CN115656072A - 一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法。本发明以Cu2O立方体为模板及铈离子为供体，在紫外光照射下制备二维Cu2O‑Ce纳米片，进一步与四(4‑羧基苯基)卟啉(TCPP)制备Cu2O‑Ce‑TCPP纳米材料，Cu2O‑Ce‑TCPP表现类漆酶纳米酶活性，亚硝酸盐存在加速Cu2O‑Ce‑TCPP催化4‑氨基安替比林（4‑AP）和邻氯酚（2,4‑DP）偶联显色氧化反应，基于亚硝酸盐浓度与氧化2,4‑DP红色线性关系，建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法，检出限为0.075 mg/kg。将本方法应用于食品中亚硝酸盐的检测分析，结果与GB 5009.33‑2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法相符。方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法。
背景技术
亚硝酸盐是一类含氮无机化合物的总称，食品生产中亚硝酸盐主要作为发色剂和防腐剂来使用。我国对食品中亚硝酸盐含量的最大使用量和最大残留限量进行了规定，并建立了多种检测亚硝酸盐的方法。测定亚硝酸盐的含量是食品安全检测中非常重要的项目。目前，亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法和分光光度法。食品中亚硝酸盐的测定国家标准方法为盐酸萘乙二胺分光光度法，原理是试样经沉淀蛋白质、除去脂肪，在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较以分光光度法定量。
纳米酶是指具有天然酶催化活性的纳米材料。其成本低、易储存、酶活性可调节控制。其中，漆酶是一种以铜离子为催化中心的多酚氧化酶，它可以通过电子的转移来催化多种酚类和酚胺类底物氧化并产生无害的水，独特的环保特性使其在纳米酶的研究中备受瞩目。近年来纳米酶包括漆酶模拟酶已在食品分析、生物传感、医学诊断和工业生产中得到广泛的应用。本发明人前期研究了油酸包覆四氧化三铁的拟过氧化酶用于亚硝酸盐的测定（ZL 202011251130.4），基于纳米酶进行亚硝酸盐的测定的其他研究也有相关报道，但也存在实际测定中的一些干扰问题，而基于模拟漆酶纳米酶测定亚硝酸盐，现并未有相关报道，由于漆酶通过电子的转移来催化酚类和酚胺类底物，氧化底物及氧化能力有限，干扰大大降低。
本发明以Cu2O立方体为模板及铈离子为供体，在紫外光照射下制备二维Cu2O-Ce纳米片，进一步与四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)制备Cu2O-Ce-TCPP纳米材料，Cu2O-Ce-TCPP表现类漆酶纳米酶活性，亚硝酸盐存在加速Cu2O-Ce-TCPP催化4-氨基安替比林（4-AP）和邻氯酚（2,4-DP）偶联显色氧化反应，基于亚硝酸盐浓度与氧化2,4-DP红色线性关系，建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法，检出限为0.075 mg/kg。将本方法应用于食品中亚硝酸盐的检测分析，结果与GB 5009.33-2016 食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法相符。方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟漆酶结合亚硝酸盐的加速氧化作用检测亚硝酸盐的方法，利用亚硝酸盐加速4-氨基安替比林（4-AP）和邻氯酚（2,4-DP）偶联显色氧化反应效果，建立亚硝酸盐检测新方法。
一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法，包括以下步骤：
（1）在亚硝酸盐标准溶液中加入Cu2O-Ce-TCPP纳米酶、2,4-二氯苯酚(2,4-DP)、4-氨基安替比林(4-AP)，并用pH 6.2 MES 缓冲溶液定容，制得的亚硝酸盐溶液浓度范围在0.32-143.75 μg/g，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液置于506 nm波长处测定吸光度，建立吸光度与亚硝酸盐浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）提取净化检测样品中亚硝酸盐，获得样品测定液，在样品测定液中加入Cu2O-Ce-TCPP纳米酶、2,4-DP、4-AP，并用pH 6.2 MES 缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液置于506 nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中亚硝酸盐含量；
