CN104099317A - 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法,包括如下步骤:(1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备;(2)磁性纳米粒子表面氨基化处理;(3)氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键,普鲁兰酶被固定。与传统的固定化普鲁兰酶相比较,本发明首次采用壳聚糖水凝胶诱导法制备的载体用来固定化普鲁兰酶,较传统方法步骤简单,条件温和,为一种环境友好型的绿色方法。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域,尤其是涉及一种利用水凝胶诱导方法制备的壳聚糖磁性纳米粒子来固定普鲁兰酶的新方法。
背景技术
普鲁兰酶(Pullulanase, EC 3.2.1.41)是一种脱支酶,在以淀粉为原料的食品加工业中有着重要的用途,其能将最小单位的支链分解,最大限度的利用淀粉原料。目前在工业中主要是应用在提高高葡糖浆及超高麦芽糖浆的产量和纯度;提高啤酒糖浆的麦芽糖含量;增加马铃薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉中抗消化淀粉的含量以及生产高直连淀粉等。
与游离的酶相比,固定化酶具有很多优点,所以近几十年来关于各种固定化酶技术和载体材料的研究应运而生。与传统的材料相比,磁性纳米颗粒是一种新型的复合材料,具有超顺磁性及良好的生物相容性,使其在生物、医药和环保领域有着广泛的应用。用磁性纳米颗粒为载体固定化酶,可实现在外加磁场下快捷的与产物分离,使工业化连续化生产成为可能,且分离比较彻底,简化了后续的产物分离过程,因此磁性纳米颗粒作为载体固定化酶的研究成为生物催化领域的热点。
近年来,最普遍使用的磁性纳米粒子是磁性四氧化三铁纳米粒子。然而,由于其自身的不稳定性,它们在水溶液中容易发生聚集,导致使用价值降低。研究表明,在磁性纳米颗粒表面包裹一层生物相容性聚合物可以达到提高其稳定性,减少聚集的作用。壳聚糖是除了纤维素、淀粉外生物界广泛存在的第三大类生物相容性天然聚合物大分子,由于其无毒性,可降解性以及粘附性,引起了越来越多的关注,已应用在金属吸附、固定化酶、蛋白质吸附和药物的控制释放等行业;并且壳聚糖表面还有大量功能性基团,如氨基,羟基等,是进行酶固定化的良好载体。研究报道已有一些酶固定在壳聚糖/四氧化三铁纳米颗粒上,并取得了较为理想的效果。
目前,磁性壳聚糖/四氧化三铁纳米粒子的合成主要是采用微乳液及乳液聚合法,但这些合成方法仍然存在工艺繁琐,条件苛刻(较高温度和压力、需保护气氛、有机溶剂和有机表面活性剂等)的问题;并且这些合成方法大多是在水/油系统中进行,然而由于大多数实际生产采用的是水系统,因此这也可能会限制其在实际生产中的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本申请人提供了一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法。与传统的固定化普鲁兰酶相比较,本发明首次采用壳聚糖水凝胶诱导法制备的载体用来固定化普鲁兰酶,较传统方法步骤简单,条件温和,为一种环境友好型的绿色方法。
本发明的技术方案如下:
一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法,包括如下步骤:
(1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备;
(2)磁性纳米粒子表面氨基化处理;
(3)氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键,普鲁兰酶被固定。
具体步骤为:
(1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备方法:
将壳聚糖粉末加入到乙酸溶液中,配制成质量百分比浓度为3~5%均一的淡黄色壳聚糖溶液;将浓度为25%的戊二醛溶液缓慢加入到上述壳聚糖溶液中,继续匀速搅拌15~30min,再静置12~24h,得到壳聚糖水凝胶;将水凝胶依次浸泡在0.05~0.2mol/L Fe3+的水溶液、水、0.02~0.1mol/L Fe2+的水溶液中,循环四次;然后将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH 溶液中碱化处理12~24h,得到黑色的水凝胶,将此水凝胶采用乙酸及过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子,在外加磁场下收集磁响应物质,然后用蒸馏水漂洗至中性;所得到的磁性纳米粒子分散性良好,直径在5~12nm左右;
(2)磁性纳米粒子表面氨基化处理的方法:
称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子,于甲醇或甲苯溶液中超声分散0.5~1.5 h,然后再将溶液调为碱性,在机械搅拌下缓慢加入硅烷偶联剂,50℃下搅拌反应4~8h;反应后的产物用磁场收集,分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次,洗涤过的固体在室温下干燥,得到氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子;
(3)氨基化处理后的磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法:
