KR20210062575A - 리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응 - Google Patents

리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응에 관한 것으로, 본 발명에 의해 제조된 자성 볏짚은 고정될 효소의 반응성, 안정성 및 재사용성에 유리한 구조적 형태를 가지며, 이러한 자성 볏짚에 고정화된 효소는 우수한 고정화 효율을 나타냈으며, 안정성 및 재사용성을 나타낼뿐만 아니라, 초상자성 잠재력을 가지고 있어 지방산 메틸 에스테르 생산에 반복적으로 사용될 수 있으므로, 장기간 활성을 안정적으로 유지할 수 있으며, 기질과 쉽게 분리가 가능하고, 재생이 용이한 효과가 있다.

Description

리파아제 고정화용 자성 볏짚 합성 방법 및 자성 볏짚에 고정화한 리파아제를 이용한 에스테르화 반응{Synthesis method of magnetic rice straw for lipase immobilization and esterification reaction using lipase immobilized on magnetic rice straw}
본 발명은 효소 고정화를 위한 자성 볏짚 및 이의 원스텝 열수 합성 방법에 관한 것으로, 원스텝 열수 합성 방법을 이용한 자성 볏짚 제조 방법, 이러한 방법에 따라 제조된 자성 볏짚에 리파아제를 고정화 하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 리파아제를 이용하여 지방산 메틸 에스테르를 생산하는 방법에 관한 것이다.
바이오매스로부터 처리된 셀룰로오스를 포도당으로 전환하기 위해서 지금까지 효소를 많이 이용하지만 효소의 가격 하락에도 불구하고 국내 공정에 적용하기에는 높은 가격, 낮은 처리 속도 등의 단점을 가지고 있어 연속식 공정을 위한 새로운 인공 가수분해 효소 개발이 필요한 실정이다. 바이오연료 생산 촉매인 가수분해 효소제와 에탄올화를 위한 발효촉매의 개발이 주로 대사경로의 재설계를 중심으로 이루어진다면, 또 다른 방향의 연구개발은 투입되는 바이오매스의 최적화 형질전환 혹은 새로운 최적 바이오매스의 발굴이고, 마지막 방법이 효소고정화 기술이라고 할 수 있다. 효소고정화의 기본개념은 효소를 이용한 생물화학공정의 효소의 활용기술에 관한 분야로서 효소의 생물학적 활성을 개량하는 기술 분야와 그 활성을 안정화시키고 경제적으로 활용하는 기술 분야로 구분할 수 있는데 전자는 유전공학적인 방향으로 연구가 진행되는데 비하여 후자는 고정화법을 중심으로 발전되어 왔다. 효소를 고정화시키는 중요한 목적은 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 즉, 효소는 그 본질상 수용성이기 때문에 반복 사용이 곤란한 문제점이 있는데, 효소의 수용성을 제거할 수 있다면 부산물과의 혼합, 분리정제의 어려움, 약한 안정성과 같은 문제를 쉽게 해결할 수 있기 때문이다. 이러한 이유로 어떤 단백질 원료를 쓰는가에 따라 친수성, 소수성이 나타날 수 있고, 이러한 특성으로 인해 효소 작용의 효율이 변화하게 된다. 또한 대개의 효소 고정기술이나 인트랩먼트 기술의 경우 효소 구조의 변형을 가져와서 궁극적으로 수율에 영향을 미치게 된다. 따라서 자연 효소를 생물화학 공정에서 효과적으로 이용하기 위해서는 효소를 고정화 시켜야 하는데, 일반적인 효소의 고정화 방법은 물리적 흡착방법 또는 화학적 방법이다.
상기 물리적 흡착방법은 주로 이온 교환(ionexchange) 방법을 이용하는데, 상기 이온 교환 방법은 비독성이라는 장점이 있으나 그 결합력이 약하다는 문제점이 있다. 또한, 상기 화학적 방법은 화학 반응에 의해 공유결합을 형성시켜 효소를 고정시키기 위하여 시약을 사용하는 것으로, 상기 방법은 가교 결합력이 강하기는 하지만 상기 효소의 고정화를 위해 사용하는 시약이 독성이 있기 때문에 식품 또는 의약 관련 산업에는 사용하기가 힘들다는 단점이 있다. 이와 같이 산업적으로 이용되는 효소들 중 리파아제는 에스테르화, 가수분해 및 중합반응 등을 포함하는 다양한 반응을 촉매하는 산업적으로 중요한 효소이며, 식품, 바이오디젤, 세제, 의약품, 피혁, 섬유 및 화장품과 같은 다양한 제품의 산업적 제조에서 사용되어 왔다 (Houde A, Kademi A, Leblanc D (2004). Appl Biochem Biotechnol 118:155-170.). 그러나, 이의 높은 가격, 일부 환경 조건에서의 낮은 안정성 및 비-재사용성 때문에, 리파아제의 산업에서의 대규모 적용이 어려운 실정이다.
볏짚(rice straw; RS)은 전 세계적으로 가장 큰 잉여 가용성을 가진 공급 원료이다. 벼는 100 개국에서 자라며 매년 수백만 톤의 볏짚이 생산된다. 생산된 볏짚의 50 % 이상이 소의 사료 또는 목재 산업에 사용된다. 나머지 볏짚은 부적절하게 처리되고 있으며, 이는 연소되어 일산화탄소, 휘발성 유기 화합물 및 부유 입자 물질과 함께 아산화 질소와 같은 위험한 가스를 생성한다. 환경에 주는 심각한 피해를 감소시키기 위하여 생산된 볏짚을 효율적으로 관리하여 부가가치 제품을 생성해야 하는 필요성이 대두되고 있다.
