CN108251478A - 一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其具体步骤为：将植物脱脂蛋白粉溶于水中，灭菌，冷却至室温，接种啤酒酵母，再加入阿拉伯糖，培养得酵母菌发酵液；向发酵液中加入壳寡糖，振荡吸附，离心，上清液浓缩，冷冻干燥即为多肽。上述壳寡糖为壳寡糖磁性粒子，其制备方法为：采用双酶解法联合过氧化氢法降解壳聚糖制备壳寡糖，向壳寡糖水溶液中加入Fe3O4磁粒子，超声处理，然后加入液体石蜡和吐温80，搅拌，再加入戊二醛交联，洗涤，干燥，即得壳寡糖磁性粒子。有益效果为：本发明抗菌肽的提取方法简单可行，分离效率高，提取效率、得率和纯度高，制得的抗菌肽的生物活性高、无苦味、颜色浅。

Description

一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法。

背景技术

自从抗生素被发现后，由于它具有良好的抑菌效果被广泛地应用于医疗、传统兽药和饲料添加剂中，但是也由于抗生素的过度使用，致病菌的耐药性和药物残留等问题越来越严重，逐渐引起了人们的重视，寻找抗生素的有效替代品，解决耐药性及药物残留问题，迫在眉睫。而抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一种原核生物及真核生物均能产生的、分布广泛且种类繁多的、具有广谱抗菌活性的多肽类物质，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物、癌细胞、病毒等均有明显的抑制作用[25-27]，被视为具有极大应用前景的抗生素替代品，成为了国内外的研究热点。抗菌肽最早是瑞典科学家Boman等在一种名叫惜古比天蚕（Hyalophora cecropia）的昆虫体内诱导并分离纯化得到的，并将其命名为天蚕素（Cecropins）。到目前为止，人们纷纷从各种原核及真核生物当中鉴定出并分离得到1700多种抗菌肽类物质。

抗菌肽的种类繁多，分布也十分广泛，随着对抗菌肽的研究深入，抗菌肽的类别也越来越清晰。目前，抗菌肽一般根据以下几个方面进行分类：根据抗菌肽的合成途径将抗菌肽分为非核糖体合成抗菌肽（non-ribosomally synthesized peptides）和核糖体合成抗菌肽（ribosomally synthesized peptides）两类。根据抗菌肽的结构分为：（1）含α-螺旋的线性抗菌肽；（2）富含某些氨基酸残基的抗菌肽；（3）含1个二硫键的抗菌肽；（4）具有β-折叠结构的抗菌肽；（5）由已知多肽衍生的具有抗菌活性的肽[31]。根据抗菌肽的来源分为：（1）细菌抗菌肽，如多粘菌素、杆菌肽等；（2）昆虫抗菌肽，如天蚕素、昆虫防御素等；（3）植物源抗菌肽，如植物防御素、凤仙花素等；（4）蛙类动物抗菌肽，如蛙皮肽；（5）水生动物抗菌肽，包括鱼类、贝类、甲壳动物类抗菌肽，种类繁多复杂；（6）哺乳动物抗菌肽，主要有防御素（Defensins）、富组蛋白（Histatins）和Cathelicidins三种。由于天然抗菌肽的表达量低、提取过程复杂，导致难以大量获得，而化学合成的成本又高、价格昂贵，且对多数微生物宿主存在一定的毒性，这也导致抗菌肽的规模化的生产应用一直受到制约。所以，选用合适宿主，利用 基因工程手段进行抗菌肽的异源表达的研究一直备受关注。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻译及后修饰功能完善以及便于培养等特点，使得其表达体系成为抗菌肽代谢工程研究中应用最为广泛和重要的表达体系之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，分离效率高，提取效率、得率和纯度高，制得的抗菌肽的生物活性高、无苦味、颜色浅的从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

本发明所用微生物及其购买企业为：徐州赛傅生物科技有限公司。

一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，包括发酵、抗菌肽分离，其具体步骤为：

发酵：按料液比为1:15-25（g/mL）将植物脱脂蛋白粉溶于水中，在115-125℃下灭菌20-30min，冷却至室温，然后按接种量为8-12%接种啤酒酵母，再加入啤酒酵母重量0.02-0.5%的阿拉伯糖，然后在25-35℃的条件下培养30-40h得酵母菌发酵液，备用，该步骤利用啤酒酵母产生的具有生理活性的蛋白酶水解蛋白质制备多肽，制备的多肽得率高、性能好，同时发酵过程能够脱去苦的多肽，制备的多肽不需要进行脱苦处理，从而极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中还会有芳香味物质的产生，能够改善多肽的风味和口感；