将干燥的氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中,振荡3~5小时,经磁场分离,然后再分散到磷酸缓冲溶液中,于室温搅拌反应条件下缓慢加入交联剂溶液,搅拌反应1~15h,再在外加磁场下收集磁性纳米粒子,并用去离子水多次洗涤以除去残留的交联剂;处理好的载体按1:2~1:4(mg:ml)的比例加入到普鲁兰酶溶液中,于25~40℃水浴振荡器中,振荡固定12~36h;所述普鲁兰酶溶液的浓度为15~50μg/mL,pH值为3.5~5.4。
步骤(1)中所述戊二醛溶液的用量为每100ml乙酸溶液中加入0.2~1ml。步骤(2)中所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷。
步骤(2)中所述已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子与硅烷偶联剂的比例为1g:1ml~1g:8ml。步骤(2)、(3)中,使用NaOH、KOH、NaHCO3或氨水将溶液调为碱性。
步骤(3)中所述普鲁兰酶的浓度为50μg/mL。步骤(3)中所述交联剂为戊二醛、碳二亚胺或环氧氯丙烷中的至少一种;加入交联剂后溶液中戊二醛的浓度为0.5~15%,碳二亚胺的浓度为10~200mM,环氧氯丙烷的浓度为5~15%。
步骤(3)中使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时,加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠后再震荡反应1h。使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时,加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠,将酶与载体形成的亚胺还原为更为稳定的伯胺;加入的硼氢化钠或氰基硼氢化钠与普鲁兰酶液的比例为0.5:1~3:1 (mg:ml)。
本发明有益的技术效果在于:
本发明克服了以往固定化磁性材料制备繁杂、成本高、团聚严重、固定化效率不高、制备过程复杂的缺点,提供的普鲁兰酶固定化的方法保留酶活高且稳定性好。本发明中主要通过壳聚糖表面的氨基基团与溶液中的铁离子发生螯合作用,诱导四氧化三铁晶体的形成,然后将壳聚糖水凝胶进行水解,就可以得到分散性较好、纳米级别的壳聚糖包裹的四氧化三铁纳米粒子。
本发明提供的壳聚糖载体具有良好的生物相容性及分散性,该载体表面存在大量的官能团,酶分子能与载体充分的结合,制备出的固定化酶便于回收利用。这种水凝胶诱导无机合成为磁性纳米粒子的制备提供了新途径,是一种步骤简单、环境友好型的绿色方法。
由于普鲁兰酶做为一种重要的工业用酶,提高其稳定性具有较大的经济意义,因此本发明通过将普鲁兰酶固定在水凝胶诱导的壳聚糖磁性纳米粒子上,使得所得的酶具有较高的热稳定性及重复使用性,在60℃条件下水浴5h后仍保留有81%的酶活,而游离酶只有50%的酶活,增大了其使用价值。
本发明制备的固定化酶的最适pH值发生酸性偏移,由4.4偏移到3.5,比传统的固定化酶更耐受酸性环境,也就是说本发明制备的固定化酶相比于游离酶有更宽泛的pH值耐受性。在pH 2.5及3.0的环境下,游离酶几乎全部失活,而固定化酶仍然保留有12.8% 及71.1%的酶活。其活性达到游离酶活性的90%以上。
本发明制备的固定化酶回收利用步骤简单,在外加磁场下即可实现酶的回收利用;酶活回收率高,酶活回收率达到90%以上;且重复稳定性较好,重复使用8次后的酶活力保留达70%。
本方法操作简单,成本低廉,制备的固定化酶在工业连续化淀粉加工等领域具有广泛应用前景。
附图说明
图1为壳聚糖磁性纳米粒子的制备及固定化普鲁兰酶的工艺流程图。
图2 为实施例1制备的壳聚糖磁性纳米粒子在水溶液中的分散性及外加磁场下的磁响应性。
图3 为实施例3制备的固定化酶的重复使用性。
具体实施方式
下面结合附图1,对本发明进行具体描述。
实施例1:
将3g壳聚糖粉末加入到100ml 2%乙酸溶液中,搅拌至壳聚糖完全溶解;缓慢加入0.4ml 25%的戊二醛溶液,继续匀速搅拌15min,再静置24h,得到壳聚糖水凝胶;将水凝胶依次浸泡在0.15mol/L 的Fe3+水溶液、水、0.075mol/L 的Fe2+水溶液中,循环四次,此时壳聚糖氨基基团与铁及亚铁离子发生螯合;将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1.25 mol/L NaOH 溶液中碱化处理12h,得到黑色的水凝胶,将此水凝胶采用3%乙酸及5%过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子。
在外加磁场下收集磁响应物质,壳聚糖磁性粒子在10s内发生聚集,倒掉上清液,然后再用蒸馏水重复漂洗至中性;所得到的磁性纳米粒子分散性良好,直径为10nm。图2 为壳聚糖磁性纳米粒子在水溶液中的分散性及外加磁场下的磁响应性。从图中可以看出壳聚糖磁性纳米粒子在水溶液中分散性良好,并且具有很好的磁响应性,在外加磁场(磁铁)存在下,10s内发生聚集。
称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子(以下称为载体),载体与甲醇按1:60(g:ml)的比例于甲醇中超声1h,然后再按载体与氨水为1:6(g:ml)的比例加入25% 氨水溶液再超声10min,在机械搅拌下缓慢加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(1g :2ml),50℃下搅拌反应4h。反应后的产物用磁场收集,分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次,洗涤过的固体室温下干燥。
取氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在的磷酸缓冲液中(65 mM,pH 7.8),振荡3小时,经磁场分离,然后再分散到磷酸缓冲溶液中,于室温搅拌反应条件下缓慢加入终浓度为3.5%的戊二醛溶液,搅拌反应8h,收集磁性纳米粒子,并用去离子水多次洗涤以除去残留的戊二醛。将处理好的载体按1:2(mg:ml)的比例与15μg/mL的普鲁兰酶溶液(pH4.0)混合,于25℃水浴振荡器反应24h,然后加入硼氢化钠(2mg :1ml)后再震荡反应1 h。
实施例2:
将4 g壳聚糖粉末加入到100ml 2%乙酸溶液中,搅拌至壳聚糖完全溶解;缓慢加入0.6 ml戊二醛溶液,继续匀速搅拌20min,再静置12h,得到壳聚糖水凝胶;将水凝胶依次浸泡在0.2mol/L 的Fe3+水溶液、水、0.1mol/L 的Fe2+水溶液中,循环四次;然后将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1.5 mol/L NaOH 溶液中碱化处理12h,得到黑色的水凝胶,将此水凝胶采用2%乙酸及4%过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子,在外加磁场下收集磁响应物质,壳聚糖磁性粒子在10 s内发生聚集,倒掉上清液,然后再用蒸馏水重复漂洗至中性;所得到的磁性纳米粒子分散性良好,直径为8nm。
称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子(以下称为载体),载体与甲苯按1:60(g:ml)的比例超声30 min,然后再按载体与NaOH 溶液为1:3(g:ml)的比例加入1mol/l NaOH溶液再超声10min,在机械搅拌下缓慢加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷溶液(1g :4ml),50℃下搅拌反应8h。反应后的产物用磁场收集,分别用二甲亚砜、无水乙醇和去离子水洗涤数次,洗涤过的固体室温下干燥。
称取干燥的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中(65mM, pH 7.8),振荡4小时,经磁场分离,然后再分散到磷酸缓冲溶液中,于室温搅拌反应条件下缓慢加入终浓度为100 mM的碳二亚胺溶液,搅拌反应4h,收集磁性纳米粒子,并用去离子水多次洗涤以除去残留的碳二亚胺。将处理好的载体按1:3(mg:ml)的比例与30μg/mL的普鲁兰酶溶液(pH4.8)混合,于40℃水浴振荡器中反应12h,然后加入氰基硼氢化钠(1mg :1ml)后再震荡反应1 h。
实施例3:
将5 g壳聚糖粉末加入到100ml 3%乙酸溶液中,搅拌至壳聚糖完全溶解;缓慢加入0.8 ml的戊二醛溶液,继续匀速搅拌30min,再静置24h,得到壳聚糖水凝胶;将水凝胶依次浸泡在0.2mol/L 的Fe3+水溶液、水、0.1mol/L的Fe2+水溶液中,循环四次;将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1.25 mol/L NaOH 溶液中碱化处理12h,得到黑色的水凝胶,将此水凝胶采用4%乙酸及8%过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子,在外加磁场下收集磁响应物质,壳聚糖磁性粒子在10 s内发生聚集,倒掉上清液,然后再用蒸馏水重复漂洗至中性;所得到的磁性纳米粒子分散性良好,直径为12nm。
称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子(以下称为载体),载体与甲醇按1:60(g:ml)的比例于甲醇中超声1.5h,然后再按载体与NaHCO3溶液为1:6(g:ml)的比例加入1mol/l NaHCO3溶液再超声30min,在机械搅拌下缓慢加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(1g :6ml),50℃下搅拌反应8h。反应后的产物用磁场收集,分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次,室温干燥。
称取干燥的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中(65 mM, pH 7.8),振荡5小时,经磁场分离,然后再分散到磷酸缓冲溶液中,于室温搅拌反应条件下缓慢加入终浓度为5%的环氧氯丙烷溶液,搅拌反应15 h,收集磁性纳米粒子,分别用二甲亚砜、无水乙醇和去离子水洗涤数次。将处理好的载体按1:4(mg:ml)的比例与50μg/mL的普鲁兰酶溶液(pH5.4)混合,于30℃水浴振荡器中反应36h。
将固定化普鲁兰酶(2u/g~10u/g)与2%普鲁兰糖溶液按1:200(g:ml)的比例在50℃条件下反应60min后,在外加磁场下收集固定化酶,弃去普鲁兰糖溶液,然后再重新加入普鲁兰糖溶液继续反应60min,然后再弃去普鲁兰糖溶液,以上步骤重复8次,实现固定化酶的重复使用,得到图3,固定化酶的重复使用性。
结果显示,固定化酶有较好的重复使用性,在使用8次后,还保留了70%酶活力。固定化酶的酶分子构象较稳定,不易受外界条件的干扰,因此能够重复多次使用,与游离酶相比较有很好的经济效益。