기존에 에탄올 생산시 전체 세포 고정화를 위해 볏짚이 사용된 바 있다. 볏짚은 발효 가능한 당으로 쉽게 전환될 수 있는 높은 수준의 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 물질을 포함하고 있기 때문에 바이오 에탄올 생산을 위한 리그노셀룰로스 바이오매스로 사용되는 여러 보고가 있다. 볏짚은 바이오 에탄올 생산에 광범위하게 활용되었지만, 효소 고정화를 위한 리그노셀룰로스 바이오매스 사용 및 바이오 디젤 생산에 대한 연구는 거의 또는 전혀 수행된 바 없다.
리파아제는 에스테르화, 에스테르 교환, 아미노 분해 및 알코올 분해 반응을 촉매하는 가장 많이 연구되고 산업적으로 활용되는 효소로서, 대부분의 리파아제 기질은 수성 매체에 불용성이다. 따라서 이러한 효소는 반응을 수행하기 위해 유기 용매가 필요하며 소수성 환경에서 더 효율적으로 작동할 수 있다. 유리 및 고정된 형태의 리파아제는 광범위한 선택성과 특이성뿐만 아니라 화학 선택성, 위치 선택성 및 거울상 선택성 때문에 제약, 세제, 약물 및 바이오 디젤 산업에서 널리 사용된다. 최근 연구에서는 알킬 레불리네이트 및 글리세롤 탄산염과 같은 다양한 산업적으로 중요한 화합물의 합성이 보고되었다(Du et al., 2018; Zhou et al., 2018). 고정화 리파아제는 식품 샘플, 주스 음료 및 혈청에서 트리글리세리드를 쉽고 빠르게 검출할 수있는 바이오 센서를 개발하는데도 사용되었다(D. Sharma, 2011).
본 출원인들은 합성 비용을 줄이고 효과적인 지지체를 준비하기 위해 효소 고정화를 위한 자성 볏짚을 제조하는 방법을 연구하던 중, 경제적이고 강력하며 간단한 원스텝 열수 합성방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 효소 고정화를 위한 자성 볏짚(magnetic rice straw) 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법 및 자성 볏짚에 고정화된 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소를 이용하여 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 볏짚(rice straw)에 Fe2+ 이온을 첨가하고 열수처리(hydrothermal treatment)하는 단계;를 포함하는 자성 볏짚(magnetic rice straw) 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된, 효소 고정화를 위한 자성 볏짚을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 자성 볏짚을 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 기능화하는 단계; 및 상기 기능화한 자성 볏짚을 효소와 혼합하고 효소를 고정화하는 단계;를 포함하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소를 유지 및 알코올과 혼합하여 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 열수합성법을 이용하여 원-스텝(one-step)으로 자성 볏짚 제조가 가능하고, 본 발명에 의해 제조된 자성 볏짚은 고정될 효소의 반응성, 안정성 및 재사용성에 유리한 구조적 형태를 가지며, 이를 지지체로 이용하여 자성볏짚에 고정화된 효소는 우수한 고정화 효율을 나타냈으며, 안정성 및 재사용성을 나타낼뿐만 아니라, 초상자성 잠재력을 가지고 있어 지방산 메틸 에스테르 생산에 반복적으로 사용될 수 있으므로, 장기간 활성을 안정적으로 유지할 수 있으며, 기질과 쉽게 분리가 가능하고, 재생이 용이한 효과가 있다.
도 1은 MRS 생성 및 표면에 리파아제 고정화를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 RS 지지체의 자기적 특성 및 표면적을 나타낸 것으로, A) MRS의 자기 특성에 대한 VSM 분석; 및 B) MRS, HT@RS 및 RS에 대한 표면적 분석을 나타낸 도이다.
도 3은 자유 및 고정화된 리파아제의 생화학적 특성을 나타낸 것으로, 초기 리파아제 농도가 증가함에 따라 (A) RS 및 (B) MRS에 의한 리파아제 로딩(mg g-1) 및 활성 회복 (%)(mg ml-1); 유리 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제의 활성에 대한 (C) 온도 및 (D) pH의 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 MRS에 고정화된 리파아제의 안정성 및 재사용성을 나타낸 것으로, A) 4 ℃, B) 25 ℃ 및 C) 70 ℃에서 유리 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제의 상대 활성; 및 D) 표준 분석 조건 하에서 10회 반복 사이클 동안 50℃에서 p-NPP의 가수 분해에서 RS에 고정화된 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제의 재사용성을 나타낸 도이다.
도 5는 고정화된 리파아제의 에스테르화 반응 수율 및 재사용성을 나타낸 것으로, (A) FAME 수율, (B) 45 ℃에서 대두유의 메탄올 분해에 의한 FAME 생산시 MRS에 고정화된 리파아제 및 RS에 고정화된 리파아제의 반복 사용을 나타낸 도이다.