所述Cu2O-Ce-TCPP纳米酶制备如下：
② Cu2O-Ce的制备：取上述制备的Cu2O颗粒30-35mg，加入50%乙醇10 -15 mL，0.1mol/L 10-15 mL Ce(NO3)3，超声处理20-30 min，然后在紫外灯下照射搅拌1-1.5 h，即得。
③ Cu2O-Ce-TCPP的制备：将上述制备的Cu2O-Ce溶液，加入到0.02gTCPP被溶解在DMF与正己烷 (v/v=3:1)混合溶液10mL中，60 ℃搅拌6-8 h，离心，用乙醇和去离子水交替洗涤2-3次，真空干燥，即得。
所述的样品测定液制备如下：
所述改性活性炭制备包括：取活性炭，在0.1mol/L HCl 或HNO3溶液中浸泡2 h后，室温下震荡12-20 h，过滤，蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性，进行抽滤，100℃下干燥3-6h，即得改性活性炭，其中改性活性炭与样品液的重量比为0.5-3：10。
100µg/mL Cu2O-Ce-TCPP纳米酶添加量为50~100µL，1mg/mL 2,4-DP添加量为100-150 µL，1mg/mL 4-AP添加量为100-150 µL，离心条件为离心时间5-10 min，离心速率1000-3000 r/min。
本发明的优点在于：
1、本发明利用亚硝酸盐加速Cu2O-Ce-TCPP的拟漆酶氧化4-氨基安替比林（4-AP）和邻氯酚（2,4-DP）偶联显色氧化反应，基于亚硝酸盐浓度与氧化产物线性关系，建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法，方法具有灵敏度高、操作简便、特异性强特点。
2、利用Cu2O纳米立方体及铈离子制备二维Cu2O-Ce-TCPP纳米片，从Cu2O中释放出来的Cu+会被溶解氧及Ce4+氧化成Cu2+及Ce3+，形成了类漆酶活性催化循环，表现出类漆酶活性。
3、利用NO2 -对Cu2O-Ce-TCPP纳米酶中Ce4+/ Ce3+及 Cu+/Cu2+化合价的调节，加速Cu2O-Ce-TCPP的拟漆酶的活性，提高检测方法的特异性。
附图说明
图1为实施例1合成Cu2O-Ce-TCPP的SEM及TEM图。
图2为实施例1中亚硝酸盐对Cu2O-Ce-TCPP的拟漆酶氧化4-AP和2,4-DP偶联显色氧化反应增敏紫外-可见吸收光谱，用于亚硝酸盐检测。
图3为检测亚硝酸盐线性方程。
图4为共存离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cl-、SO4 2-、NO3 -等）对亚硝酸盐的影响。
图5为糖类（葡萄糖、麦芽糖及蔗糖等）和氨基酸（胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸、及甘氨酸等）对亚硝酸盐的影响。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：腌菜样品中亚硝酸盐的测定
1、Cu2O的制备：在2mol/L 10 mL的NaOH溶液中加入0.01 mol/L 100 mL CuCl2，室温搅拌30 min，然后加入0.6mol/L 5 mL抗坏血酸，在55℃水浴中搅拌5 h，用去离子水洗涤2-3次，真空干燥，即得。
2、Cu2O-Ce的制备：取上述制备的Cu2O颗粒30mg，加入50%乙醇10 mL，0.1 mol/L 10mL Ce(NO3)3，超声处理25 min，然后在紫外灯下照射搅拌1 h，即得。
3、Cu2O-Ce-TCPP的制备：将上述制备的Cu2O-Ce溶液，加入到0.02g TCPP被溶解在DMF与正己烷 (v/v=3:1)混合溶液10mL中，60℃搅拌6 h，离心，用乙醇和去离子水交替洗涤2-3次，真空干燥，即得。其SEM及TEM见图1，从中可以看出，制备的Cu2O-Ce-TCPP为立方体为主。
4、改性活性炭制备：取100 g活性炭，在0.1 mol/L HCl 或HNO3溶液中浸泡2h后，室温下震荡12-20 h，过滤，再浸泡于0.1 mol/L高锰酸钾2 h，过滤，蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性，进行抽滤，100℃下干燥3-6 h，即得改性活性炭。