Claims (10)
1.一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备;
(2)磁性纳米粒子表面氨基化处理;
(3)氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键,普鲁兰酶被固定。
2.根据权利要求1所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于具体步骤为:
(1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备方法:
将壳聚糖粉末加入到乙酸溶液中,配制成质量百分比浓度为3~5%均一的淡黄色壳聚糖溶液;将浓度为25%的戊二醛溶液缓慢加入到上述壳聚糖溶液中,继续匀速搅拌15~30min,再静置12~24h,得到壳聚糖水凝胶;将水凝胶依次浸泡在0.05~0.2mol/L Fe3+的水溶液、水、0.02~0.1mol/L Fe2+的水溶液中,循环四次;然后将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH 溶液中碱化处理12~24h,得到黑色的水凝胶,将此水凝胶采用乙酸及过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子,在外加磁场下收集磁响应物质,然后用蒸馏水漂洗至中性;所得到的磁性纳米粒子分散性良好,直径在5~12nm左右;
(2)磁性纳米粒子表面氨基化处理的方法:
称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子,于甲醇或甲苯溶液中超声分散0.5~1.5 h,然后再将溶液调为碱性,在机械搅拌下缓慢加入硅烷偶联剂,50℃下搅拌反应4~8h;反应后的产物用磁场收集,分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次,洗涤过的固体在室温下干燥,得到氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子;
(3)氨基化处理后的磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法:
将干燥的氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中,振荡3~5小时,经磁场分离,然后再分散到磷酸缓冲溶液中,于室温搅拌反应条件下缓慢加入交联剂溶液,搅拌反应1~15h,再在外加磁场下收集磁性纳米粒子,并用去离子水多次洗涤以除去残留的交联剂;处理好的载体按1:2~1:4(mg:ml)的比例加入到普鲁兰酶溶液中,于25~40℃水浴振荡器中,振荡固定12~36h;所述普鲁兰酶溶液的浓度为15~50μg/mL,pH值为3.5~5.4。
3.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(1)中所述戊二醛溶液的用量为每100ml乙酸溶液中加入0.2~1ml。
4.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(2)中所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷。
5.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(2)中所述已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子与硅烷偶联剂的比例为1g:1ml~1g:8ml。
6.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(2)、(3)中,使用NaOH、KOH、NaHCO3或氨水将溶液调为碱性。
7.根据权利要求1或2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(3)中所述普鲁兰酶的浓度为50μg/mL。
8.根据权利要求1或2所述的的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(3)中所述交联剂为戊二醛、碳二亚胺或环氧氯丙烷中的至少一种;加入交联剂后溶液中戊二醛的浓度为0.5~15%,碳二亚胺的浓度为10~200mM,环氧氯丙烷的浓度为5~15%。
9.根据权利要求1或2所述的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于步骤(3)中使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时,加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠后再震荡反应1h。
10.按照权利要求9所述的的固定普鲁兰酶的方法,其特征在于使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时,加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠,将酶与载体形成的亚胺还原为更为稳定的伯胺;加入的硼氢化钠或氰基硼氢化钠与普鲁兰酶液的比例为0.5:1~3:1 (mg:ml)。
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