CN104897627A - 一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法,该方法的步骤包括1)合成识别分子DDO；2)配制磷酸缓冲溶液、叶酸标准溶液和DDO标准溶液；3)测定三维荧光光谱特定条件；4)测定荧光强度；5)得出线性方程；6)根据线性方程计算叶酸的浓度。本发明不需要将叶酸分解就能利用荧光光谱仪检测叶酸的含量，操作过程简便，重复性好，准确性高。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，尤其是涉及一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法。
背景技术
叶酸是维持生物体正常生命活动过程必不可少的一类有机物质，需求量虽少，但是对维持健康意义重大。叶酸作为一种辅酶，在细胞分裂和生长，以及嘌呤、嘧啶、核酸、蛋白质的生物合成上发挥着重要的作用，在治疗某些肿瘤和心血管疾病方面也有一定作用。叶酸缺乏，容易导致生理功能退化及某些疾病如胃肠功能紊乱、智力退化以及神经管畸形的发生。处于发育期的机体、孕妇、哺乳期妇女、婴儿更加需要补充叶酸；对于巨幼红血球性贫血，叶酸是一种具有显著疗效的药物。
由于叶酸具有特殊的生理功能，特别是对妊娠期、哺乳期妇女和胎儿，叶酸经常作为营养强化剂用于保健食品及配方食品中。因此，如何测定这些食品中的叶酸含量，以监控这些食品的质量就变得尤为重要。
测定叶酸的分析方法主要有流动注射-化学发光法，高效液相色谱法，分光光度法，微生物法以及荧光光度法。经典的微生物法检测叶酸虽然灵敏度高，结果准确，但是操作繁琐，重复性差，实验周期长，容易受到广泛使用的抗生素的影响，检测结果不能区分各种叶酸盐形式。高效液相色谱法虽然在叶酸分析中应用广泛，但是方法都还不成熟。高效液相色谱法分离性能很好，但是仪器成本昂贵，同时使用大量有机试剂给环境造成严重污染。流动注射-化学发光法检测样品中叶酸含量，重现性较差。
三维荧光光谱技术是近几十年中发展起来的一种新的荧光分子技术，可以描绘荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱。拥有高灵敏度、高信息量和选择性的优势，广泛用作光谱指纹分析、临床分析、多组分分析等。当位于基态的荧光物质分子在吸收了与其相应的特征电子能级一致的光能后，其价电子将从成键或非成键轨道跃迁到反键轨道上去，这就是激发态产生的本质。处于激发态的分子，经振动弛豫和内部转换等非辐射的跃迁形式跃迁到第一激发单重态的最低振动能级，由此释放能量返回基态，所发射出的光辐射就是荧光。物质在一定频率和强度的激发光照射下，如果光被吸收的比例不太大且溶液的浓度非常小时(≤0.05)，则荧光物质的浓度与溶液所产生的荧光强度成正比。分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物易于发射荧光，具有大的共轭Π键结构、给电子取代基和刚性的平面结构的分子可以发射强荧光。荧光法是分析药物和食品中各种维生素的较好方法，具有快速、灵敏、选择性好的优点。但是现有荧光分析法主要利用强氧化剂氧化叶酸，取得其分解产物产生的荧光，进行含量检测，操作起来比较费时费力，过程繁琐，另外由于叶酸的不完全分解会导致干扰较多，重现性差。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种在不破坏叶酸分子的前提下利用荧光光谱法快速、有效地检测叶酸含量的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成识别分子：将乳清酸与1,12-二氨基十二烷水溶液混合，常温搅拌反应80～100小时得到混合液，将所述混合液除去水分得到浓缩产物，将所述浓缩产物用无水乙醇洗涤，真空干燥后得到1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(DDO)，其反应方程式如下：
2)配制标准液：称取磷酸二氢钠和氢氧化钠溶于水，用盐酸调节其pH值为7.0～7.8，得到磷酸缓冲溶液；称取叶酸溶解于磷酸缓冲溶液中，得到叶酸标准溶液；称取DDO溶解于磷酸缓冲溶液中，得到DDO标准溶液；
3)测定三维荧光光谱特定条件：叶酸激发光波长为400nm，发射光波长为460nm；DDO激发光波长为320nm，发射光波长为390nm；
