CN104195130A - 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents
一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104195130A CN104195130A CN201410411026.5A CN201410411026A CN104195130A CN 104195130 A CN104195130 A CN 104195130A CN 201410411026 A CN201410411026 A CN 201410411026A CN 104195130 A CN104195130 A CN 104195130A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- nano
- charcoal
- micro
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶的制备方法。将磁性四氧化三铁纳米颗粒与油酸钠溶液复合形成纳米复合物，所得纳米复合物与温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂以及乳化剂溶液混合，通过乳液聚合反应制备磁性微/纳米胶；依据所得微/纳米胶的相转变特性调节溶液温度，使微/纳米胶在生物炭表面形成包被；将所得生物炭载体与游离脂肪酶溶液混合，使脂肪酶分子渗入载体表面的微/纳米凝胶网络，通过油/水界面激活脂肪酶的催化活性位点，进一步通过戊二醛交联反应使活性脂肪酶固定化。采用该方法制备的固定化脂肪酶催化活性得到较好的提高，所制备的磁性固定化酶可借助磁体方便地从反应介质中分离回收、应用成本低。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪酶固定化技术领域，尤其涉及一种磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
传统的脂肪酶固定化载体往往采用惰性的无机或有机材料（在中国专利公开号CN102191236A、CN101613690A、CN101381721A、CN101280297A中均有介绍），这些载体用于酶固定的过程缺乏可调控性，难以维持较高的脂肪酶催化活性。与传统的惰性载体相比，智能化高分子材料（如温度敏感型水凝胶）是一类理想的酶固定载体，其在增加酶负载量、保持酶分子构象和催化活性、以及提高固定化酶再利用性等方面具有重要的应用价值。我们前期研究表明，聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶及其共聚物是一类具有温度敏感性的智能水凝胶（Hu等，Journal of Materials Chemistry. 2009），其独特的“溶胀吸水/收缩排水”特性可用于负载酶等生物大分子，并有可能通过温度变化对脂肪酶固定化过程进行调控。另一方面，磁性材料用于酶固定也具有独特优势，其固定化过程易于调控、操作简单，且固定化酶便于回收再利用。如，中国专利公开号CN101503683A公开了一种磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶,该专利采用氨基化的磁性纳米颗粒作为酶固定化载体，但脂肪酶的固定化效果一般，催化活性低。此外，生物炭是一种低成本、多功能的环保材料，已广泛用于环境污染物修复、退化土壤改良、以及温室气体减排等领域。然而目前有关生物炭载体用于固定化脂肪酶，尤其是结合磁性与温敏性功能材料的研究尚未见公开报道。
发明内容
因此，针对以上内容，本发明提供一种基于聚N-异丙基丙烯酰胺的磁性微/纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶的制备方法，采用该方法进行处理的脂肪酶的催化活性得到充分的提高。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种磁性微/纳米胶包被生物炭基固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：将磁性四氧化三铁纳米颗粒与油酸钠溶液复合形成纳米复合物，所得纳米复合物与温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂以及乳化剂溶液混合，通过乳液聚合反应制备磁性微/纳米胶；依据所得磁性微/纳米胶的相转变特性调节溶液温度，使微/纳米胶在生物炭表面形成包被；将所得包被型生物炭载体与游离脂肪酶溶液混合，使脂肪酶分子渗入载体表面的微/纳米凝胶网络，通过油酸-水分子间的油/水界面激活脂肪酶的催化活性位点，进一步通过戊二醛交联反应使活性脂肪酶固定化，冷冻干燥后获得固定化脂肪酶。
进一步的改进是：所述磁性微/纳米胶采用自由基热聚合反应合成，反应液的投料组分分别为：油酸/四氧化三铁复合物，功能单体N-异丙基丙烯酰胺，交联单体N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，非离子型乳化剂曲拉通x-100，以及引发剂过硫酸盐。
进一步的改进是：将生物炭浸渍于磁性微/纳米胶乳液，制备磁性微/纳米胶包被生物炭基质，所述生物炭为花生壳生物炭、菜籽壳生物炭、水稻壳生物炭以及稻草秸秆生物炭中的任意一种。
进一步的改进是：按以下方法对脂肪酶进行固定：将脂肪酶溶液与磁性微/纳米胶包被的生物炭基载体混合，加入含戊二醛浓度为0.5～5wt%的磷酸缓冲液，25～50℃下磁力搅拌20～200min，使载体上吸附的脂肪酶交联固定；反复用磷酸缓冲液洗涤去除游离脂肪酶，收集沉淀物并在-50℃下冷冻干燥，即获得磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶。
进一步的改进是：所述脂肪酶为伯克霍尔德菌脂肪酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一种。
上述制备方法的固定化脂肪酶也属于本发明的保护范围。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：本发明采用磁性微/纳米胶包被生物炭基质的内外表面，通过微/纳米凝胶网络的溶胀特性增强脂肪酶的固定效果，并通过油酸-水分子间的油/水界面激活脂肪酶分子的催化活性位点，进一步的，采用了戊二醛交联反应使活性脂肪酶定向化固定，充分提高了固定化脂肪酶的催化活性。
本发明具有以下特点：1)、以生物炭作为酶固定化基质，其生物质原料可再生、成本低廉，规模化应用过程简单、可操作性强；2)、采用磁性微/纳米凝胶包被修饰酶固定基质，可使脂肪酶分子持续渗入微/纳米凝胶网络，有利于酶固定化及其再利用过程的可逆调控；3）、磁性微/纳米胶固定化脂肪酶明显提高了酶催化活性，新型酶固定化载体具有超顺磁性，易于回收再利用、应用成本低廉。
在本实验条件下，同等量的不同脂肪酶的催化酯水解活性大小如下：磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶 > 游离脂肪酶 > 非包被生物炭基固定化脂肪酶，其中磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性比游离脂肪酶增加了147.5%，而比非包被的生物炭基固定化脂肪酶增强了34.6倍。
附图说明