이하 본 발명에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명은 효소 고정화를 위한 자성 볏짚의 원스텝 열수 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 볏짚(rice straw)에 Fe2+ 이온을 첨가하고 열수처리(hydrothermal treatment)하는 단계;를 포함하는 자성 볏짚(magnetic rice straw) 제조방법을 제공한다.
본 발명의 자성 볏짚 제조방법에 있어서, 상기 Fe2+ 이온은 질산철(Fe(NO3)2), 황산철(FeSO4), 염화철(FeCl2), 브롬화철(FeBr2) 및 요오드화철(FeI2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액을 통해 첨가되는 것일 수 있다. 바람직하게는 질산철(Fe(NO3)2) 용액을 통해 첨가될 수 있다.
본 발명의 자성 볏짚 제조방법에 있어서, 상기 열수처리 전에, Fe2+ 이온이 첨가된 볏짚 혼합물을 초음파 처리하여 20 내지 30시간 동안 유지시키는 것일 수 있다. 상기 "유지"는 초음파 처리된 볏짚 및 Fe2+ 이온 혼합물을 그대로 방치함으로써, 상기 볏짚에 Fe2+ 이온이 충분히 스며들(soaked) 수 있도록 놔두는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 초음파 처리는 1 내지 5시간 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 3시간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 열수처리 전에, 상기 혼합물로부터 Fe2+ 이온이 스며든 볏짚을 분리 및 세척하여 느슨하게 결합된 Fe2+ 이온을 제거하는 과정을 추가로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 열수처리는 암모늄 수용액 내에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 열수처리는 바람직하게는 160 내지 200 ℃에서 3 내지 10 시간 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 170 내지 190℃에서 4 내지 6 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 열수처리하는 단계 이후, 열수처리된 볏짚을 여과하여 반응액에서 분리하고 건조시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 건조된 자성 볏짚은 100 ℃에서 가열 후 리파아제 고정에 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 볏짚에 수성 Fe(NO3)2 용액 첨가하고 초음파 처리 후 현탁액 상태의 상기 Fe(NO3)2가 첨가된 볏짚 혼합 용액을 24시간 동안 그대로 두었다. 그 다음 용액으로부터 Fe2+ 이온이 스며든(soaked) 볏짚을 여과하여 분리하고, 분리된 볏짚을 암모늄 수용액 내에서 180℃에서 5시간 동안 열수처리한 후 분리 및 세척하여 자성 볏짚을 수득하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 효소 고정화를 위한 자성 볏짚을 제공한다.
본 발명의 효소 고정화를 위한 자성 볏짚에 있어서, 상기 효소는 바람직하게는 리파아제(lipase)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 자성 볏짚은, 상기 열수처리를 통해 수산화철이 자성 나노 입자로 전환될 뿐만 아니라 바이오 매스 가수분해에 영향을 미쳐 볏짚 바이오 매스에서 헤미셀룰로오스와 일부 리그닌이 제거되면서 표면에 기공이 생성되므로, 표면을 증가시켜 효소 고정을 위한 부착 부위의 형성으로 이어짐에 따라, 효소 단백질에 대한 자성 볏짚 표면적의 접근성이 향상되는 효과가 나타나는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자성 볏짚을 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 기능화하는 단계; 및
상기 기능화한 자성 볏짚을 효소와 혼합하고 효소를 고정화하는 단계;를 포함하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 효소는 자성 볏짚을 지지체(support)로 하여, 글루타르알데히드 교차결합 (Glutaraldehyde cross-linking)을 통해 자성 볏짚에 고정화(immobilized) 되는 것일 수 있다.
본 발명의 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법에 있어서, 상기 효소는 리파아제(lipase)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법에 있어서, 상기 자성 볏짚은 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 기능적으로 활성화(functionally activated, 기능화) 될 수 있다. 상기 기능화는 자성 볏짚을 글루타르알데히드를 포함하는 완충액에 현탁 및 반응시킴으로써 수행되는 것일 수 있고, 일반적으로 글루타르알데히드 기능화를 위해 알려진 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 글루타르알데히드는 상기 완충액 부피를 기준으로 0.1-5% v/v, 바람직하게는 1% v/v 포함되는 것일 수 있고, 상기 완충액은 인산염 완충액인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 자성 볏짚의 기능화가 완료되면 원심분리에 의해 기능화된 자성 볏짚을 회수하고 인산 완충액으로 세척하여 과량의 글루타알데히드를 제거하는 과정을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법에 있어서, 상기 효소를 고정화하는 단계는 1 내지 10℃에서 1 내지 10시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 5℃에서 3 내지 6시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법에 있어서, 상기 효소를 고정화하는 단계는 pH 5.0 내지 11.0에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 7.0 내지 10.0에서 수행되는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행되는 것일 수 있으며, 상기 범위의 pH에서 고정화 효율이 다른 pH 조건보다 우수하게 나타날 수 있다. 보다 더 바람직하게는 pH 8.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
본 발명의 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법에 있어서, 상기 효소를 고정화하는 단계는 완충 용액 내에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 완충 용액은 특별히 제한되지는 않으며, 본 발명의 일실시예에서는 Tris-HCL 완충 용액을 사용하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 효소는 완충 용액 부피를 기준으로 0.5 내지 1.5 중량%(w/v) 혼합되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.8 내지 1.2 중량%(w/v) 혼합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소를 제공한다.
