CN112345475A - 一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法,本发明采用油酸包覆四氧化三铁的拟过氧化酶特性,双氧水存在下氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺,亚硝酸盐加速氧化反应进行,基于亚硝酸盐浓度与氧化TMB蓝色线性关系,建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法,本方法检出限为0.1µg/g;将本方法应用于食品中亚硝酸盐的检测分析,结果与GB 5009.33‑2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法相符;方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域,具体为一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法。
背景技术
硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于人类环境中,是自然界中最普遍的含氮化合物。人体内硝酸盐在微生物的作用下可还原为亚硝酸盐,N-亚硝基化合物的前体物质。亚硝酸盐来源于食物中作为发色剂和防腐剂的亚硝酸盐,从食物中添加的硝酸盐转化而来,蔬菜,尤其是从不新鲜的蔬菜中转化而来。亚硝酸盐可与相关的化学物质生成致癌物质,国家也在不断提高重视,对食品中亚硝酸盐含量进行分析十分重要。目前,亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法和分光光度法。食品中亚硝酸盐的测定国家标准方法为盐酸萘乙二胺分光光度法,原理是试样经沉淀蛋白质、除去脂肪,在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料,与标准比较以分光光度法定量。
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能,又有催化功能的模拟酶。纳米酶作为一类新型的模拟酶,它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点,人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用,让纳米酶具有更大的应用前景。四氧化三铁具有过氧化氢纳米模拟酶特性早已得到证实,但由于酶活低、纳米粒子易团聚等缺陷使其应用受到限制。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法,这是拟过氧化酶结合亚硝酸盐的加速氧化作用检测亚硝酸盐的方法,本发明采用油酸包覆四氧化三铁拟过氧化酶特性,解决了四氧化三铁纳米粒子易团聚,同时过氧化酶活性高的特点,在双氧水存在下,氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),亚硝酸盐存在加速氧化反应进行,基于亚硝酸盐浓度与氧化TMB蓝色线性关系,建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法,检出限为0.1 µg/g;实际应用中将对测定干扰的基体色素通过改性活性炭的吸附,有效提高了检测灵敏度及重现性。本发明方法具有灵敏度高、特异性、操作简单、快速等特点。
本发明快速检测食品中亚硝酸盐的方法,包括以下步骤:
(1)亚硝酸盐工作曲线制作
在10mL具塞比色管中加入50~100µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、亚硝酸盐标准溶液,用硫酸调pH为2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置5~10min,其中亚硝酸盐在具塞比色管中的浓度在0.46~200μg/g范围内,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处测定吸光度A,以亚硝酸盐浓度为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程;
(2)样品处理
香肠或腌肉样品:将香肠或腌肉匀浆处理,从匀浆后的试样中称取5g(精确到0.001g)样品,置于烧杯中,加12.5mL饱和硼砂溶液,搅拌均匀,加入150~200mL 65~75℃热水,于沸水浴中加热10~20min,最后加入质量浓度10%硫酸锌溶液2.5mL,搅拌10min,离心,上清液过0.22 μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
液体饮料样品:取10.0mL的待测样品置于烧杯中,加入5mL饱和硼砂溶液,搅拌均匀后引流至另一个烧杯中,用蒸馏水洗烧杯3~4次,加入5mL的220g/L乙酸锌溶液,搅拌8~12min,离心,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
腌菜样品:准确称取2.5g(精确到0.001g)经匀浆处理的腌菜样品,置于烧杯中,加入12.5mL硼砂饱和溶液,搅拌均匀,加入150~200mL 65~75℃的热水,于沸水浴中加热10~20min,加入质量浓度10%乙酸锌溶液2.5mL,搅拌8~12min,离心,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