图1为本发明实施例中一种磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶的表面形貌图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
本发明的实施例为：
参考图1，一种磁性纳米凝胶包被的生物炭固定化脂肪酶的制备方法，具体操作步骤如下：1）合成为磁性Fe3O4颗粒：30.32g的六水三氯化铁和15.6 g的七水硫酸亚铁溶于100ml 去离子水，在70℃下通氮气搅拌30min ，加入100ml 的25-30%的氨水，继续在70℃下通氮气搅拌2.5h ，将产物悬液超声处理后，4000rpm离心10min，所得黑色沉淀即为磁性四氧化三铁颗粒；2）制备磁性微/纳米胶：分别称取Fe3O4颗粒0.73 g、油酸钠0.96 g溶于80ml去离子水中，超声30min，70℃通惰性气体搅拌复合，另称取N-异丙基丙烯酰胺2.5g与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.075g，溶于80ml去离子水，加入1%的曲拉通X-100，通惰性气体，70℃搅拌预热20min，按10ml/30min加入40ml含0.2g过硫酸钠水溶液，继续搅拌热聚合反应6h；所得反应产物即为磁性微/纳米胶乳液；3）制备磁性微/纳米胶包被生物炭：取上述磁性微/纳米胶乳液160ml，加入4.2克生物炭，25℃-80℃反复搅拌混匀，过滤收集沉淀，所得沉淀物在60℃真空干燥，即得磁性微/纳米胶包被生物炭基载体；4）脂肪酶固定：将1克脂肪酶溶于40 ml 磷酸缓冲液，充分溶解后，离心去除杂质，分取35ml酶上清液，与1克磁性微/纳米胶包被生物炭基载体混合，25℃下搅拌混匀、振荡培养，使微/纳米凝胶网络充分溶胀，加入5 ml戊二醛（终浓度为1%）的磷酸缓冲液，35℃下磁力搅拌80min，使载体上已活化的脂肪酶分子之间相互交联固定；反复用磷酸缓冲液洗涤，收集沉淀物，冷冻干燥，即获得磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶。
对比例子：
用非包被的生物炭作为载体，直接吸附、交联固定脂肪酶，以与磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶比较。非包被的生物炭基固定化脂肪酶的制备方法同上。以游离的脂肪酶为对照，进一步比较非包被的生物炭基固定化脂肪酶与磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解反应活性。
测定脂肪酶水解活性的操作步骤如下：
配置棕榈酸对硝基苯酯的2-异丙醇溶液（16.5mmol/L），取1ml所配置底物溶液于圆底烧瓶，与9ml的磷酸缓冲液、0.2ml的曲拉通x-100和10mg阿拉伯胶混匀，50℃下恒温预培养30min，投入25mg不同类型脂肪酶，继续振荡培养（200rpm），在选定时间分取一定量反应液，用预冷的去离子水稀释，冷冻离心后，取上清液在410nm处比色分析，通过标准曲线算得样品中对硝基苯酚的浓度。脂肪酶催化水解活性单位定义为在上述条件下单位时间内催化释放1微摩尔对硝基苯酚的酶量。实验结果表明，磁性微/纳米胶包被的生物炭基固定化脂肪酶的催化酯活性明显高于游离的脂肪酶和非包被的生物炭基固定化脂肪酶。在本实验条件下，同等量的磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性比游离脂肪酶增加了147.5%，而比非包被的生物炭基固定化脂肪酶增强了34.6倍。
以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。
Claims (5)
1.一种磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，将磁性四氧化三铁纳米颗粒与油酸钠溶液复合形成纳米复合物，所得纳米复合物与温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂以及乳化剂溶液混合，通过乳液聚合反应制备磁性微/纳米胶；依据所得磁性微/纳米胶的相转变特性调节溶液温度，使微/纳米胶在生物炭表面形成包被；将所得包被型生物炭载体与游离脂肪酶溶液混合，使脂肪酶分子渗入载体表面的微/纳米凝胶网络，通过油酸-水分子间的油/水界面激活脂肪酶的催化活性位点，进一步通过戊二醛交联反应使活性脂肪酶固定化，冷冻干燥后获得固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述磁性微/纳米胶采用自由基热聚合反应合成，反应液的投料组分分别为：油酸/四氧化三铁复合物，温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺，交联单体N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，以及非离子型乳化剂与引发剂。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，将生物炭浸渍在磁性微/纳米胶乳液中，制备成包被型生物炭基质，所述生物炭为花生壳生物炭、菜籽壳生物炭、水稻壳生物炭以及稻草秸秆生物炭中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，按以下方法对脂肪酶进行固定：将脂肪酶溶液与磁性微/纳米胶包被的生物炭基载体混合，加入含戊二醛浓度为0.5～5wt%的磷酸缓冲液，25～50℃下搅拌20～200min，使载体上吸附的脂肪酶交联固定；反复用磷酸缓冲液洗涤去除游离脂肪酶，收集沉淀物并在-50℃下冷冻干燥，即获得磁性微/纳米胶包被生物炭基固定化脂肪酶。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶为伯克霍尔德菌脂肪酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410411026.5A CN104195130A (zh) | 2014-08-20 | 2014-08-20 | 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410411026.5A CN104195130A (zh) | 2014-08-20 | 2014-08-20 | 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104195130A true CN104195130A (zh) | 2014-12-10 |
Family
ID=52080498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410411026.5A Pending CN104195130A (zh) | 2014-08-20 | 2014-08-20 | 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104195130A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107746841A (zh) * | 2017-09-07 | 2018-03-02 | 天津大学 | 一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法 |
