CN115521958B - 一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法。涉及微生物加工技术领域。包括以下步骤：将原料和水配制悬浊液，加入普鲁兰酶酶解。本发明采用普鲁兰酶和其他酶联合进行甲壳素处理，甲壳素可直接降解为多糖，不需经过脱乙酰环节，避免了甲壳素脱乙酰环节大量酸碱的使用；基于普鲁兰酶对甲壳素的降解作用，采用多酶协同，可有效提高甲壳素的降解效率。普鲁兰酶等复合酶与微生物菌剂联合使用，可直接处理虾蟹壳，得到小分子的多糖和多肽，用作生物肥原料。
Description
技术领域
本发明涉及微生物加工技术领域，更具体的说是涉及一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法。
背景技术
甲壳素，又称甲壳质、几丁质，是自然界中唯一带正电荷的天然高分子多糖，在水、酸、碱以及一般的有机溶剂中难以溶解。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰反应后的产品，不溶于水，可溶于部分稀酸，其化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，并具有独特的理化性能和生物活化功能。
甲壳素及其降解产物壳聚糖及壳寡糖结构中带有不饱和的阳离子基团，是优良的土壤结构改良剂，具有较好的稳定性和可降解性，能改善土壤的团粒结构，调节土壤、根际和植物根组织微生物区系，促进有益微生物的生长，抑制植物病原菌，降解后还能成为优良的有机肥料。甲壳素和壳聚糖还可以通过诱导植物增强植物的抵抗力，从而抵抗外界及害虫带来的伤害，在农业上可做杀虫剂、植物抗病毒剂，广泛用于防治作物枯萎病方面，是社会各界公认的一种安全生物有机肥。
农业上应用的甲壳素，不是天然甲壳素，而是经过脱乙酰基处理后得到的壳聚糖。甲壳素脱乙酰的方法主要有化学法、酶解法和生物法。化学法是采用浓碱或浓酸脱除甲壳素的乙酰基，会产生大量的化学废水；酶解法是利用甲壳素脱乙酰酶进行处理，反应条件温和，但是甲壳素脱乙酰酶价格过高，目前还没有工业级的甲壳素脱乙酰酶；生物法是利用产甲壳素脱乙酰酶的微生物直接进行降解，条件比较温和，但是目前发现的微生物的脱乙酰度较低，达不到生产要求。
虾蟹壳是甲壳素的主要来源，目前工业仍普遍采用化学酸碱法处理虾蟹壳制备甲壳素，用酸液和碱液除去虾壳中的灰分(主要成分碳酸钙)和蛋白质，采用浓碱溶液脱除乙酰基。也有采用微生物或酶制剂脱除虾蟹壳中的蛋白质和灰分(主要是碳酸钙)，再采用甲壳素脱乙酰酶脱除乙酰基制备壳聚糖，其限制步骤仍是甲壳素的脱乙酰过程。
因此，能否提供一种利用已有商业酶进行甲壳素降解的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法。在不脱除乙酰基的条件下，采用酶解技术直接进行天然甲壳素的降解；联合微生物作用，菌酶协同处理虾蟹壳制备生物肥，整个过程没有酸碱的加入，真正实现虾蟹壳及甲壳素的绿色加工。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法，包括以下步骤：将原料和水配制悬浊液，加入普鲁兰酶酶解。
优选的：原料为甲壳素或虾/蟹壳；甲壳素或虾/蟹壳和水的质量体积比为1g：5～50ml；普鲁兰酶用量为：1000～10000U/g原料；酶解的条件：30～60℃，pH3.5～6.5，酶解的时间2～24h。
进一步的，甲壳素或虾/蟹壳和水的质量体积比为1g：20～30ml；
普鲁兰酶用量：3000～8000U/g原料；
酶解的条件：45～50℃，pH5～5.5，酶解的时间5～20h。
优选的：包括以下步骤：将原料和水配制悬浊液，加入普鲁兰酶，再加入几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶中的一种或多种酶进行酶解。
优选的：几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶用量均为：1000～10000U/g原料。
进一步的，几丁质酶：3000～5000U/g原料；溶菌酶：3500～4500U/g原料；壳聚糖酶：3000-5000U/g原料。
优选的：将虾/蟹壳原料和水配制悬浊液，调节pH，加入微生物菌剂和蛋白水解酶，培养后灭菌；加入普鲁兰酶，再加入几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶中的一种或多种酶进行酶解。
有益效果在于：普鲁兰酶与微生物菌剂(含灰分降解菌)和蛋白水解酶协同作用，在不使用酸碱的条件下，可有效去除虾蟹壳中的蛋白质、灰分，并有效降解甲壳素，得到低分子量的糖肽混合物，90％以上多糖的分子量低于1000Da，75％以上的肽聚合度在五肽以下，具有糖肽活性有机肥的产业价值。
优选的：调节pH至6.5～8.0；蛋白水解酶：中性蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木管蛋白酶中的一种或多种；培养结束，调节pH至3.5～6.5，加入普鲁兰酶酶解，酶解条件：30～60℃，酶解2～24h。
进一步的，微生物菌剂用量：10×108CFU/g；微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌，或解淀粉芽孢杆菌，或地衣芽孢杆菌，或巨大芽孢杆菌，或胶冻样类芽孢杆菌等中的一种或多种；
培养条件：30～37℃，150r/min培养20～60h。
本发明还提供了上述任一的方法在工业、农业降解甲壳素中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法，取得的技术效果：