(3)样品脱色处理:在步骤(2)制备的样品液中加入改性活性炭,涡旋混合1~2 min,离心分离,取出上清液,制得样品测定液;
(4)样品测定:在10mL具塞比色管中加入50~100µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、加入步骤(3)制备样品测定液,用硫酸调pH为2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置5~10min,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,代入步骤(1)回归方程,计算得到样品亚硝酸盐含量。
所述油酸包覆四氧化三铁由以下方法制得:在氮气保护下,将FeCl3·6H2O和(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O溶解在去离子水中,在溶液搅拌并加热到80±5℃后,向溶液中滴加NH3·H2O(常规市售产品),然后将油酸加到溶液中,溶液继续在80±5℃下搅拌30~40min,用磁铁分离磁性材料,分离后的磁性材料依次用乙醇、水洗涤2~3次即得油酸包覆四氧化三铁;其中FeCl3·6H2O:(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O:去离子水:NH3·H2O:油酸g:g:mL:mL:mL为1.5~2:1:15~20:3~5:0.5~1。
所述改性活性炭是将活性炭置于0.1mol/L HCl或0.1mol/L HNO3溶液中浸泡2h后,室温下震荡12~20h,过滤,再在0.1mol/L高锰酸钾浸泡2h,过滤,蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性,抽滤,100℃下干燥3~6 h即得,其中改性活性炭与样品液的质量体积比g:mL为0.5~3:10。
所述离心是在1000~3000 r/min下处理5~10 min。
本发明的优点在于:
1、本发明利用亚硝酸盐加速油酸包覆四氧化三铁的拟过氧化酶氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应,基于亚硝酸盐浓度与氧化TMB蓝色线性关系,建立高灵敏、选择性强亚硝酸盐检测新方法,方法具有灵敏度高、操作简便、特异性强特点;
2、通过酸及氧化剂对活性炭处理,使活性炭表面活化带有基团,同时将活性炭中杂质进行清理,更多的孔隙展露出来,在实际样品测定中,能够很好吸附基体色素,有效提高检测灵敏度及重现性;
3、油酸包覆四氧化三铁的拟过氧化酶活性高,同时在实际使用中,有效解决了四氧化三铁易团聚的问题。
附图说明
图1为实施例1中亚硝酸盐对油酸包覆四氧化三铁的拟过氧化酶氧化TMB增敏紫外-可见吸收光谱图;
图2为共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cl-、SO4 2-、NO3 -等)对亚硝酸盐的影响结果,图中Blank为单独添加亚硝酸盐的结果;
图3为糖类(葡萄糖、麦芽糖及蔗糖等)和氨基酸(胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等)对亚硝酸盐的影响结果,图中Blank为单独添加亚硝酸盐的结果。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1:腌菜样品中亚硝酸盐的测定
1、油酸包覆四氧化三铁制备:在氮气保护下,将4.10g的FeCl3·6H2O和2.82g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O溶解在50mL去离子水中,在溶液搅拌并加热到80±5℃后,向溶液中滴加10mLNH3·H2O;然后将2mL油酸加到溶液中,继续在80±5℃下搅拌30min,用磁铁分离磁性材料,分离后的磁性材料用依次乙醇、水洗涤3次即得;
2、改性活性炭制备:取100g活性炭,在0.1mol/L HCl溶液中浸泡2h后,室温下震荡15h,过滤,再浸泡于0.1mol/L高锰酸钾2h,过滤,蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性,进行抽滤,100℃下干燥4 h,即得改性活性炭;
3、亚硝酸盐工作曲线制作:在10mL具塞比色管中加入80µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、亚硝酸钠标准溶液,用硫酸调pH为2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置10min,其中亚硝酸钠在具塞比色管中的浓度在0.46~200μg/g范围内,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,以亚硝酸钠浓度为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程,见图1,得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1;
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
4、方法特异性考察:将亚硝酸钠与离子、糖类、氨基酸共存检测本发明方法体系的特异性,体系中亚硝酸盐浓度为2μmol/L,方法同上;