5、亚硝酸盐工作曲线制作：在5 mL具塞比色管中加入50 µL Cu2O-Ce-TCPP纳米酶，1mg/mL 2,4-二氯苯酚(2,4-DP) 100µL，1mg/mL4-氨基安替比林(4-AP) 100µL，0.32-143.75 μg/g 亚硝酸盐标准溶液，用MES 缓冲溶液（30 mM, pH = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度A，以亚硝酸盐浓度c为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，见图2及图3，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。
6、方法特异性考察：图4、图5是亚硝酸盐浓度为2 μmol/L，共存离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cl-、SO4 2-、NO3 -）及糖类（葡萄糖、麦芽糖及蔗糖）和氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸及谷氨酰胺）对亚硝酸盐的影响结果，以上干扰物质浓度为20 μmol/L，分别加入 Cu2O-Ce-TCPP、2,4-DP及4-AP，仅有亚硝酸盐有明显的增敏作用，其它物质几乎没有增敏作用，方法具有好的选择特异性。
7、腌菜样品中亚硝酸盐含量的测定
（1）准确称取2.5 g（精确到0.001 g）经匀浆均匀的腌菜样品，置于250 mL烧杯中，加入12.5 mL硼砂饱和溶液，搅拌均匀，用200 mL 70℃左右的热水将烧杯中的试样全部加入500 mL烧杯中，于沸水浴中加热 15 min，加入10%乙酸锌溶液2.5 mL，搅拌10 min，离心，上清液过0.22 μm滤膜，用蒸馏水定容250mL，得样品液。
（2）样品脱色处理：取步骤（2）制备的样品液10 mL加入3 g改性活性炭，涡旋混合1-2 min，离心分离，取出上清液，制得样品测定液。
（3）样品测定：在5 mL具塞比色管中加入50 µL Cu2O-Ce-TCPP纳米酶，1mg/mL 2,4-二氯苯酚(2,4-DP) 100 µL，1mg/mL4-氨基安替比林(4-AP) 100 µL，加入步骤（2）制备样品测定液，用MES 缓冲溶液（30 mM, pH = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度A，代入步骤5回归方程，计算样品亚硝酸盐含量为3.90 μg/g。
（4）回收率与精密度实验：在腌菜样品中分别添加3个不同浓度的亚硝酸盐标准溶液。每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2。测得亚硝酸盐的加标回收率在96.2％～101.9％，RSD在0.28％～2.3％，本方法有好的的准确性和精密度。
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
表2 样品加标回收率及RSD（n = 3）
实施例2：小米辣样品中亚硝酸盐的测定
1、Cu2O的制备：同实施例1。
2、Cu2O-Ce的制备：同实施例1。
3、Cu2O-Ce-TCPP的制备：同实施例1。
4、改性活性炭制备：：同实施例1。
5、亚硝酸盐工作曲线制作：同实施例1。
6、方法特异性考察：同实施例1。
7、小米辣样品中亚硝酸盐含量的测定
（1）小米辣样品样品：同实施例1。
（2）样品脱色处理：同实施例1。
（3）样品测定：同实施例1，样品亚硝酸盐含量为5.21 μg/g。
实施例3：腊肉制品中亚硝酸盐的测定
1、Cu2O的制备：同实施例1。
2、Cu2O-Ce的制备：同实施例1。
3、Cu2O-Ce-TCPP的制备：同实施例1。
4、改性活性炭制备：：同实施例1。
5、亚硝酸盐工作曲线制作：同实施例1。
6、方法特异性考察：同实施例1。
7、腊肉制品中亚硝酸盐含量的测定
（1）腊肉制品：将腊肉用匀浆处理，从匀浆后的试样中称取 5 g（精确到0.001 g）样品，置于50 mL烧杯中，加12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，用150 mL 70 ℃左右的热水将烧杯中的试样全部加入500 mL烧杯中，于沸水浴中加热 15 min，加入10%硫酸锌溶液2.5mL，搅拌10 min，离心，上清液过0.22 μm滤膜，用蒸馏水定容250mL，得样品液。
（2）样品脱色处理：同实施例1；
（3）样品测定：同实施例1，样品亚硝酸盐含量为10.78 μg/g。
实施例4：发酵饮料样品亚硝酸盐含量的测定
1、Cu2O的制备：同实施例1。
2、Cu2O-Ce的制备：同实施例1。
3、Cu2O-Ce-TCPP的制备：同实施例1。
4、改性活性炭制备：：同实施例1。
5、亚硝酸盐工作曲线制作：同实施例1。
6、方法特异性考察：同实施例1。
