CN107525790B - 基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法 - Google Patents
基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于磁固相微萃取‑碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,采用磁固相微萃取对复杂生物基体样本进行净化,叶酸能猝灭氮掺杂荧光碳量子点的荧光,其猝灭的荧光信号强度与叶酸浓度呈一定线性关系,据此建立了检测叶酸的荧光分光光度法;本发明利用磁性纳米材料具有优异的分散性与生物相溶性,对荧光分光光度法中基体带来严重干扰的物质,采用磁性纳米材料作为吸附剂进行磁固相萃取净化,大大降低了基体的干扰,使测定结果的灵敏度、特异性、重现性得到很大提高。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域,更具体的是一种基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测生物样品叶酸的方法。
背景技术
叶酸(Folic acid, FA)是一种水溶性B族维生素,是维持生物体正常生命过程不可或缺的一类有机物质,对人体具有重要的生理机能。叶酸作为一种辅酶,对机体细胞分裂和生长以及造血机能有着密不可分的联系。叶酸来源于绿叶蔬菜,缺乏时可导致生理功能低下及某些疾病如巨幼红细胞贫血症、粒细胞减少、胃肠功能紊乱、智力退化等的发生,尤其是对孕妇、乳母及处于生长发育旺盛期的婴幼儿。一般正常人叶酸的需求量为200-400 µg/d,世界卫生组织建议成人至少为200 µg/d,孕妇和乳母为400 µg/d。
近年来,国内外研究学者对不同产品中叶酸含量的检测方法进行了深入的研究,现有对叶酸的检测方法主要包括分光光度法、微生物法、等离子发射光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等,在众多检测方法中,荧光分光光度法由于其简单、灵敏及成本低等优点,广泛用于体系中待测物质的分析检测。但荧光分光光度法的最大缺点是抗干扰能力差,当检测基体复杂时,干扰物质的影响尤为明显,主要表现在测定结果的准确性、重现性方面。基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸的方法已报道,但由于没有进行样品净化,干扰带来的影响并没有消除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测灵敏、简单、样品萃取净化效果好、检测时间短的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法。
本发明利用氨基三乙酸制备水溶性氮掺杂荧光碳量子点,叶酸对其产生荧光猝灭作用,在对样品血液及尿液中叶酸的检测中,通过进行磁固相萃取对样品净化处理与没有进行处理结果比较,无论从检测灵敏度、检出限及线性范围都得到很大的改善与提高。
本发明基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法步骤如下:
(1)标准工作曲线的绘制:采用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置8个浓度在0.05~30 µmol/L范围内的叶酸标准溶液,加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL,涡旋混匀静置后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,以荧光猝灭强度对其相应浓度作图进行回归分析,即得到标准工作曲线,由此得到叶酸的线性回归方程与其相关系数;
(2) 样品处理
血液样品:取5 mL新鲜血液,于以8000 r/min转速离心15-20 min,去除沉淀,并向上层血浆中加入1-2mL体积浓度10-15%的高氯酸溶液沉淀蛋白,于5000 r/min转速下离心10-15min,取上清液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(3) 样品测定:取步骤或步骤处理过的样品,加入磁性纳米材料,涡旋使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取上清液1-2mL,向上清液中加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL,涡旋混匀静置后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(1)回归方程,计算出样品中叶酸的含量。
所述水溶性氮掺杂荧光碳量子点的制备方法为称取2.0-5.0g氨基三乙酸加入到100mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于200-250℃加热5-10h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3000-3500Da 的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点。
所述磁性纳米材料的制备方法为称取2.05-2.50g 硫酸亚铁铵和1.41-2.00g三氯化铁溶解于50mL去离子水中,将混合液转移至三口烧瓶中,氮气保护下搅拌并水浴加热;当反应液加热至75-85℃时,加入5-10mL含100 µL或100 mg壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌5-8 min后加入5-7mL氨水,氨水的质量体积浓度为28%,连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用乙醇和蒸馏水各洗涤3-5次,真空干燥后得磁性纳米材料。
所述柠檬酸-磷酸氢二钠pH为4-6。
所述磁性纳米材料用量为5-30 mg。
所述水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液用量为400μL。
所述涡旋混匀静置是指涡旋混匀1-15min,然后静置10-20 min。
本发明的优点在于:
1、本发明采用磁固相萃取结合叶酸对水溶性氮掺杂碳量子点的碳荧光猝灭作用,测定生物样品中叶酸,方法的灵敏度提高、检出限降低、线性范围增大;
2、由于采用了磁性纳米材料作吸附剂进行基体净化,大大降低了基体的干扰;
3、首次采用磁固相萃取结合荧光光度法进行生物样品中叶酸测定,方法操作简单、快速,弥补了荧光光度法的不足,为荧光光度法的应用提供了新的途径。
附图说明
图1为血液样品净化前后测定结果对照图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1:血液中叶酸的含量测定具体操作步骤如下:
