧光强度序列实质是光轴方向上荧光团分布余弦变换，只要对其作一个反余弦变换就可以得到荧光团的轴向分布。这个过程相当于OCT(Optical CoherenceTomography)技术中的A扫描，如果在不同的位置重复此过程，即进类似于OCT技术中的B扫描，即可以实现高速的荧光层析成像。可以看出，由于没有传统共聚焦的z-向机械扫描，所以速度可以大幅度提高。按照目前的技术水平，通过波前调制器9调节圆环形光束的半径的变化频率可达50000次/秒，按照这个速度，对于宽度为512*512像素的图像而言，可以达到约100帧/秒的速度，这个速度比目前传统共聚焦显微镜快上百倍，比转盘(spin disk)扫描的共聚焦显微镜速快10倍。

通过波前调制器9得到相应余弦函数的余弦变换的数学原理如图3所示：实心细光束的半径远远小于汇聚透镜5的半径，在汇聚透镜5的焦点附近，所述实心细光束可以近似被认为是一个平行于光轴传播的平行光并具有波数k_z＝k₀＝2π/λ，其中λ为波长。沿着光轴方向电场的分布可以写为：E_x1＝E₁cos(ω₀t+k₀z)。在焦点附近圆环形光束将被汇聚成空心的圆锥形，圆锥的半顶角为θ＝tg¹(0.5D/f)，其中D为圆环形光束的半径，f为汇聚透镜5的焦点。由于入射光束的轴对称性，焦点附近的光场分部可以近似写为E_x2＝E₂cos(ω₀t+cosθk₀z)。焦点附近的总的光场为两束光所形成的光场的叠加E_x＝E₁cos(wt+k₀z)+E₂cos(wt+k₀cosθz)，其中，ω₀为频率，E₁，E₂为相应的光强度。

如果E₂＝E₁＝E₀时，那么E_x＝2E₀cos[wt+k₀z(1+cosθosθ)/2s[k₀z(1-cosθosθ)，在焦点附近沿着光轴方向，光场的强度为：

这意味着焦点附近光场的强度沿着光轴方向为一个正弦函数。为了验证这个估计，采用严格的矢量计算法可以用来计算焦点附近的光场。附图4中(a)，(b)，(c)、(d)所对应的汇聚顶角θ分别为7°、11°、15°、20°时，对应形成的编码焦点的轴向强度分布。

如果按照图5中的光路安排，且用附图4中的焦点来照明样品，同时将样品所激发的荧光将用另外一个透镜来收集，并且设光轴方向上荧光团的分布为α(z)，则所收集到的荧光强度为：

$I_{\det }=\∫\mathrm{\α}\left(z\right){\left|E_x\right|}^2\mathrm{dz}=4E_0^2\∫\mathrm{\α}\left(z\right){\cos }^2[k_{0}z(1-\cos \mathrm{\θ})/2]\mathrm{dz}$ (1)

$=2E_0^2\∫\mathrm{\α}\left(z\right)\mathrm{dz}+2E_0^2\∫\mathrm{\α}\left(z\right)\cos \left[k_{0}z(1-\cos \mathrm{\θ})\right]\mathrm{dz}$

如果令k₀(1-cosθ)＝k_θ，那么上式可以简化为

$I_{\det }\left(k_{\mathrm{\θ}}\right)=2E_0^2\∫\mathrm{\α}\left(z\right)\mathrm{dz}+2E_0^2\∫\mathrm{\α}\left(z\right)\cos \left[k_{\mathrm{\θ}}z\right]\mathrm{dz}---\left(2\right)$

容易看出，上式(2)中的第一项是一个常数，第二项其实是荧光团分布函数α(z)的余弦变换。所以对实际的实验来说，在任意照明位置处，连续的改变圆环形光束的半径，并对应记下一系列的荧光强度I_det(k_θ)后，只要对所记录下的这些I_det(k_θ)进行一下余弦变换，就可以得到相应位置处的沿着光轴方向的荧光团分布函数α(z)，也即在该点处实现了样品的荧光层析成像。

将上述公式(1)中的θ取θ_n＝cos^-1(0.0033n)，n＝211，212Λ300共90个值。模拟样品在一个x-z平面上的荧光团分布如附图6(a)所示，照明光从左至右对样品进行照明，θ将按顺序取上述90个值并计算出所激发的荧光强度，按公式(2)所探测的荧光强度在附图6(b)给出。将附图6(b)中的荧光强度进行一个反余弦变换，并将结果显示在附图6(c)中。比较图6(a)和6(c)，可以发现除了一些细节结构的丢失外，图6(c)再现了图6(a)的大部分结构，二者具有非常高的相似性，很好的显示了三维荧光成像的可行性。

如图2和图5所示：使用时，将被测样品6放置于汇聚透镜5的下方。工作时，打开点光源1，点光源1发出的光线穿过二向色镜2后经过准直透镜3后变为平行光，所述振镜4将平行光转向入射到波前调制器9上并形成实心细光束及与所述实心细光束同心的圆环形光束；两束光被汇聚透镜5聚焦于被测样品6上，由于两束光干涉后在焦点内形成沿着光轴方向成余弦分布的光强分布，焦点在被测样品6上所激发的荧光经原路返回到二向色镜2处，所述二向色镜2将荧光反射到光电探测器7上。在波前调制器9改变圆环形光束半径的同时，用光电探测器7采集所激发荧光的强度序列。同时，振镜4转动从而在平面内扫描焦点的同时，通过反余弦变换得到被测样品6内部荧光图的z向分布，即通过二维的扫描实现三维成像。由于没有扫描台8的机械运动，避免了机械扫描速度的限制，同时波前调制器9具有较高的开关速度，从而提高了三维荧光成像速度及适应性，结构紧凑，使用方便，安全可靠。

Claims (2)

1. 一种高速三维荧光成像显微镜，包括点光源（1）；在所述点光源（1）射出光线传播的光路上设置有准直透镜（3）；所述准直透镜（3）与点光源（1）间设置二向色镜（2）；被所述二向色镜（2）反射的荧光传播光路上设有光电探测器（7）；准直透镜（3）相对点光源（1）的另一侧设有振镜（4），所述振镜（4）将光线转向后的光路上设有汇聚透镜（5）；其特征是：所述汇聚透镜（5）与振镜（4）间设有波前调制器（9），被振镜（4）反射转向的光束经过波前调制器（9）后变为实心细光束及与所述实心细光束同心的圆环形光束；所述光束通过汇聚透镜（5）聚焦，并在焦点内形成沿着光轴方向成余弦分布的光强分布；通过波前调制器（9）调节圆环形光束的半径，调节焦点光强分布的余弦函数周期, 并同时用光电探测器（7）记录被二向色镜（2）反射得荧光的强度序列。

2.根据权利要求1所述的高速三维荧光成像显微镜，其特征是：所述光电探测器（7）采集得到的荧光强度序列为焦点内荧光团分布的余弦变换，通过对光电探测器（7）采集得到的荧光强度序列进行反余弦变换得到光轴方向的荧光团空间分布信息实现三维成像。

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