CN101748113B - 磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法，该方法为：一、向FeCl2和FeCl3中，加入聚乙二醇，溶解，再用氨水调节溶液至pH8～10，洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核；二、将壳聚糖粉末溶解在乙酸中超声分散，制壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声分散并搅拌，与1％～5％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌，洗涤抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球；三、将磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.0～7.8浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后的葡萄糖异构酶，振荡，取出放入冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀洗涤，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。本发明通过磁性壳聚糖复合微球固定化葡萄糖异构酶其活性回收率可达80％以上，酶的使用效率高，可重复使用，成本低。
Description
一、技术领域：
本发明涉及的是磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法。
二、背景技术：
葡萄糖异构酶(GI)主要是胞内酶，又称木糖异构酶，它能将醛糖转化为相应的酮糖，即能将葡萄糖转化为果糖，从而制备果葡糖浆。但游离酶在使用的过程中，不但使用效率低，而且不能重复利用，造成了极大的浪费。目前，也有许多种固定化葡萄糖异构酶的方法，但有些方法会出现酶与载体结合能力弱，易脱落流失等缺点。
三、发明内容：
本发明的一个目的是提供一种磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法，用于解决游离的葡萄糖异构酶使用效率低，不能重复利用，造成浪费的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法：
一、向0.4～0.6mol/L的FeCl230～100ml和FeCl350～100ml中，加入分子量为4000的聚乙二醇6.0～10.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液至pH8～10，继续搅拌30min～50min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核；
二、将壳聚糖粉末溶解在3％～6％乙酸中超声分散10min，制0.02～0.08g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声分散并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并与1％～5％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌2～4h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球；
三、将制备好的磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.0～7.8浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后的浓度为4mg/ml～16mg/ml的葡萄糖异构酶15～20ml，在室温摇床上振荡4～10h，取出放入4℃冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述磷酸缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶，无紫外吸收，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
上述方案中的乳化剂由60～100ml液体石蜡、1～5mlspan-80、1～5mlTween-60、1～5ml正丁醇组成。
有益效果：
1、本发明通过磁性壳聚糖复合微球固定化葡萄糖异构酶其活性回收率可达80％以上。与游离酶相比，磁性壳聚糖复合微球固定化酶可以较长时间内反复分批反应和装柱连续反应，从而能提高酶的使用效率，增加产物的收率，降低生产成本；在反应完成后，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，提高了产物的质量。
2、本发明磁性壳聚糖复合微球是含有磁性金属氧化物Fe3O4的超细粉末并且包裹了高分子材料壳聚糖而具有磁相应性及特殊结构的高分子微球。它由于具有磁性，可以利用磁铁可以将其从反应系统中完全分离，操作容易。另外，它还具有高分子微粒子的特性：如可通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应行功能基(如：-OH、-COOH、-CHO、-NH2)，也可通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质。壳聚糖属多糖类，是一种生物相容性好，易生物降解、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料，易于加工成粉、膜、多孔微球、纳米粒子等多种形态。壳聚糖易于进行化学改性，引入新的功能团，如可发生酰基化、羧基化、醛亚胺化(Schiff反应)、酯化、氧化、卤化、接枝共聚等反应。本发明中利用戊二醛与壳聚糖交联，由于戊二醛是具有两个功能基团的双官能团试剂，可使酶蛋白中赖氨酸的ε-氨基、N端的α-氨基、酪氨酸的酚基或半胱氨酸的-SH基与壳聚糖上氨基发生Schiff反应，引入了新的官能团，从而形成固相酶。
3、本发明中磁性壳聚糖复合微球固定化葡萄糖异构酶的粒径呈纳米级，且比表面积大，固定酶的效率高。不仅很好的保持了固定化葡萄糖异构酶的活性和稳定性，而且通过磁分离使得体系中酶的回收更加方便，提高了异构酶的使用效率。
4、本发明固定化葡萄糖异构酶具有较大的酶催化效率，可提高葡萄糖转化的速度，特别是对热、强碱，不易失活，纯化容易，可重复使用、成本低。
5、本发明壳聚糖粉末、Fe3O4磁核均经过超声分散，这样，制得的磁性壳聚糖复合微球分散性比较好，微球之间不互相粘连，解决了现有技术中制造磁性壳聚糖微球时经常产生的三四个微球相互粘连在一起的现象，而由于微球相互粘连，常常导致微球的磁响应性达不到要求，而本发明解决了微球之间相互粘连的问题，使本发明提供的微球磁响应性极强，同时相应的提高了固定化葡萄糖异构酶的活性和稳定性。
四、附图说明：
图1是实施例3用激光粒度仪分析磁性微球的粒度分布图；
图2是实施例3壳聚糖、Fe3O4粒子、磁性壳聚糖微球的红外光谱图。
五、具体实施方式：
实施例1：
一、向0.4mol/L的FeCl2100ml和FeCl3100ml中，加入分子量为4000的聚二醇10.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液pH10，继续搅拌30min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核。
二、将壳聚糖粉末溶解在3％乙酸中超声分散10min，制0.02g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并与5％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌4h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球。乳化剂由60ml液体石蜡、1mlspan-80、1mlTween-60、1ml正丁醇组成。