본 발명의 자성 볏짚에 고정화된 효소에 있어서, 상기 효소는 리파아제인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 자성 볏짚에 고정화된 효소의 최적 효소 활성 온도는 45 내지 75℃인 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮거나 높은 온도 조건에서는 자성 볏짚에 고정화된 효소의 활성이 감소될 수 있다. 보다 바람직하게는 46 내지 65℃일 수 있고, 상기 범위의 온도에서 효소 활성이 다른 온도 조건보다 우수하게 나타날 수 있으며, 48 내지 53℃인 경우가 가장 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는 p-NPP를 기질로 이용하여 자성 볏짚에 고정화된 리파아제의 상대적 효소 활성을 평가한 결과, 45 내지 75℃ 온도 범위 외의 조건에서는 효소 활성이 80% 이하로 감소된 것을 확인하였고, 46 내지 65℃에서 90% 이상의 리파아제 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 48 내지 53℃의 범위, 특히 50℃가 효소 활성이 가장 우수하게 나타날 수 있는 최적 조건임을 확인하였다(실험예 3 참조).
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 자성 볏짚에 고정화된 효소의 최적 효소 활성 pH는 7.0 내지 10.0인 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮거나 높은 pH 조건에서는 자성 볏짚에 고정화된 효소의 활성이 감소될 수 있다. 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 9.5일 수 있고, 상기 범위의 pH에서 효소 활성이 다른 pH 조건보다 우수하게 나타날 수 있으며, pH 8.3 내지 8.8인 경우가 가장 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는 p-NPP를 기질로 이용하여 자성 볏짚에 고정화된 리파아제의 상대적 효소 활성을 평가한 결과, pH 7.0 내지 10.0 범위 외의 조건에서는 효소 활성이 80% 이하로 감소된 것을 확인하였고, pH 7.5 내지 9.5에서 90% 이상의 리파아제 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, pH 8.5-9.0의 범위, 특히 pH 8.5가 효소 활성이 가장 우수하게 나타날 수 있는 최적 조건임을 확인하였다(실험예 3 참조).
본 발명의 상기 자성 볏짚에 고정화된 효소는 10회 이상 반복적으로 재사용이 가능한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 자성 볏짚에 고정화된 리파아제 효소가 다른 지지체 또는 고정화 방법으로 고정화된 리파아제 또는 고정화되지 않은 리파아제(유리 세포)보다 고정화 효율, 안정성 및/또는 재사용성이 우수함을 확인하였다(실시예 4 참조).
더 나아가, 본 발명은 상기 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소를 유지(oil) 및 알코올과 혼합하여 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 유지는 식물성 오일, 동물성 지방 또는 폐유를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 유지는 대두유, 올리브유, 야자유, 해바라기유, 어유, 폐식용유 등을 사용하는 것일 수 있고, 바람직하게는 대두유(soybean oil)를 사용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, tert-부탄올 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올인 것일 수 있고, 더 바람직하게는 메탄올인 것일 수 있다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 유지 및 알코올은 1:3 내지 1:10의 몰비로 혼합될 수 있고, 바람직하게는 1:5 내지 1:7의 몰비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 효소는 알코올 중량 대비 1 내지 20 중량% 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 지방산은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 피놀렌산(pinolenic acid), 미리스트산(myristic acid), 카프릴산(caprylic acid) 및 카프르산(capric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 지방산 알킬 에스테르는 바람직하게는 지방산 메틸 에스테르인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 에스테르화 반응은 1 내지 80℃에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 45 내지 75℃의 온도에서 진행되는 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮거나 높은 온도 조건에서 에스테르화 반응을 수행할 경우, 효소 활성이 감소하여 지방산 알킬 에스테르 수율이 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는 46 내지 65℃에서 수행되는 것일 수 있으며, 상기 범위의 온도에서 효소 활성 및 지방상 알킬 에스테르 수율이 다른 온도 조건보다 우수하게 나타날 수 있다. 보다 더 바람직하게는 48 내지 55℃에서 수행되는 것일 수 있고, 48 내지 53℃에서 수행되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 에스테르화 반응은 pH 5.0 내지 11.0에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 7.0 내지 10.0에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮거나 높은 pH 조건에서 에스테르화 반응을 수행할 경우, 효소 활성이 감소하여 지방산 알킬 에스테르 수율이 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행되는 것일 수 있으며, 상기 범위의 pH에서 효소 활성 및 지방상 알킬 에스테르 수율이 다른 pH 조건보다 우수하게 나타날 수 있다. 보다 더 바람직하게는 pH 8.5 내지 9.0에서 수행되는 것일 수 있고, pH 8.3 내지 8.8에서 수행되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 자성 볏짚에 고정화된 리파아제를 이용하여 대두유를 기질로서 첨가한 메탄올:오일(6:1) 및 물(10% w/w)의 혼합물에서 48시간 동안 에스테르화 반응을 수행한 결과, 일반 천연 볏짚에 고정화된 리파아제를 이용하는 경우보다 지방산 메틸 에스테르(FAME) 수율이 우수함을 확인하였으며, 재사용성도 현저히 우수하게 유지됨을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법에 있어서, 상기 자성 볏짚에 고정화된 효소는 지방산 알킬 에스테르 생산에 재사용이 가능한 것일 수 있고, 바람직하게는 10회 이상 반복적으로 재사용이 가능한 것일 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
준비예 1. 실험 준비
모든 화학 물질은 분석 등급(AG)이었으며 추가 정제없이 사용되었다.