| CN108285910A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-07-17 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| CN111041014A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 浙江工业大学 | 一种磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基-3-苯丙胺中的应用 |
| CN111763697A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-10-13 | 江南大学 | 一种中长碳链甘油三酯食用油及其制备方法 |
| CN112345475A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-02-09 | 昆明理工大学 | 一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法 |
| CN112845566A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-28 | 浙江工业大学 | 一种利用脂肪酶修复邻苯二甲酸酯污染土壤的方法 |
| KR20210062575A (ko) * | 2019-11-21 | 2021-05-31 | 건국대학교 산학협력단 | 리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101503683A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-12 | 华东理工大学 | 磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法和用途 |
| CN102863629A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-01-09 | 南开大学 | 一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液的制备方法 |
| CN103882004A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-06-25 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶及其制备方法 |
-
2014
- 2014-08-20 CN CN201410411026.5A patent/CN104195130A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101503683A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-12 | 华东理工大学 | 磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法和用途 |
| CN102863629A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-01-09 | 南开大学 | 一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液的制备方法 |
| CN103882004A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-06-25 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MINGLIU DU ET AL.: "Design and synthesis of lipase nanogel with interpenetrating polymer networks for enhanced catalysis：Molecular simulation and experimental validation", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| 崔彦君: "新型磁性高分子载体的制备、固定化脂肪酶及其催化酮洛芬手性拆分的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107746841A (zh) * | 2017-09-07 | 2018-03-02 | 天津大学 | 一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法 |
| CN107746841B (zh) * | 2017-09-07 | 2020-06-12 | 天津大学 | 一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法 |
| CN108285910A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-07-17 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| CN108285910B (zh) * | 2017-12-15 | 2022-02-08 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| KR20210062575A (ko) * | 2019-11-21 | 2021-05-31 | 건국대학교 산학협력단 | 리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응 |
| KR102468425B1 (ko) | 2019-11-21 | 2022-11-18 | 건국대학교 산학협력단 | 리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응 |
| CN111041014A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 浙江工业大学 | 一种磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基-3-苯丙胺中的应用 |
| CN111041014B (zh) * | 2019-12-31 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | 一种磁性固定化脂肪酶及其在拆分1-甲基-3-苯丙胺中的应用 |
| CN111763697A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-10-13 | 江南大学 | 一种中长碳链甘油三酯食用油及其制备方法 |
| CN112345475A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-02-09 | 昆明理工大学 | 一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法 |