三、将制备好的磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.8浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后浓度为4mg/ml的葡萄糖异构酶15ml，在室温摇床上振荡10h，取出放入4℃冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述磷酸缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶，无紫外吸收，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
实施例2：
一、向0.5mol/L的FeCl230ml和FeCl350ml中，加入分子量为4000的聚乙二醇6.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液pH8，继续搅拌50min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核。
二、将壳聚糖粉末溶解在6％乙酸的超声分散10min，制成0.08g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声分散并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并与1％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌2h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球。
三、将制备好的磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.0浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后浓度为12mg/ml的葡萄糖异构酶20ml，在室温摇床上振荡4h，取出放入4℃静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述磷酸缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶，无紫外吸收，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
实施例3：
一、利用0.6mol/L的FeCl230ml和FeCl350ml，加入分子量为4000的聚乙二醇8.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液pH9，继续搅拌30min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核。
二、将壳聚糖粉末溶解在5％乙酸的超声分散10min，制成0.05g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并与2％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌2h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球。其中乳化剂由80ml液体石蜡、2.5mlspan-80、1.5mlTween-60、2ml正丁醇组成。
三、将制备好的磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.5浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后的浓度为10mg/ml的葡萄糖异构酶15ml，在室温摇床上振荡6h，取出放入4℃冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述磷酸缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶，无紫外吸收，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
本实施例中磁性壳聚糖复合微球，生物亲和性好，具有良好的磁响应性，可以作为细胞、酶或其他生物材料的良好的同定化载体。磁性微球粒子基本呈圆形，在扫描电镜下可观察到磁性微球表面有凹陷，可有效增大其比表面积，平均粒径8.34μm，当磁性微球粒径处于0.03～10μm之间时，说明磁性微球具有较好的磁响应性和良好的固定化酶效果。磁性微球粒径基本呈正态分布，出现了shiff碱键C＝N的特征吸收峰，说明戊二醛成功的和壳聚糖发生了交联反应，并且成功包覆了Fe3O4。本实施例磁性微球粒度分布和FT-IR测试磁性微球的官能团结构如附图1、2所示。
实施例4：
一、利用0.5mol/L的FeCl240ml和FeCl380ml，加入分子量为4000的聚乙二醇8.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液pH9，继续搅拌30min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核。
二、将壳聚糖粉末溶解在4％乙酸的超声分散10min，制成0.05g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并2％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌2h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球。其中乳化剂由80ml液体石蜡、2.5mlspan-80、1.5mlTween-60、2ml正丁醇组成。
三、将制备好的磁性微球先用磷酸缓冲液pH7.2浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后的浓度为12mg/ml的葡萄糖异构酶15ml，在室温摇床上振荡6h，取出放入4℃冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶(无紫外吸收)，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
本实施例中葡萄糖异构酶的固定化载体为磁性壳聚糖复合微球，通过吸附交联法将葡萄糖异构酶固定在磁性微球上，成为磁性固定化葡萄糖异构酶。本实施例固定化酶，具有较大的酶催化效率，可提高葡萄糖转化的速度，并有利于固定化酶从反应体系中分离和回收。
Claims (2)
1.一种磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法，其特征在于：这种磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法为：
一、向0.4mol/L的FeCl2100ml和FeCl3100ml中，加入分子量为4000的聚二醇10.0g，在磁力搅拌器下充分溶解，再用氨水调节溶液pH10，继续搅拌30min，用重蒸水洗涤抽滤后真空冷冻干燥即得Fe3O4磁核；
二、将壳聚糖粉末溶解在3％乙酸中超声分散10min，制0.02g/ml壳聚糖溶液，通过乳化剂与Fe3O4磁核超声并电动搅拌10min进行混合，使之形成微乳体系，并与5％戊二醛交联在2000r/min下继续搅拌4h，然后用石油醚、丙酮和重蒸水洗涤，抽滤真空冷冻干燥后即得磁性壳聚糖复合微球；
三、将制备好的磁性壳聚糖复合微球先用磷酸缓冲液pH7.8浸泡，抽滤后加入用缓冲液稀释后浓度为4mg/ml的葡萄糖异构酶15ml，在室温摇床上振荡10h，取出放入4℃冰箱中静置过夜，倾出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤再用上述磷酸缓冲液洗涤，直至洗涤液检测不到戊二醛和游离酶，无紫外吸收，抽滤得固定化葡萄糖异构酶。
2.根据权利要求1所述的磁性壳聚糖复合微球制备固定化葡萄糖异构酶的方法，其特征在于：所述的乳化剂由60ml液体石蜡、1mlspan-80、1mlTween-60、1ml正丁醇组成。
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