써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제(lipase, 21.6mg mL-1)를 Lipozyme® TL IM 액체 제제 (Novozymes, Bagsværd, Denmark)로 구입하고, 검 아카시아(gum acacia), n-헥산(n-hexane), 2-프로판올(2-propanol), p-니트로페놀(p-nitrophenol) 및 p-니트로페놀 팔미테이트(p-nitrophenol palmitate)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. Bradford 시약 및 단백질 분석 키트는 Bio-Rad (Hercules, USA)에서 구입하였다.
실시예 1. 자성 볏짚 제조 및 효소 고정화
1-1. 자성 볏짚(MRS) 합성
천연 볏짚(rice straw; RS)(1g)을 2시간 동안 이중 증류수(DW)로 세척하였다. 상기 세척된 RS에 0.25 M 수성 Fe(NO3)2를 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 현탁액을 24시간 동안 그대로 두었다. 이어서 현탁액을 여과하여 Fe(NO3)2 용액에서 볏짚을 분리하고 DW로 2회 더 세척하여 느슨하게 결합된 Fe2+ 이온을 제거하였다. Fe2+ 이온이 스며든(soaked) 볏짚을 pH 11의 암모늄 수용액에 담근 후 100 mL-Teflon 반응기로 옮겨 180℃에서 5시간 동안 열수 처리(hydrothermal treatment)하였다. 반응 후 열수처리된 볏짚을 여과하여 반응액에서 분리하고 DW와 에탄올로 3회 세척한 다음, 건조하여 자성 볏짚(magnetic rice straw; MRS)을 수득하였다. 건조된 MRS를 100℃에서 2시간 동안 가열하고 리파아제 고정에 사용하였다. MRS 생성을 개략적으로 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 열수 전처리는 수산화철을 자성 나노 입자로 전환했을뿐만 아니라 바이오 매스 가수분해에 영향을 미쳐 RS 바이오 매스에서 헤미셀룰로오스와 일부 리그닌을 제거하였다. 압력 하에서 가열하면 효소 부착을 위한 표면적의 접근성이 향상되었다.
1-2. 볏집 고정화 효소의 제조
리파아제 효소 고정화를 위해, 100mg의 RS 및 MRS(실시예 1-1)를 최적화된 농도의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 기능화하였다. 글루타르알데히드로 기능화한 볏짚(RS) 및 자성 볏짚(MRS)을 각각 GRS 및 GMRS로 표기하였다.
RS 또는 GMRS (10mg)를 1mL의 Tris-HCL 완충 용액(50mM, pH 8.5)에서 리파아제(1mg 단백질)와 혼합하고, 4℃에서 60rpm으로 교반하면서 4시간 동안 배양하였다. 볏짚에 효소가 흡착된 후 입자를 4℃에서 15분 동안 10,000rpm으로 원심 분리하였다. 세척된 용액의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 결정하였다. 리파아제 고정화를 개략적으로 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 자성 볏짚 및 이에 고정화 된 효소의 특성 확인
2-1. 자성 볏짚의 자기적 특성 확인
실시예 1-1의 MRS의 자기적 특성은 VSM(vibrating sample magnetometry)을 사용하여 확인하였으며, 이를 도 2A에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, 변형된 RS가 초상자성 거동을 나타냄을 확인하였으며, 자기 포화 값이 27.32 emu g-1인 MRS의 자기 특성을 나타내었다. 일반적인 자기 히스테리시스 곡선은 보자력 및 잔류값이 0인 상태에서 얻어졌으며 이는 준비된 MRS의 초상자성 특성을 나타낸다. 도 2A에 삽입된 이미지는 외부 영구 자석의 유무에 따른 MRS의 사진 이미지를 보여 주며, 자석을 향한 MRS의 움직임을 통해 자기적 특성이 있음을 나타내었다. 고정화된 효소의 재사용성은 경제적인 처리를 위한 필수 요건이며 입자의 자기적 특성은 회수를 용이하게 하므로, 상기와 같은 결과를 통해 MRS에 고정화된 효소의 재사용 가능성을 확인하였다.
또한, RS에 대한 자성 나노 입자 변형의 효과를 확인하기 위하여, TriStar 3000 (Micromeritics, Norcross, USA)을 이용하여 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 분석을 통해 천연 볏짚(MRS), 열수처리된 볏짚(HT@RS) 및 자성 볏짚(MRS) 각각의 표면적과 기공 크기를 확인하였으며, 이를 하기 표 1 및 도 2B에 나타내었다. 이때, 상기 HT@RS는 Fe(NO3)2와 혼합하지 않고 열수처리만 수행한 볏짚(hydrothermal-treated rice straw)을 의미한다.
물질 BET 표면적(m2 g-1) 기공 부피(cm3 g-1) 표면 기공 직경 (nm)
MRS 103.2 0.197 21.65
HT@RS 46.72 0.171 11.03
RS 23.23 0.121 2.11
표 1 및 도 2B에 나타난 바와 같이, RS는 2.11 nm의 기공 크기 및 23.23 m2 g-1의 표면적을 나타내었고, 자성 나노 입자 변형이 없는 HT@RS는 11.03 nm의 기공 직경을 갖는 46.72 m2 g-1의 표면적을 나타냈다. MRS에서는 자기 변형을 통해 표면적은 RS의 23.23m2 g-1에서 103.2 m2 g-1로 증가하였으며, 기공 직경은 2.11 nm에서 21.65nm로 증가하였다.