共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cl-、SO4 2-、NO3 -)及糖类(葡萄糖、麦芽糖及蔗糖)和氨基酸(甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸及谷氨酰胺)对亚硝酸盐的影响结果见图2、图3,以上干扰物质浓度为20μmol/L,结果显示仅有亚硝酸盐有明显的增敏作用,其它物质几乎没有增敏作用,方法具有好的选择特异性;
5、腌菜样品中亚硝酸盐含量的测定
(1)准确称取2.5 g(精确到0.001 g)经匀浆均匀的腌菜样品,置于250mL烧杯中,加入12.5mL硼砂饱和溶液,搅拌均匀,用200mL 70℃的热水将烧杯中的试样全部加入500mL烧杯中,于沸水浴中加热 15min,加入质量浓度10%乙酸锌溶液2.5mL,搅拌10min,2000 r/min下离心8min,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
(2)样品脱色处理:取步骤(2)制备的样品液10mL加入3g改性活性炭,涡旋混合2min,3000r/min下离心5min,取出上清液,制得样品测定液;
(3)样品测定:在10mL具塞比色管中加入80µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL,加入步骤(3)制备样品测定液,用硫酸调pH位2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置10min,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,代入步骤(1)回归方程,计算样品亚硝酸盐含量为6.12 μg/g;
(4)回收率与精密度实验:在腌菜样品中分别添加3个不同浓度的亚硝酸盐标准溶液;每个浓度平行测定3次,计算加标回收率,并计算出相对标准偏差RSD,结果见表2;测得亚硝酸盐的加标回收率在97.1%~99.9%,RSD在0.21%~1.2%,本方法有好的的准确性和精密度;没有经过改性活性炭净化的样品,加标回收率及RSD均较处理的结果差,也证明用改性活性炭净化样品的必要性。
表2 样品加标回收率及RSD(n = 3)
实施例2:香肠样品中亚硝酸盐的测定
1、油酸包覆四氧化三铁制备:油酸包覆四氧化三铁由以下方法制得:在氮气保护下,将FeCl3·6H2O和(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O溶解在去离子水中,在溶液搅拌并加热到80±5℃后,向溶液中滴加NH3·H2O,然后将油酸加到溶液中,溶液继续在80±5℃下搅拌40min,用磁铁分离磁性材料,分离后的磁性材料依次用乙醇、水洗涤2次即得油酸包覆四氧化三铁;其中FeCl3·6H2O:(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O:去离子水:NH3·H2O:油酸g:g:mL:mL:mL为2:1:20:5:1;
2、改性活性炭制备:改性活性炭是将活性炭置0.1mol/L HNO3溶液中浸泡2h后,室温下震荡18h,过滤,再在0.1mol/L高锰酸钾浸泡2h,过滤,蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性,抽滤,100℃下干燥5h即得;
3、亚硝酸盐工作曲线制作:同实施例1;
4、香肠样品中亚硝酸盐含量的测定
(1)香肠样品:将香肠用匀浆处理,从匀浆后的试样中称取 5g(精确到0.001 g)样品,置于50mL烧杯中,加12.5mL饱和硼砂溶液,搅拌均匀,用150mL75℃的热水将烧杯中的试样全部加入500mL烧杯中,于沸水浴中加热20min,加入质量浓度10%硫酸锌溶液2.5mL,搅拌10min,3000r/min下离心5min,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
(2)样品脱色处理:取步骤(2)制备的样品液10mL加入0.5g改性活性炭,涡旋混合1min,2000 r/min下离心10min,取出上清液,制得样品测定液;
(3)样品测定:在10mL具塞比色管中加入50µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL,加入步骤(3)制备样品测定液,用硫酸调pH2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置8min,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,代入步骤(1)回归方程,计算样品亚硝酸盐含量为8.54 μg/g。
实施例3:熏肉制品中亚硝酸盐的测定
1、油酸包覆四氧化三铁制备:同实施例1;
2、改性活性炭制备:同实施例1;
3、亚硝酸盐工作曲线制作:同实施例1;
4、熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定,方法同实施例2,计算样品亚硝酸盐含量为3.95 μg/g。
实施例4:果汁饮料样品亚硝酸盐含量的测定
1、油酸包覆四氧化三铁制备:同实施例1;
2、改性活性炭制备:同实施例1;
3、亚硝酸盐工作曲线制作:同实施例1;
4、果汁饮料样品亚硝酸盐的测定:
(1)果汁饮料样品:取10.0mL 的待测样品置于100mL烧杯中,加入5mL饱和硼砂溶液,用玻璃棒搅拌均匀后引流至500mL的烧杯中,用蒸馏水洗3次烧杯,加入5mL的220 g/L乙酸锌溶液,搅拌10min,1500 r/min下离心10min,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