4)测定荧光强度：在DDO浓度为4.0×10-4mol/L，激发光波长为320nm，发射光波长为390nm，激发电压为800V，激发光源透过孔径均为5.0nm，发射光源透过孔径均为5.0nm的条件下，改变叶酸的浓度，测定不同叶酸浓度下DDO溶液的荧光强度；
5)得出线性方程：根据步骤4)得出DDO溶液的荧光强度(F)与叶酸的浓度(cp)间具有线性关系，线性方程为F＝3116.99－28.4759cp，相关系数γ为0.9959，检出限为1.25×10-6mol/L；
6)取1mL叶酸标准液，依步骤3)的方法测定荧光值，计算出叶酸的浓度。
进一步的，步骤1)中乳清酸与1,12-二氨基十二烷的摩尔比为2:1。
进一步的，步骤1)中反应时间为95～98小时。
进一步的，步骤2)中DDO的溶解为常温下利用超声振荡仪超声溶解。
本发明的有益效果是，不需要将叶酸分解就能利用荧光光谱仪检测叶酸的含量，操作过程简便，重复性好，准确性高，对采样量限制小，较少量的样品就可以达到检测目的，实验周期短,实验方法简单，成本低。
附图说明
图1为叶酸水溶液的三维荧光扫描光谱图；
图2为叶酸水溶液的荧光强度随浓度变化趋势图；
图3为DDO水溶液的三维荧光光谱；
图4为DDO缓冲溶液的荧光强度随浓度的变化趋势图；
图5为缓冲液中的叶酸荧光强度随DDO浓度的变化趋势；
图6为DDO对叶酸荧光光谱的影响；
图7为叶酸缓冲液的荧光强度随乳清酸浓度的变化趋势；
图8为叶酸对DDO荧光光谱的影响；
图9为叶酸对DDO荧光猝灭的Stern-Volmer曲线；
图10为叶酸对DDO荧光猝灭的双对数曲线；
图11为DDO的荧光强度随叶酸浓度变化趋势。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的机理：
叶酸的识别分子为如式(Ⅰ)所示的1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(简称DDO)，可以自发地在水溶液中形成囊泡并产生分子识别作用。叶酸分子结构具有能与其头基产生具有分子识别作用的三重氢键的特点。本发明通过荧光光谱法研究这种bola型两亲分子1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(DDO)表面活性剂与叶酸的相互作用，据此建立了在叶酸分子结构不被破坏基础上的荧光分析法检测叶酸新方法。
1、叶酸自身荧光性质考察
利用三维荧光光谱仪考察叶酸三维荧光谱图，如图1所示，叶酸具有荧光性，且叶酸浓度为5.0×10-4mol/L，激发波长为400nm，发射波长为460nm时具有最大荧光强度。
设定三维荧光光谱仪的激发波长为400nm，发射波长为460nm，激发电压为800V，光源透过孔径为5.0nm，测定叶酸在不同浓度下的荧光强度。如图2所示，在25℃的试验温度下，叶酸的荧光强度随着叶酸浓度的增加而增强，当浓度达到1.0×10-3mol/L，荧光强度达到了一个平台期，直到浓度达到2.0×10-3mol/L范围内，当浓度大于2.0×10-3mol/L时，荧光强度随浓度的增大而减小，叶酸在这个过程中发生了荧光自猝灭现象。
叶酸的荧光强度对pH值很敏感，受缓冲溶液pH值的影响很大，只有在中性或碱性条件下，叶酸才能显示出足够的荧光信号，结合人体血液的pH值，本发明采用pH 7.0～7.8的磷酸盐缓冲液研究叶酸的荧光行为。
2、DDO自身荧光性质考察
利用三维荧光光谱仪测定DDO三维荧光谱图，如图3所示，DDO具有荧光性，且DDO的浓度为1.0×10-3mol/L，激发波长为320nm，发射波长为390nm时具有最大荧光强度。
设定三维荧光光谱仪的激发波长为320nm，发射波长为390nm，激发电压为800V，光源透过孔径为5.0nm，测定DDO在不同浓度下的荧光强度。如图4所示，在25℃的试验温度下，DDO缓冲溶液的荧光强度在浓度范围2.0×10-4mol/L到2.0×10-3mol/L内呈线性关系。
3、DDO对叶酸的荧光增强效应研究
固定叶酸浓度为5.0×10-4mol/L，改变DDO浓度，测定不同DDO浓度下的体系荧光强度以及叶酸发射波长随DDO浓度变化情况。如图5所示，在25℃的试验温度下，叶酸的荧光强度值随加入DDO分子的浓度增大而增大。随着DDO的浓度增加，叶酸的荧光强度先急剧增加(斜率K1为1.06×106L/mol)，到达某一拐点后，缓慢增加(斜率K2为2.65×105L/mol)。该拐点对应的浓度为2.24×10-4mol/L，此点恰是DDO的临界聚集浓度，说明DDO单体状态和囊泡聚集体对叶酸荧光强度的影响不同。如图6所示，在25℃的试验温度下，在DDO浓度分别为a＝5.0×10-4mol/L、b＝4.5×10-4mol/L、c＝4.0×10-4mol/L、d＝3.5×10-4mol/L、e＝3.0×10-4mol/L、f＝2.5×10-4mol/L、g＝2.0×10-4mol/L、h＝1.5×10-4mol/L、i＝1.0×10-4mol/L、j＝0.5×10-4mol/L、k＝0mol/L时的荧光光谱显示，DDO的加入没有使叶酸最大发射波长改变，说明与DDO相互作用并不会改变叶酸发光基团结构。