고온 및 고알칼리성 조건은 RS의 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 백본을 용해시켜 표면에 기공을 생성하므로, 본 발명의 자성 나노 입자 변형은 RS 표면을 증가시킴으로써 MRS에 효소 고정을 위한 부착 부위를 형성시키는 것으로 판단된다.
2-2. 자성 볏짚에 고정화된 리파아제 효소의 생화학적 특성 확인
상기 실시예 1-2에서 볏짚(RS) 및 자성 볏집(MRS)에 고정화된 리파아제의 특성을 확인하기 위하여, RS 및 MRS에 의한 효소 로딩 용량(enzyme loading capacity) 및 고정화 효율(immobilization efficiency)을 평가하였으며, 그 결과를 도 3A 및 3B에 나타내었다.
도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 지지체와 반응시키기 위한 완충 용액 1mL와 혼합되는 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5 mg mL-1의 초기 리파아제 농도를 고려할 때 RS의 최대 효소 로딩은 각각 지지체(RS) g당 15.3, 26.2, 41.6, 49.3 및 55.1 mg (15.3, 26.2, 41.6, 49.3, and 55.1 mg g-1 of support)이었고, MRS는 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5 mg mL-1의 초기 리파아제 농도에 대하여 각각 지지체(MRS) g당 26.4, 42.2, 91.3, 105 및 110 mg (26.4, 42.2, 91.3, 105, and 110 mg g-1 of support)의 효소 로딩 용량을 나타내었다. 여기서 리그닌의 존재는 RS에 소수성을 부여하고 가용성 단백질과의 활성 상호 작용을 억제하기 때문에 천연 RS와 효소 사이의 상호 작용이 MRS와 효소 사이의 상호 작용에 비해 약하다는 것을 알 수 있다.
알칼리성 조건에서 자성 나노입자 합성에 사용되는 열수 처리는 리그닌과 RS의 일부를 용해시켜 친수성 성분(즉, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스)을 노출시켰을뿐만 아니라 MRS 표면적을 증가시키고 가용성 리파아제와의 강한 상호 작용을 허용하였다. 이 결과는 최적의 조건에서 천연 RS에 비해 MRS에서 높은 단백질 부하를 나타낸다. 두 물질 모두에서 최대 로딩은 1mg mL-1의 효소 농도에서 관찰되었으며, RS와 MRS는 각각 단백질 로딩의 약 41 %와 90 %를 나타내었다. 효소 농도가 1.5mg mL-1로 더 증가함에 따라 단백질 로딩은 RS의 경우 36 %, MRS의 경우 73 %로 감소하였다.
또한, 유리 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제의 활성에 대한 온도 및 pH의 영향을 확인하였다. 유리 리파아제 및 상기 1-2에서 제조한 자성 볏짚(MRS)에 고정화된 리파아제의 활성은 p-니트로페놀 팔미테이트(p-NPP, 10mM)를 기질로 사용하여 서로 다른 pH 값 (50mM, pH 7.0-11.0)의 완충액 및 30 내지 80℃ 범위의 온도에서 410nm에서 흡광도를 분광 광도계로 측정하여 이를 도 3C 및 3D에 나타내었다. 이때, 상기 완충액은 Phosphate-citrate 완충액 (pH 5.0 내지 8.0)와 Tris-HCl 완충액 (pH 8.5 내지 10.5)를 사용하여 최적의 pH를 결정하였다. 효소 활성은 국제 단위(IU)로 표현되며, 여기서 하나의 IU(1 unit)는 표준 분석 조건에서 분당 기질인 p-NPP가 1분 동안 1 μmol의 p-nitrophenol (pNP)을 생산하는데 관여하는 효소의 양으로 정의하였다.
도 3C에 나타낸 바와 같이, 최적 온도는 표준 조건에서 50℃였으며 MRS에 고정화된 리파아제는 동일한 최적 온도를 요구하였다. MRS에 고정화된 효소는 80 ℃에서 초기 활성의 70 % 이상을 유지하면서 유리화된 효소에 비해 더 높은 열 안정성을 나타내었다. MRS에 고정화된 리파아제의 고온 내성은 MRS의 열수 처리 후 생성된 표면 구조의 변화로 인한 것일 수 있으며, 이는 고온에서 리파아제가 비활성화되는 것을 방지한다.
도 3D에 나타낸 바와 같이, 50 ℃에서 p-NPP에 대한 MRS에 고정화된 리파아제의 최적 pH는 8.5이었다. MRS에 고정화된 리파아제(Lipase@MRS)는 RS에 고정화된 리파아제보다 더 강한 알칼리성 조건에서 더 높은 안정성을 나타냈다.