(2)样品脱色处理:取步骤(2)制备的样品液10mL加入2g改性活性炭,涡旋混合2min,1500 r/min下离心10min,取出上清液,制得样品测定液;
(3)样品测定:在10mL具塞比色管中加入50µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL,加入步骤(3)制备样品测定液,用硫酸调pH2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置10min,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,代入步骤(1)回归方程,计算果汁样品亚硝酸盐含量为5.86 μg/g。
将实施例1-4用本发明方法与国家标准GB 5009.33-2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法进行比对,同时也增加了改性活性炭净化处理,结果见表3,从结果可以看出,两种方法结果一致:
表3加标回收率及相对标准偏差(μg/g)
本发明建立的亚硝酸盐测定法具有处理步骤少,所用时间短,处理成本低,操作简便,不需要大型仪器设备,在实际检测中具有较强优势。
Claims (4)
1.一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)亚硝酸盐工作曲线制作
在10mL具塞比色管中加入50~100µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、亚硝酸盐标准溶液,用硫酸调pH为2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置5~10min,其中亚硝酸盐在具塞比色管中的浓度在0.46~200μg/g
范围内,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处测定吸光度A,以亚硝酸盐浓度为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程;
(2)样品处理
香肠或腌肉样品:将香肠或腌肉匀浆处理,从匀浆后的试样中称取5.000g样品,置于烧杯中,加12.5mL饱和硼砂溶液,搅拌均匀,加入150~200mL 65~75℃热水,于沸水浴中加热10~20min,最后加入质量浓度10%硫酸锌溶液2.5mL,搅拌10min,离心,上清液过0.22 μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
液体饮料样品:取10.0mL的待测样品置于烧杯中,加入5mL饱和硼砂溶液,搅拌均匀后引流至另一个烧杯中,用蒸馏水洗烧杯3~4次,加入5mL的220g/L乙酸锌溶液,搅拌8~12min,离心,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
腌菜样品:准确称取2.5000g经匀浆处理的腌菜样品,置于烧杯中,加入12.5mL硼砂饱和溶液,搅拌均匀,加入150~200mL 65~75℃的热水,于沸水浴中加热10~20min,加入质量浓度10%乙酸锌溶液2.5mL,搅拌8~12min,离心,上清液过0.22μm滤膜,用蒸馏水定容至250mL,得样品液;
(3)样品脱色处理:在步骤(2)制备的样品液中加入改性活性炭,涡旋混合1~2 min,离心分离,取出上清液,制得样品测定液;
(4)样品测定:在10mL具塞比色管中加入50~100µL油酸包覆四氧化三铁、5mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、加入步骤(3)制备样品测定液,用硫酸调pH为2,去离子水稀释至刻度,摇匀,静置5~10min,磁铁分离油酸包覆四氧化三铁,取上清液,在654nm波长处,测定吸光度A,代入步骤(1)回归方程,计算得到样品亚硝酸盐含量。
2.根据权利要求1所述的快速检测食品中亚硝酸盐的方法,其特征在于,油酸包覆四氧化三铁由以下方法制得:在氮气保护下,将FeCl3·6H2O和(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O溶解在去离子水中,在溶液搅拌并加热到80±5℃后,向溶液中滴加NH3·H2O,然后将油酸加到溶液中,溶液继续在80±5℃下搅拌30~40min,用磁铁分离磁性材料,分离后的磁性材料依次用乙醇、水洗涤2~3次即得油酸包覆四氧化三铁;其中FeCl3·6H2O:(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O:去离子水:NH3·H2O:油酸g:g:mL:mL:mL为1.5~2:1:15~20:3~5:0.5~1。
3.根据权利要求1所述的快速检测食品中亚硝酸盐的方法,其特征在于:改性活性炭是将活性炭置于0.1mol/L HCl或0.1mol/L HNO3溶液中浸泡2h后,室温下震荡12~20h,过滤,再在0.1mol/L高锰酸钾浸泡2h,过滤,蒸馏水冲洗至活性炭表面为中性,抽滤,100℃下干燥3~6 h即得,其中改性活性炭与样品液的质量体积比g:mL为0.5~3:10。
4.根据权利要求1所述的快速检测食品中亚硝酸盐的方法,其特征在于:离心是在1000~3000 r/min下处理5~10 min。
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