采用普鲁兰酶进行甲壳素处理，甲壳素可直接降解为多糖，不需经过脱乙酰环节，避免了甲壳素脱乙酰环节大量酸碱的使用；
基于普鲁兰酶对甲壳素的降解作用，采用普鲁兰酶和其他酶多酶协同，可有效提高甲壳素的降解效率。
普鲁兰酶等复合酶与微生物菌剂联合使用，可直接处理虾蟹壳，得到小分子的多糖和多肽，用作生物肥原料。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法。
实施例中的原料均为市售途径获得，未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
甲壳素加水配制成1：20(g:ml)的甲壳素悬浊液，加入5000U/g普鲁兰酶，50℃，pH5.0条件下进行酶解，酶解作用5h，甲壳素降解率达到10.4％；酶解作用12h，甲壳素降解率达到12.3％；酶解作用20h，甲壳素降解率达到14.7％。
实施例2
甲壳素加水配制成1：30(g:ml)的甲壳素悬浊液，加入8000U/g普鲁兰酶，45℃，pH5.5条件下酶解作用5h，甲壳素降解率达到11.3％；酶解作用10h，甲壳素降解率达到12.7％；酶解作用20h，甲壳素降解率达到15.2％。
实施例3
甲壳素加水配制成1：20(g:ml)的甲壳素悬浊液，加入普鲁兰酶与几丁质酶各5000U/g，50℃，pH5.0条件下酶解，酶解作用6h，甲壳素降解率达到22.8％；酶解作用9h，甲壳素降解率达到32.5％；酶解作用12h，甲壳素降解率达到43.6％；酶解作用20h，甲壳素降解率达到45.4％。
实施例4
甲壳素加水配制成1：25(g:ml)的甲壳素悬浊液，加入普鲁兰酶5000U/g，溶菌酶4000U/g，45℃，pH5.5条件下酶解，酶解作用6h，甲壳素降解率达到21.38％；酶解作用9h，甲壳素降解率达到28.9％；酶解作用12h，甲壳素降解率达到39.2％；酶解作用20h，甲壳素降解率达到41.4％。
实施例5
虾壳加水配制成1：25(g:ml)的悬浊液，调节pH7.5，加入10×108CFU/g巨大芽孢杆菌(江苏绿科生物技术有限公司)和5000U/g中性蛋白酶，37℃，培养50h后灭菌。
调节pH至5.0，加入4000U/g普鲁兰酶和3000U/g壳聚糖酶，50℃，酶解8h。
检测结果：灰分去除率为50.23％，蛋白质降解率为93.57％，虾壳总降解率为57.62％，甲壳素降解率为50.15％。
降解液中92.57％多糖的分子量低于1000Da，说明大多数多糖以壳寡糖(Mr≤2000Da)的形式存在；约90％的多肽分子量在1450Da以下，75.33％的肽聚合度在五肽以下。
实施例6
虾壳加水配制成1：20(g:ml)的悬浊液，调节pH8.0，加入10×108CFU/g微生物菌剂(江苏绿科生物技术有限公司，主要成分为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或胶冻样类芽孢杆菌等)和6000U/g胰酶，37℃，培养60h后灭菌。
调节pH至5.5，加入3000U/g普鲁兰酶和3000U/g几丁质酶，55℃，酶解12h。
检测结果：灰分去除率为53.65％，蛋白质降解率为94.61％，虾壳总降解率为59.51％，甲壳素降解率为52.85％。
降解液中93.93％多糖的分子量低于1000Da，说明大多数多糖以壳寡糖(Mr≤2000Da)的形式存在；约90％的多肽分子量在1450Da以下，78.26％的肽聚合度在五肽以下。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种利用普鲁兰酶进行甲壳素降解的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原料和水配制悬浊液，加入普鲁兰酶酶解；
所述原料为甲壳素或虾/蟹壳；所述甲壳素或虾/蟹壳和水的质量体积比为1 g：5~50ml；所述普鲁兰酶用量为：1000~10000 U/g原料；所述酶解的条件：30~60℃，pH3.5~6.5，酶解的时间2~24 h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将原料和水配制悬浊液，加入普鲁兰酶，再加入几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶中的一种或多种酶进行酶解。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶用量均为：1000~10000 U/g原料。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将虾/蟹壳原料和水配制悬浊液，调节pH，加入微生物菌剂和蛋白水解酶，培养后灭菌；加入普鲁兰酶，再加入几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶、溶菌酶中的一种或多种酶进行酶解。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述调节pH至6.5~8.0；所述蛋白水解酶：中性蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木管蛋白酶中的一种或多种；所述培养结束，调节pH至3.5~6.5，加入普鲁兰酶酶解；所述酶解条件：30~60℃，酶解2~24 h。
6.权利要求1~5任一所述的方法在工业、农业降解甲壳素中的应用。
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