실시예 3. 자성 볏짚에 고정화된 리파아제의 안정성 및 재사용성 확인
효소 안정성은 표준 분석 조건 하에서 다양한 온도(25, 50 및 70℃)에서 유리 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제를 배양하여 조사하였다. 잔류 활성을 측정하기 위하여 샘플을 정기적으로 수집하였다. 리파아제의 저장 안정성은 15일 동안 4℃, 25℃ 및 70℃에서 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, 30일 후 MRS에 고정화된 리파아제와 유리 리파아제의 상대적 활성은 4℃에서 각각 81 %와 42 %였으며, 이는 지지체가 불활성적으로 작용하여 효소가 펼쳐지지 않도록 보호하고 활성 형태를 유지함을 나타낸다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, 25 ℃에서 유리 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제의 안정성을 15일 동안 연구한 결과, MRS에 고정화된 리파아제는 유리 리파제에 비해 훨씬 더 높은 안정성을 보였으며, 저장 15일째에 초기 활성의 85 %를 유지하였다. 오일 가수 분해는 바이오 디젤 생산 과정에서 고온에서 수행되기 때문에 고정화된 리파아제의 열적 안정성이 필수적이다.
도 4C에 나타낸 바와 같이, 70 ℃에서 MRS에 고정화된 리파아제는 210분 후에 초기 활성의 53 %를 유지한 반면, 유리 리파아제는 150분 후에 완전히 활성을 잃었다. MRS에 고정화된 리파아제의 높은 안정성은 지지체의 섬유질 특성과 견고한 결합, 침출 감소 및 열악한 환경 조건으로부터의 보호를 허용하는 지지체와 효소 간의 강력한 상호 작용 때문일 수 있다. 따라서 다양한 온도에서 수행된 안정성 연구는 다양한 산업 공정에서 MRS에 고정화된 리파아제의 잠재적인 사용을 뒷받침할 수 있다.
또한, 고정화된 생물 촉매의 가장 중요한 장점 중 하나는 재사용 가능성이며 유리 효소는 재사용할 수 없다. 고정화된 리파아제의 재사용성은 표준 조건 하에서 p-NPP 산화 분석에 의해 10회 반복 주기(cycle) 사용에 대하여 평가하였으며, 그 결과를 상기 표 1 및 도 4D에 나타내었다.
도 4D에 나타낸 바와 같이, MRS에 고정화된 리파아제는 활성의 81 %를 유지 한 반면 RS에 고정화된 리파아제는 원래 활성의 45 %를 나타내었다. MRS에 고정화된 리파아제는 RS에 고정화된 리파아제보다 훨씬 더 안정적이며 반복된 주기 동안 효율적으로 재사용할 수 있다.
상기 실험을 통해 자기 변형이 없는 리파아제와 RS의 상호 작용은 셀룰로오스 물질에 리그닌이 존재하기 때문에 매우 약하다는 것이 입증되었으며, 이는 리그닌이 RS 소수성을 증가시키기 때문에 강한 상호 작용을 방해하였다.
실시예 4. 다양한 지지체와 자성 볏짚의 리파아제 고정화 특성 비교
고정화 방법 및 다양한 지지체 사용에 따른 리파아제의 고정화에 대한 효소 로딩 및 고정화 효율을 기존의 문헌들에서 설명한 것과 비교하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
지지체 물질 효소 로딩 (mg g-1) 고정화 효율 (%) 고정화 방법 10회 후 재사용율(%) 참조문헌
키토산/폴리(비닐알코올)(PVA) 63.6 49.8 공유결합 (Covalent bonding) 46 (Huang et al., 2007)
폴리(아크릴로니트릴-코-말레산) ~20 49.7 글루타르알데히드 교차결합 (Glutaraldehyde cross-linking) 55 (Ye et al., 2006)
CNC@세균성 셀룰로오스(BC) 7.8 35 EDC-NHS 교차결합 (EDC-NHS cross-linking) - (Kim et al., 2015)
SiO2@Fe3O4 나노플라워 93 65 글루타르알데히드 교차결합 (Glutaraldehyde cross-linking) 40 (Gao et al., 2017)
키토산/나노셀룰로오스 81 76.3 Schiff의 염기 (Schiff's base) 44 (Elias et al., 2018)
볏짚(RS) 41.6 85.3 글루타르알데히드 교차결합 (Glutaraldehyde cross-linking) 45 본 발명
자성볏짚(MRS) 91.3 94.3 글루타르알데히드 교차결합 (Glutaraldehyde cross-linking) 81 본 발명
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 높은 효소 적재 능력과 고정화 효율로 리파아제 고정을 위한 지지 물질의 견고한 구조를 제공함을 알 수 있다. 또한, 재사용율 역시 다른 지지체를 이용한 경우보다 본 발명의 자성 볏짚을 이용한 경우에 현저하게 우수한 재사용성을 가짐을 확인하였다.
한편, 이전 문헌에서 아민 기능화된 다중벽 탄소 나노 튜브(CNT) 결합 리파아제는 10회 반복 사용 후 원래 활성의 55 %를 유지하였으며(Verma et al., 2013), 7회 반복 사용 후 계란 흰자에 결합된 리파아제는 45 %를 유지하였다(Karimpil et al., 2011). Fe3O4 고정화된 키토산 자성 입자 복합체에 고정된 T. lanuginosus lipase는 10회 재사용 후 초기 활성의 70 %를 나타내었다(Wang et al., 2015). 본 발명은 이전에 제시된 기술과 비교할 때 재사용성에서 더 나은 성능을 나타내었다.