抗菌肽分离：按添加量为0.1-0.2mg/mL向发酵液中加入壳寡糖，在30-40℃的条件下振荡吸附25-35min，然后置于转速为4000-6000r/min的离心机中离心8-15min，取上清液浓缩8-15倍，冷冻干燥即为多肽，由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的多肽和游离的氨基酸，该步骤对肽的吸附主要发生在微球的外表面，没有内扩散现象，因此反应速率常数大，吸附平衡时间短，提高多肽的分离效率，得到的抗菌肽抗菌效果好，特别是针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌抑菌效果显著，且颜色浅、安全无毒，可直接作为饲料添加剂使用，具备较好的应用效果。

作为优选，发酵步骤中阿拉伯糖含有0.1-1.5%的D-阿拉伯糖，该阿拉伯糖的存在为微生物的生长提供碳源，能够促进微生物的生长代谢，提高微生物产酶量加大，使所产蛋白酶活性处于较高水平，缩短多肽的提取时间、提高多肽的得率，且D-阿拉伯糖的加入能够调节内肽酶和端肽酶的比例，在提高多肽的产率的同时还能修饰氨基酸分子中疏水性基团的作用，改善多肽的风味。

作为优选，抗菌肽分离步骤中壳寡糖为壳寡糖磁性粒子，其制备方法为：

步骤1：按料液比为1:12-16（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至4.5-5.5，然后按加酶量为5-7%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.4-0.6，在温度为40-50℃的条件下酶解4-6h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥得到水溶性的壳寡糖，该步骤以壳聚糖为原料，采用双酶解法联合过氧化氢法降解壳聚糖制备壳寡糖，能切断GlcN与GlcNAC之间的糖苷键，优先降解较长分子链以及聚合度较高的部分，生产相对分子量低且分布窄的壳寡糖，该制备方法反应条件温和、易于控制、不污染环境、速度快；

步骤2：将0.4-0.6重量份壳寡糖溶于18-22重量份去离子水中，再加入0.2-0.3重量份Fe3O4磁粒子，在超声波功率为、的条件下超声处理1-2min，然后在搅拌下缓慢加入70-90重量份液体石蜡和3-5重量份吐温80，在700-1000rpm条件下搅拌20-40min，再加入4-6重量份戊二醛，继续搅拌2-3h，再置于50-70℃下保温1.5-2.5h，产物用石油醚、丙酮、去离子水反复洗涤，最后在35-45℃真空干燥，即得壳寡糖磁性粒子，壳寡糖结构中C2上有一个-NH2，在C3位上有一个-OH，都是平伏键，有利于与金属离子形成配位化合物，该步骤制备成磁性颗粒，使它具有磁响应性，能在外磁场作用下从溶液中快速分离，可反复利用。

进一步优选，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50-70min，过氧化氢溶液的浓度为8-12%，H2O2和酶液的体积比为1:6-10。过氧化氢的辅助降解的效果好，而过早加入高浓度H2O2溶液会影响酶的活力，阻碍还原糖的释放，而该条件可使酶解效果和降解效果达到最佳，同时弱酸溶液中壳聚糖恰好溶解，又不易形成铵盐，氧化位点多，降解速度快，使得产物分子量低，且过氧化氢降解法成本低，操作简单，同时对产物的后续处理影响小。

为了优化技术方法，采取的措施还包括：过氧化氢溶液中含有0.2-0.3mM的儿茶酚和0.01-0.1mM鞣花酸，儿茶酚和鞣花酸能够通过化学修饰丰富壳寡糖的功能基团，改善其物化性质，提高其与Fe3O4磁粒子的结合性能，使得壳寡糖成功修饰在Fe3O4磁粒子表面，同时能保护壳聚糖中氨基、羟基等活性基团氨基的稳定性，避免粒子之间发生团聚现象，提高壳寡糖包裹Fe3O4磁粒子的密封性，最终提高壳寡糖磁性粒子的吸附性能，提高多肽的分离效率，且能避免单糖的产生，提高壳寡糖的得率，降低提取成本。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明抗菌肽的提取方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的抗菌肽的生物活性高、无苦味，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明利用微生物产生的蛋白酶水解蛋白质制备活性肽，活性肽得率高、性能好，不需要进行脱苦处理，极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中有芳香味物质的产生，改善活性肽的风味和口感；3）本发明提取方法采用的分离方法使得多肽的分离效率高，得到的抗菌肽抗菌效果好，特别是针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌抑菌效果显著，且颜色浅、安全无毒，可直接作为饲料添加剂使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，包括发酵、抗菌肽分离，其具体步骤为：

1）发酵：按料液比为1:25（g/mL）将植物脱脂蛋白粉溶于水中，在115℃下灭菌30min，冷却至室温，然后按接种量为8%接种啤酒酵母，再加入啤酒酵母重量0.5%的阿拉伯糖，然后在25℃的条件下培养40h得酵母菌发酵液，备用，该步骤利用啤酒酵母产生的具有生理活性的蛋白酶水解蛋白质制备多肽，制备的多肽得率高、性能好，同时发酵过程能够脱去苦的多肽，制备的多肽不需要进行脱苦处理，从而极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中还会有芳香味物质的产生，能够改善多肽的风味和口感；