(1)磁性纳米材料的制备:称取2.05 g 硫酸亚铁铵和1.41 g三氯化铁溶解于50mL去离子水中,将混合液转移至250 mL三口烧瓶中,氮气保护下机械搅拌并水浴加热,当反应液加热至80 ℃时,加入5 mL含100 µL壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌5 min后加入5mL氨水(28%,w/v),连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用适量的乙醇和蒸馏水各洗涤3次,在50 ℃下真空干燥12 h,即得磁性纳米材料;
(2) 水溶性氮掺杂荧光碳量子点(CQDs)的合成制备:称取2.0 g氨基三乙酸加入到100 mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于200℃加热5 h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点;
(3) 标准工作曲线的绘制:采用pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置以下浓度的叶酸标准液0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、30 µmol/L,加入400 μL步骤(2)制备的水溶性氮掺杂荧光碳量子点,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL,涡旋混匀1min静置10 min后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,以荧光猝灭强度对其相应浓度作图进行回归分析,即得到标准工作曲线的线性回归方程△F =2.1343C+4.3039,相关系数R2=0.9972;
(4) 血液样品前处理:取5 mL新鲜血液,于以8000 r/min转速离心20 min,去除沉淀,并向上层血浆中加入1mL体积浓度10% 的高氯酸溶液沉淀蛋白,于5000 r/min转速下离心10 min,取上清液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(5) 样品测定:取上述步骤(4)的上清液,加入25 mg步骤(1)制备的磁性纳米材料,涡旋7 min使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取出上清液1mL,向上清液中加入400μL步骤(2)制备的水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调pH至5.0,并定容于5 mL,涡旋混匀1min静置10 min后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(3)回归方程,计算得出叶酸的含量为3.76 µmol/L,检出限为1.2 nmol/L,相对标准偏差为4.2%;
图1为血液样品净化前后测定结果对照图;净化后的样品大大减少了基体对测定的干扰。
实施例2:尿液样品中叶酸的含量测定步骤如下:
(1)磁性纳米材料的制备:称取2.20g 硫酸亚铁铵和1.60 g三氯化铁溶解于50 mL去离子水中,将混合液转移至250 mL三口烧瓶中,氮气保护下机械搅拌并水浴加热,当反应液加热至75℃时,加入8mL含100 µL壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌6min后加入6 mL氨水(28%,w/v),连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用适量的乙醇和蒸馏水各洗涤4次,在50 ℃下真空干燥12 h,即得磁性纳米材料;
(2) 水溶性氮掺杂荧光碳量子点(CQDs)的合成制备:称取3.0 g氨基三乙酸加入到100 mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于220℃加热6h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3200Da的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点;
(3) 标准工作曲线的绘制:同实施例1步骤(3);
(4) 尿液样品:取5mL尿液,加入1g活性炭,立即涡旋混合30s,静置过滤,取其滤液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(5) 样品测定:取上述步骤(4)的提取液,加入5 mg 步骤(1)制备的磁性纳米材料,涡旋10 min使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取出上清液2mL,向上清液中加入400μL步骤(2)制备的水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调pH至4.0,并定容于5 mL,涡旋混匀5min静置15min后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(3)回归方程,得出叶酸的含量为4.98 µmol/L,检出限为0.5 nmol/L,相对标准偏差为3.1%。
实施例3:尿液样品中叶酸的含量测定步骤如下:
(1)磁性纳米材料的制备:称取2.50g 硫酸亚铁铵和2.00 g三氯化铁溶解于50 mL去离子水中,将混合液转移至250 mL三口烧瓶中,氮气保护下机械搅拌并水浴加热,当反应液加热至85℃时,加入10mL含100mg壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌8min后加入7mL氨水(28%,w/v),连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用适量的乙醇和蒸馏水各洗涤5次,在50 ℃下真空干燥12 h,即得磁性纳米材料;
(2) 水溶性氮掺杂荧光碳量子点(CQDs)的合成制备:称取5.0 g氨基三乙酸加入到100 mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于250℃加热10h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点;
(3) 标准工作曲线的绘制:同实施例1步骤(3);
(4) 尿液样品:取10mL尿液,加入3g活性炭,立即涡旋混合40s,静置过滤,取其滤液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(5) 样品测定:取上述步骤(4)的提取液,加入15 mg 步骤(1)制备的磁性纳米材料,涡旋12 min使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取出上清液2mL,向上清液中加入400μL上述步骤(2)的水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调pH至5.5,并定容于5 mL,涡旋混匀10min静置20 min后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(3)回归方程,得出叶酸的含量为4.85 µmol/L,检出限为0.5 nmol/L,相对标准偏差为2.6%。