실시예 5. 고정화된 리파아제의 에스테르화 반응 수율 및 재사용성
바이오 디젤은 산업 및 차량에 사용할 수 있는 화석 연료의 대체 연료로 간주되고 있다. 따라서 바이오 디젤 생산에서 볏짚에 고정화된 리파아제의 사용 가능성을 평가하기 위하여, 48시간 동안 메탄올:오일(6:1)과 물(10% w/w)의 혼합물에서 에스테르화 반응을 수행하였다.
구체적으로, 에스테르화 반응을 위해 볏짚(RS 또는 MRS)에 고정된 리파아제 100mg과 대두유 0.5g (오일의 10wt%)을 45 ℃에서 다양한 농도의 물과 메탄올 혼합물에 첨가하였다. 메탄올은 에스테르화 반응의 초기 단계(시작점), 12 시간 및 24 시간의 세번 간격으로 나누어 첨가하여 최종 농도가 150μM이 되도록 하였다. 48시간 동안 샘플(반응물)을 정기적으로 수집하고 n-헥산과 혼합하였다. 상기 샘플은 85 ℃, 2000rpm 및 -0.1MPa에서 고속 진공 농축기에서 처리하여 메탄올을 제거한 다음 물로 세척하였다. 세척된 샘플은 회전 쉐이커에서 혼합하였고, 각 샘플의 1 μL을 GC 분석에 사용하여 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)의 수율(% FAME)을 측정하였으며, 그 결과를 도 5A에 나타내었다.
MRS에 고정화된 리파아제(lipase@MRS) 및 RS에 고정화된 리파아제(lipase@RS)의 재사용성은 상기 실시예 2에서 확인된 최적화된 조건(온도 및 pH) 하에서 대두유를 사용한 에스테르화 반응에서 새로운 기질 분취량으로 10회 반복 주기로 조사하였다. 모든 데이터는 세 번의 실험을 통해 평균화하였으며, 그 결과를 도 5B에 나타내었다.
도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, RS에 고정화된 리파아제 및 MRS에 고정화된 리파아제는 10회 반복 사용 후 각각 초기 % FAME 수율의 38 % 및 80 %를 나타 내었다. 이러한 결과는 RS의 자성 나노 입자 MRS로의 변형에 의해 리파아제 부착을 위한 더 넓은 표면을 제공하여 에스테르화 반응 동안 리파아제 침출을 감소시키는 것을 나타내며, 따라서 MRS에 고정화된 리파아제는 10주기 반복 사용 후에도 에스테르화 반응에서 재사용성을 유지함을 알 수 있다. RS에 고정화된 리파아제의 반복 사용에서 낮은 수율은 리파아제와 RS 사이의 약한 상호 작용 때문이었다.
상기와 같이, 실험을 통하여 효소를 고정화한 자성 볏짚이 우수한 고정화 효율을 나타냈으며, 안정성 및 재사용성을 나타낼뿐만 아니라, 지방산 메틸 에스테르 생산에 반복적으로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 나아가 산업 규모의 바이오 디젤 생산에의 이용 가능성이 있음을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 볏짚(rice straw)에 Fe2+ 이온을 첨가하고 열수처리(hydrothermal treatment)하는 단계;를 포함하는 자성 볏짚(magnetic rice straw) 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 열수처리 전에, Fe2+ 이온이 첨가된 볏짚 혼합물을 초음파 처리하여 20 내지 30시간 동안 유지시키는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Fe2+ 이온은 질산철(Fe(NO3)2), 황산철(FeSO4), 염화철(FeCl2), 브롬화철(FeBr2) 및 요오드화철(FeI2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액을 통해 첨가되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 열수처리는 170 내지 190 ℃에서 4 내지 6 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚 제조방법.
  5. 제1항의 방법으로 제조된, 효소 고정화를 위한 자성 볏짚.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 효소는 리파아제(lipase)인 것을 특징으로 하는, 효소 고정화를 위한 자성 볏짚.
  7. 제1항의 방법으로 제조된 자성 볏짚을 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 기능화하는 단계; 및
    상기 기능화한 자성 볏짚을 효소와 혼합하고 효소를 고정화하는 단계;를 포함하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 효소는 리파아제인 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 효소를 고정화하는 단계는 3 내지 5℃에서 3 내지 6시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 효소를 고정화하는 단계는 pH 7.0 내지 10.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 효소를 고정화하는 방법.
  11. 제7항의 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 자성 볏짚에 고정화된 효소의 최적 효소 활성 온도는 45 내지 70℃인 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 고정화된 효소.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 자성 볏짚에 고정화된 효소의 최적 효소 활성 pH는 7.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 고정화된 효소.
  14. 제7항의 방법으로 제조된 자성 볏짚에 고정화된 효소를 유지 및 알코올과 혼합하여 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유지는 식물성 오일, 동물성 지방 또는 폐유를 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, tert-부탄올 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 지방산은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 피놀렌산(pinolenic acid), 미리스트산(myristic acid), 카프릴산(caprylic acid) 및 카프르산(capric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 에스테르화 반응은 40 내지 80℃의 온도에서 진행되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 고정화된 효소.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 에스테르화 반응은 pH 7.0 내지 10.0에서 진행되는 것을 특징으로 하는, 자성 볏짚에 고정화된 효소.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 자성 볏짚에 고정화된 효소는 지방산 알킬 에스테르 생산에 재사용이 가능한 것을 특징으로 하는, 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
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