| CN112845566A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-28 | 浙江工业大学 | 一种利用脂肪酶修复邻苯二甲酸酯污染土壤的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104195130A (zh) | 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法 | |
| Sanchez-Ramirez et al. | Cellulases immobilization on chitosan-coated magnetic nanoparticles: application for Agave Atrovirens lignocellulosic biomass hydrolysis | |
| Cao et al. | Preparation and characterization of immobilized lipase from Pseudomonas cepacia onto magnetic cellulose nanocrystals | |
| Mardani et al. | Immobilization of α-amylase on chitosan-montmorillonite nanocomposite beads | |
| Hosseini et al. | Lipase-immobilized chitosan-crosslinked magnetic nanoparticle as a biocatalyst for ring opening esterification of itaconic anhydride | |
| Thangaraj et al. | Immobilization of lipases–a review. Part II: carrier materials | |
| Liu et al. | Covalent immobilization of Kluyveromyces fragilis β-galactosidase on magnetic nanosized epoxy support for synthesis of galacto-oligosaccharide | |
| Diyanat et al. | Immobilization of Penaeus vannamei protease on ZnO nanoparticles for long-term use | |
| Qi et al. | Poly (carboxybetaine methacrylate)-functionalized magnetic composite particles: A biofriendly support for lipase immobilization | |
| Hu et al. | Immobilization of alkaline protease on amino-functionalized magnetic nanoparticles and its efficient use for preparation of oat polypeptides | |
| Zhang et al. | Poly (carboxybetaine methacrylate)-grafted silica nanoparticle: A novel carrier for enzyme immobilization | |
| Liu et al. | Self-repairing metal–organic hybrid complexes for reinforcing immobilized chloroperoxidase reusability | |
| Seenuvasan et al. | Magnetic nanoparticles: a versatile carrier for enzymes in bio‐processing sectors | |
| Noreen et al. | Performance improvement of Ca-alginate bead cross-linked laccase from Trametes versicolor IBL-04 | |
| Sneha et al. | Enzyme immobilization methods and applications in the food industry | |
| CN104099317A (zh) | 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法 | |
| Torabizadeh et al. | Inulin hydrolysis by inulinase immobilized covalently on magnetic nanoparticles prepared with wheat gluten hydrolysates | |
| Nicolás et al. | Development of a magnetic biocatalyst useful for the synthesis of ethyloleate | |
| Liu et al. | Preparation of superparamagnetic sodium alginate nanoparticles for covalent immobilization of Candida rugosa lipase | |
| Jiang et al. | Preparation and characterization of porous horseradish peroxidase microspheres for the removal of phenolic compound and dye | |
| Mazumder et al. | Reusable magnetic nanobiocatalyst for synthesis of silver and gold nanoparticles | |
| Qiao et al. | Bacterial laccase immobilized on a magnetic dialdehyde cellulose without cross-linking agents for decolorization | |
| Coşkun et al. | Immobilization of Candida antarctica lipase on nanomaterials and investigation of the enzyme activity and enantioselectivity | |
| Xiao et al. | Immobilization and characterization of naringinase from Aspergillus aculeatus onto magnetic Fe3O4 nanoparticles | |
| CN103882004B (zh) | 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141210 |