2）抗菌肽分离：按添加量为0.1mg/mL向发酵液中加入壳寡糖，在40℃的条件下振荡吸附25min，然后置于转速为6000r/min的离心机中离心8min，取上清液浓缩15倍，冷冻干燥即为多肽，由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的多肽和游离的氨基酸，该步骤对肽的吸附主要发生在微球的外表面，没有内扩散现象，因此反应速率常数大，吸附平衡时间短，提高多肽的分离效率，得到的抗菌肽抗菌效果好，特别是针对大肠杆菌等革兰氏阴 性菌抑菌效果显著，且颜色浅、安全无毒，可直接作为饲料添加剂使用，具备较好的应用效果。

上述发酵步骤中阿拉伯糖含有0.1%的D-阿拉伯糖，该阿拉伯糖的存在为微生物的生长提供碳源，能够促进微生物的生长代谢，提高微生物产酶量加大，使所产蛋白酶活性处于较高水平，缩短多肽的提取时间、提高多肽的得率，且D-阿拉伯糖的加入能够调节内肽酶和端肽酶的比例，在提高多肽的产率的同时还能修饰氨基酸分子中疏水性基团的作用，改善多肽的风味。

上述抗菌肽分离步骤中壳寡糖为壳寡糖磁性粒子，其制备方法为：

步骤1：按料液比为1:16（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至4.5，然后按加酶量为7%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.4，在温度为50℃的条件下酶解4h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥得到水溶性的壳寡糖，该步骤以壳聚糖为原料，采用双酶解法联合过氧化氢法降解壳聚糖制备壳寡糖，能切断GlcN与GlcNAC之间的糖苷键，优先降解较长分子链以及聚合度较高的部分，生产相对分子量低且分布窄的壳寡糖，该制备方法反应条件温和、易于控制、不污染环境、速度快；

步骤2：将0.6重量份壳寡糖溶于18重量份去离子水中，再加入0.3重量份Fe3O4磁粒子，在超声波功率为、的条件下超声处理1min，然后在搅拌下缓慢加入90重量份液体石蜡和3重量份吐温80，在1000rpm条件下搅拌20min，再加入6重量份戊二醛，继续搅拌2h，再置于70℃下保温1.5h，产物用石油醚、丙酮、去离子水反复洗涤，最后在45℃真空干燥，即得壳寡糖磁性粒子，壳寡糖结构中C2上有一个-NH2，在C3位上有一个-OH，都是平伏键，有利于与金属离子形成配位化合物，该步骤制备成磁性颗粒，使它具有磁响应性，能在外磁场作用下从溶液中快速分离，可反复利用。

上述过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50min，过氧化氢溶液的浓度为12%，H2O2和酶液的体积比为1:6。过氧化氢的辅助降解的效果好，而过早加入高浓度H2O2溶液会影响酶的活力，阻碍还原糖的释放，而该条件可使酶解效果和降解效果达到最佳，同时弱酸溶液中壳聚糖恰好溶解，又不易形成铵盐，氧化位点多，降解速度快，使得产物分子量低，且过氧化氢降解法成本低，操作简单，同时对产物的后续处理影响小。

上述过氧化氢溶液中含有0.3mM的儿茶酚和0.01mM鞣花酸，儿茶酚和鞣花酸能够通过化学修饰丰富壳寡糖的功能基团，改善其物化性质，提高其与Fe3O4磁粒子的结合性能，使得壳寡糖成功修饰在Fe3O4磁粒子表面，同时能保护壳聚糖中氨基、羟基等活性基团氨基的稳定性，避免粒子之间发生团聚现象，提高壳寡糖包裹Fe3O4磁粒子的密封性，最终提高壳寡糖磁性粒子的吸附性能，提高多肽的分离效率，且能避免单糖的产生，提高壳寡糖的得率，降低提取成本。

实施例2：

一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，包括发酵、抗菌肽分离，其具体步骤为：

1）发酵：按料液比为1:15（g/mL）将植物脱脂蛋白粉溶于水中，在125℃下灭菌20min，冷却至室温，然后按接种量为12%接种啤酒酵母，再加入啤酒酵母重量0.02%的阿拉伯糖，然后在35℃的条件下培养30h得酵母菌发酵液，备用；

2）抗菌肽分离：按添加量为0.2mg/mL向发酵液中加入壳寡糖，在30℃的条件下振荡吸附35min，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心15min，取上清液浓缩8倍，冷冻干燥即为多肽。