7、发酵饮料样品亚硝酸盐的测定：
（1）发酵饮料样品：取 10.0 mL 的待测样品置于 100 mL 烧杯中，加入5 mL饱和硼砂溶液，用玻璃棒搅拌均匀后引流至 500 mL 的烧杯中，用蒸馏水洗 3-4 次，加入 5 mL的 220 g/L 乙酸锌溶液，搅拌10 min，离心，上清液过0.22 μm滤膜，用蒸馏水定容250mL，得样品液。
（2）样品脱色处理：取步骤（2）制备的样品液10 mL加入2g改性活性炭，涡旋混合1-2 min，离心分离，取出上清液，制得样品测定液。
（3）样品测定：在5 mL具塞比色管中加入50-100 µL Cu2O-Ce-TCPP纳米酶，1mg/mL2,4-二氯苯酚(2,4-DP) 100 µL，1mg/mL4-氨基安替比林(4-AP) 100µL，加入步骤（2）制备样品测定液，用MES 缓冲溶液（30 mM, pH = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度A，代入步骤5回归方程，计算发酵饮料样品亚硝酸盐含量为16.30 μg/g。
将实施例1-4用本发明方法与国家标准GB 5009.33-2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法进行比对，同时也增加了改性活性炭净化处理，结果见表3。从结果可以看出，两种方法结果一致。
表3本法与GB方法测定结果
本发明建立的亚硝酸盐测定法具有处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。
Claims (4)
1.一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法，包括以下步骤：
（1）在亚硝酸盐标准溶液中加入Cu2O-Ce-TCPP纳米酶、2,4-二氯苯酚(2,4-DP)、4-氨基安替比林(4-AP)，并用pH 6.2 MES 缓冲溶液定容，制得的亚硝酸盐溶液浓度范围在0.32-143.75 μg/g，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液置于506 nm波长处测定吸光度，建立吸光度与亚硝酸盐浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）提取净化检测样品中亚硝酸盐，获得样品测定液，在样品测定液中加入Cu2O-Ce-TCPP纳米酶、2,4-DP、4-AP，并用pH 6.2 MES 缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液置于506 nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中亚硝酸盐含量；
所述Cu2O-Ce-TCPP纳米酶制备如下：
② Cu2O-Ce的制备：取上述制备的Cu2O颗粒30-35mg，加入50%乙醇10 -15 mL，0.1 mol/L 10-15 mL Ce(NO3)3，超声处理20-30 min，然后在紫外灯下照射搅拌1-1.5 h，即得；
③ Cu2O-Ce-TCPP的制备：将上述制备的Cu2O-Ce溶液，加入到0.02gTCPP被溶解在DMF与正己烷 (v/v=3:1)混合溶液10mL中，60 ℃搅拌6-8 h，离心，用乙醇和去离子水交替洗涤2-3次，真空干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法，其特征在于：所述的样品测定液制备如下：
3.根据权利要求2所述的基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法，其特征在于：所述改性活性炭制备包括：取活性炭，在0.1mol/L HCl 或HNO3溶液中浸泡2 h后，室温下震荡12-20 h，过滤，蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性，进行抽滤，100℃下干燥3-6h，即得改性活性炭，其中改性活性炭与样品液的重量比为0.5-3：10。
4.根据权利要求1所述的基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法，其特征在于：100µg/mL Cu2O-Ce-TCPP纳米酶添加量为50~100µL，1mg/mL 2,4-DP添加量为100-150 µL，1mg/mL 4-AP添加量为100-150 µL，离心条件为离心时间5-10 min，离心速率1000-3000 r/min。
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