如图7所示，在25℃的试验温度下，乳清酸的加入会使叶酸的荧光强度增强，并且随着乳清酸浓度的增加，增强的程度呈线性变化趋势(斜率K3为1.79×105L/mol)，这说明乳清酸与叶酸的头基形成了多重氢键，因而使叶酸的荧光强度增强。
4、叶酸对DDO的荧光猝灭作用研究
DDO分子也有荧光，固定DDO浓度为4.0×10-4mol/L，选定激发波长为320nm，发射波长390nm，激发电压800V，光源透过孔径5.0nm，在pH 7.4情况下，测定了DDO与不同浓度叶酸相互作用的荧光发射光谱。图8显示了在25℃的试验温度下，在叶酸浓度分别为a＝0mol/L、b＝2.5×10-6mol/L、c＝5.0×10-6mol/L、d＝7.5×10-6mol/L、e＝10×10-6mol/L、f＝12.5×10-6mol/L、g＝15.0×10-6mol/L、h＝17.5×10-6mol/L、i＝20.0×10-6mol/L、j＝22.5×10-6mol/L时的荧光光谱，DDO的最大发射波长增大幅度为6nm，发生轻微红移，说明与叶酸相互作用可能会改变DDO发光基团结构。DDO的荧光强度随着叶酸浓度的增大而减弱，说明叶酸诱导DDO自身荧光猝灭的发生。
从荧光猝灭机理看，叶酸对DDO的猝灭可分为动态和静态猝灭。静态猝灭是叶酸和DDO在基态时生成复合物，而导致DDO荧光强度降低；动态猝灭是叶酸和DDO的激发态分子之间的互相作用而诱导的荧光猝灭。假定该猝灭过程是动态猝灭，符合Stern-Volmer方程：
F0/F＝1+Kqτ0[Q]
式中F0和F分别为缺失和存在猝灭剂时DDO的荧光强度，[Q]为猝灭剂浓度，Kq为双分子荧光猝灭速率常数，τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命(约为10-8s)。以F0/F对[Q]作图，如图9所示，得到方程y＝0.0114x+0.9899(R＝0.9931)。由斜率可得Kq＝1.14×1012L·mol-1·s-1。据文献报道，各类猝灭剂对分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010L·mol-1·s-1。而本发明求得的叶酸对DDO的猝灭过程速率常数远大于最大扩散碰撞猝灭常数，说明叶酸对DDO的猝灭过程是分子之间结合成为了基态复合物所导致的静态猝灭，而不是因为分子扩散和碰撞所引起的动态猝灭。
叶酸对DDO荧光猝灭为静态猝灭时，可以用荧光强度求算结合常数Ka与结合位点数n。荧光强度与猝灭剂浓度的关系满足lgKa+nlg[Q]＝lg(F0/F-1)，式中，n为结合位点数，Ka为叶酸和DDO的结合常数。在25℃下，以lg(F0/F-1)对lg[Q]作图。如图10所示，得到方程y＝1.926x+8.4683(R＝0.96132)，求得叶酸与DDO的结合常数Ka＝2.94×108L/mol，结合位点数n＝1.926。结合位点数n≈2说明叶酸在DDO的某两个位点上形成了复合物，且结合作用较强。
与紫外-可见分光光度法比较，其敏感度可高出2～4个数量级，其测定下限通常可达0.1～0.001g/mL。本发明中，DDO的荧光强度(F)与叶酸的浓度(cp)间存在良好的线性关系，如图11所示，其线性方程F＝3116.99－28.4759cp，相关系数(γ)为0.9959。叶酸浓度在1.25×10-6mol/L仍具有良好的线性关系，低于此浓度，体系荧光强度变化不明显，因此推出检出限可达1.25×10-6mol/L。
实施例
一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，包括以下步骤：