上述发酵步骤中阿拉伯糖含有1.5%的D-阿拉伯糖。

上述抗菌肽分离步骤中壳寡糖为壳寡糖磁性粒子，其制备方法为：

步骤1：按料液比为1:12（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至5.5，然后按加酶量为5%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.6，在温度为40℃的条件下酶解6h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥得到水溶性的壳寡糖；

步骤2：将0.4重量份壳寡糖溶于22重量份去离子水中，再加入0.2重量份Fe3O4磁粒子，在超声波功率为、的条件下超声处理2min，然后在搅拌下缓慢加入70重量份液体石蜡和5重量份吐温80，在700rpm条件下搅拌40min，再加入4重量份戊二醛，继续搅拌3h，再置于50℃下保温2.5h，产物用石油醚、丙酮、去离子水反复洗涤，最后在35℃真空干燥，即得壳寡糖磁性粒子。上述过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前70min，过氧化氢溶液的浓度为8%，H2O2和酶液的体积比为1:10。上述过氧化氢溶液中含有0.2mM的儿茶酚和0.1mM鞣花酸。

实施例3：

一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，包括发酵、抗菌肽分离，其具体步骤为：

1）发酵：按料液比为1:20（g/mL）将植物脱脂蛋白粉溶于水中，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后按接种量为10%接种啤酒酵母，再加入啤酒酵母重量0.2%的阿拉伯糖，然后在30℃的条件下培养35h得酵母菌发酵液，备用；

2）抗菌肽分离：按添加量为0.15mg/mL向发酵液中加入壳寡糖，在35℃的条件下振荡吸附30min，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心12min，取上清液浓缩10倍，冷冻干燥即为多肽。

上述发酵步骤中阿拉伯糖含有1.0%的D-阿拉伯糖。

上述抗菌肽分离步骤中壳寡糖为壳寡糖磁性粒子，其制备方法为：

步骤1：按料液比为1:14（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至5.0，然后按加酶量为6%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.5，在温度为45℃的条件下酶解5h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥得到水溶性的壳寡糖；

步骤2：将0.5重量份壳寡糖溶于20重量份去离子水中，再加入0.25重量份Fe3O4磁粒子，在超声波功率为、的条件下超声处理1min，然后在搅拌下缓慢加入80重量份液体石蜡和4重量份吐温80，在800rpm条件下搅拌30min，再加入5重量份戊二醛，继续搅拌2.5h，再置于60℃下保温2.0h，产物用石油醚、丙酮、去离子水反复洗涤，最后在40℃真空干燥，即得壳寡糖磁性粒子。上述过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50-70min，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前60min，过氧化氢溶液的浓度为10%，H2O2和酶液的体积比为1:8；过氧化氢溶液中含有0.25mM儿茶酚和0.05mM鞣花酸。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，包括发酵、抗菌肽分离，其特征在于：所述抗菌肽分离步骤为：向发酵液中加入壳寡糖，振荡吸附，离心，上清液浓缩，冷冻干燥即为多肽，所述壳寡糖为壳寡糖磁性粒子。

2.根据权利要求1所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述壳寡糖的添加量为0.1-0.2mg/mL，振荡吸附温度为30-40℃、时间为25-35min。

3.根据权利要求1所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述壳寡糖磁性粒子的制备方法为：

步骤1：按料液比为1:12-16（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至4.5-5.5，然后按加酶量为5-7%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.4-0.6，在温度为40-50℃的条件下酶解4-6h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥得到水溶性的壳寡糖；

步骤2：将0.4-0.6重量份壳寡糖溶于18-22重量份去离子水中，再加入0.2-0.3重量份Fe3O4磁粒子，在超声波功率为、的条件下超声处理1-2min，然后在搅拌下缓慢加入70-90重量份液体石蜡和3-5重量份吐温80，在700-1000rpm条件下搅拌20-40min，再加入4-6重量份戊二醛，继续搅拌2-3h，再置于50-70℃下保温1.5-2.5h，产物用石油醚、丙酮、去离子水反复洗涤，最后在35-45℃真空干燥，即得壳寡糖磁性粒子。

4.根据权利要求3所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50-70min，过氧化氢溶液的浓度为8-12%，H2O2和酶液的体积比为1:6-10。

5.根据权利要求4所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述过氧化氢溶液中含有0.2-0.3mM的儿茶酚和0.01-0.1mM鞣花酸。

6.根据权利要求1所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述发酵步骤为：按料液比为1:15-25（g/mL）将植物脱脂蛋白粉溶于水中，在115-125℃下灭菌20-30min，冷却至室温，然后按接种量为8-12%接种啤酒酵母，再加入啤酒酵母重量0.02-0.5%的阿拉伯糖，然后在25-35℃的条件下培养30-40h得酵母菌发酵液，备用。

7.根据权利要求6所述的一种从酵母菌发酵液中提取抗菌肽的方法，其特征在于：所述阿拉伯糖含有0.1-1.5%的D-阿拉伯糖。