实施例4:血液中叶酸的含量测定具体操作步骤如下:
(1)磁性纳米材料的制备:称取2.30 g 硫酸亚铁铵和1.71g三氯化铁溶解于50 mL去离子水中,将混合液转移至250 mL三口烧瓶中,氮气保护下机械搅拌并水浴加热,当反应液加热至85℃时,加入7mL含100mg壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌7min后加入6mL氨水(28%,w/v),连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用适量的乙醇和蒸馏水各洗涤3次,在50 ℃下真空干燥12 h,即得磁性纳米材料;
(2) 水溶性氮掺杂荧光碳量子点(CQDs)的合成制备:称取4.0 g氨基三乙酸加入到100 mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于230℃加热8h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3100Da的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点;
(3) 标准工作曲线的绘制:同实施例1步骤(3);
(4) 血液样品:取5 mL新鲜血液,于以8000 r/min转速离心15min,去除沉淀,并向上层血浆中加入2mL体积浓度10% 的高氯酸溶液沉淀蛋白,于5000 r/min转速下离心15min,取上清液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(5) 样品测定:取上述步骤(4)的提取液,加入30 mg步骤(1)制备的磁性纳米材料,涡旋7 min使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取出上清液1.5mL,向上清液中加入400 μL上述步骤(2)的水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调pH至6.0,并定容于5 mL,涡旋混匀12min静置15 min,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(3)回归方程,得出叶酸的含量为3.59 µmol/L,检出限为1.0 nmol/L,相对标准偏差为3.7%。
以上实施例与未经磁净化直接碳量子点猝灭法中叶酸测定比较,结果见表1;
表1 测定结果比较 (n=6)
由表1结果可知:用本发明方法与未经磁净化直接碳量子点猝灭测定方法相比,结果显示本发明方法的检出限与相对标准偏差均明显低于未经净化直接碳量子点猝灭测定方法,因其操作简便易行,成本低廉,绿色环保,可消除复杂基体干扰,且高灵敏度分析检测而更具优势。
Claims (5)
1.一种基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)标准工作曲线的绘制:采用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置8个浓度在0.05~30 µmol/L范围内的叶酸标准溶液,加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL,涡旋混匀静置后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,以荧光猝灭强度对其相应浓度作图进行回归分析,即得到标准工作曲线,由此得到叶酸的线性回归方程;
(2) 样品处理
①血液样品:取5 mL新鲜血液,以8000 r/min转速离心15-20 min,去除沉淀,并向上层血浆中加入1-2mL体积浓度10-15% 的高氯酸溶液沉淀蛋白,于5000 r/min下离心10 -15min,取上清液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
②尿液样品:取5-10mL尿液,加入1-3g活性炭,涡旋混合30-60s,静置过滤,取其滤液,避光保存于4 ℃冰箱待分析测定;
(3) 样品测定:取步骤或步骤处理过的样品,加入磁性纳米材料,涡旋使其充分混匀后,通过外加磁铁进行磁分离,弃去磁性纳米材料,取上清液1-2mL,向上清液中加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL,涡旋混匀静置后,于荧光分光光度计上,激发波长为350 nm,发射波长为440 nm测定荧光强度,代入步骤(1)回归方程,计算出样品中叶酸的含量;
所述水溶性氮掺杂荧光碳量子点的制备方法为称取2.0-5.0g氨基三乙酸加入到100mL超纯水中,超声5 min形成白色悬浊液,并转移至聚四氟乙烯反应釜,于200-250℃加热5-10h,自然冷却后,先用孔径为0.22μm滤膜过滤,后用截留分子量为3000-3500Da 的透析袋进行透析处理24 h,得到水溶性氮掺杂荧光碳量子点;
所述磁性纳米材料的制备方法为称取2.05-2.50g 硫酸亚铁铵和1.41-2.00g三氯化铁溶解于50mL去离子水中,将混合液转移至三口烧瓶中,氮气保护下搅拌并水浴加热;当反应液加热至75-85℃时,加入5-10mL含100 µL或100 mg壬酸的丙酮溶液;待混合物剧烈搅拌5-8 min后加入5-7mL氨水,氨水的质量体积浓度为28%,连续反应30 min后自然冷却至室温,利用外加磁铁将其产物分离,分别依次用乙醇和蒸馏水各洗涤3-5次,真空干燥后得磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,其特征在于:柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH为4-6。
3.根据权利要求1所述的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,其特征在于:磁性纳米材料用量为5-30mg。
4.根据权利要求1所述的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,其特征在于:水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液用量为400μL。
5.根据权利要求1所述的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法,其特征在于:涡旋混匀静置是指涡旋混匀1-15min,然后静置10-20 min。
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