1)合成识别分子：将3.9025g，2.5×10-2mol的乳清酸与1.0018g，5.0×10-3mol的1,12-二氨基十二烷水溶液中混合，常温搅拌反应80～100小时得到混合液，在上述时间范围内都可反应得到混合液，具体的本实施例中常温搅拌反应96小时得到混合液，真空抽滤混合液，滤去未反应的原料，将混合液真空旋转蒸发除去水分得到浓缩产物，将产物真空干燥后用无水乙醇洗涤，进行二次过滤，过滤得到的固体再次真空干燥后得到乳白色粉末即为1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(DDO)，其反应方程式如下：
2)配制标准液：称取7.8000g磷酸二氢钠和0.7720g氢氧化钠溶于水，用1mol/L盐酸调节其pH值为7.0～7.8，在中性或偏碱性的环境下，叶酸都能显示出足够的荧光信号因此都可实施，具体的结合人体血液pH值，本实施例调节pH值为7.4，定容至1000mL得到磷酸缓冲溶液；称取0.2275g叶酸溶解于磷酸缓冲溶液中，定容于100mL棕色容量瓶中，得叶酸储备液，移取1.00mL叶酸储备液定容于100mL棕色容量瓶中，得到5×10-5mol/L叶酸标准溶液；称取0.04048g DDO溶解于磷酸缓冲溶液中，定容于100mL棕色容量瓶中，得到8×10-4mol/L DDO标准溶液，由于DDO在60℃以上的温度下会发生胶束聚集体、微极性等各类变化从而影响溶解性，因此在常温下借助超声振荡仪超声溶解；
3)测定荧光强度：在DDO浓度为4.0×10-4mol/L，激发光波长为320nm，发射光波长为390nm，激发电压为800V，光源透过孔径均为5.0nm的条件下，改变叶酸的浓度，测定不同叶酸浓度下DDO溶液的荧光强度，得出DDO溶液的荧光强度(F)与叶酸的浓度(cp)间具有线性关系，线性方程为F＝3116.99－28.4759cp，相关系数γ为0.9959，检出限为1.25×10-6mol/L；
4)取1mL叶酸标准液，依步骤3)的方法测定荧光值，计算出叶酸的浓度。
Claims (4)
1.一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成识别分子：将乳清酸与1,12-二氨基十二烷水溶液混合，常温搅拌反应80～100小时得到混合液，将所述混合液除去水分得到浓缩产物，将所述浓缩产物用无水乙醇洗涤，真空干燥后得到1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(DDO)，其反应方程式如下：
2)配制标准液：称取磷酸二氢钠和氢氧化钠溶于水，用盐酸调节其pH值为7.0～7.8，得到磷酸缓冲溶液；称取叶酸溶解于磷酸缓冲溶液中，得到叶酸标准溶液；称取DDO溶解于磷酸缓冲溶液中，得到DDO标准溶液；
3)测定三维荧光光谱特定条件：叶酸激发光波长为400nm，发射光波长为460nm；DDO激发光波长为320nm，发射光波长为390nm；
4)测定荧光强度：在DDO浓度为4.0×10-4mol/L，激发光波长为320nm，发射光波长为390nm，激发电压为800V，激发光源透过孔径均为5.0nm，发射光源透过孔径均为5.0nm的条件下，改变叶酸的浓度，测定不同叶酸浓度下DDO溶液的荧光强度；
5)得出线性方程：根据步骤4)得出DDO溶液的荧光强度(F)与叶酸的浓度(cp)间具有线性关系，线性方程为F＝3116.99－28.4759cp，相关系数γ为0.9959，检出限为1.25×10-6mol/L；
6)取1mL叶酸标准液，依步骤3)的方法测定荧光值，计算出叶酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于：所述步骤1)中乳清酸与1,12-二氨基十二烷的摩尔比为2:1。
3.根据权利要求1所述的一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于：所述步骤1)中反应时间为95～98小时。
4.根据权利要求1所述的一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于：所述步骤2)中DDO的溶解为常温下利用超声振荡仪超声溶解。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Inventor after: Yang Lijun Inventor after: Chen Zhongxiu Inventor before: Ge Bingqiang Inventor before: Yang Lijun Inventor before: Chen Zhongxiu |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |