CN1281746C - 一种生物多糖高分子微球固定化β－半乳糖苷酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶及其制备方法，以罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶等生物多糖高分子材料制备的微球为载体通过戊二醛交联法固定化β-半乳糖苷酶。该固定化酶，活力为2.0-2.6u/g载体，活力回收率为51-62%。固定化酶稳定性提高，最适宜pH值为8.0-8.4，最适宜温度为41℃-43℃，表观米氏常数(Km)为6.05×10-4-6.75×10-4。罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶等生物多糖高分子材料作为载体固定化β-半乳糖苷酶可将乳糖水解为β-半乳糖和葡萄糖，无毒、生物相容性好、易于回收和重复使用，可应用于低乳糖乳制品的生产。
Description
技术领域 本发明涉及以生物多糖高分子微球为载体固定化的β-半乳糖苷酶的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶及其制备方法。
背景技术
酶的固定化是将酶束缚或限制在一定的空间区域内，仍能催化其特定的化学反应、并可回收及重复使用的技术。与游离酶相比，酶固定化后不但仍能保持其高效性、专一性及温和的酶催化特点外，还具有稳定性高、易于分离回收、可多次重复使用、适易连续化自动化生产、生产工艺简单等优点。目前，酶的固定化技术发展迅速，已成为生物技术领域最具发展前景的前沿技术之一，广泛应用于食品、医药、化学化工及生物工程技术等领域。
β-半乳糖苷酶能特异地水解β-1、4-半乳糖苷键，可将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。生物多糖高分子微球用于固定化β-半乳糖苷酶，具有无毒、生物相容性好、可再生等优点。其在低乳糖乳制品的生产中有着良好的应用前景。
国内外对酶的固定化进行了大量研究。美国专利4405715申请了一种固相支持物固定化纤维素酶的方法；中国专利CN1334342、中国专利CN1285403申请了壳聚糖固定化蚯蚓血纤蛋白溶酶和木瓜蛋白酶的方法；中国专利CN1275619、中国专利CN1234444、中国专利CN1093753、中国专利CN1093752等申请了卡拉胶或卡拉胶与其他多糖复配固定化细胞的方法。这些均未涉及利用这些生物多糖高分子材料固定化β-半乳糖苷酶的方法，固定化酶的材料也未涉及罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶等生物多糖高分子材料作为固定化酶的载体。
发明内容
本发明提供一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶及其制备方法，旨在以罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶等生物多糖高分子材料作为载体固定化β-半乳糖苷酶。固定化β-半乳糖苷酶可将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，且具有无毒、生物相容性好、可再生等优点。在低乳糖乳制品的生产中有着良好的应用前景。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
分别利用罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶制备的生物多糖高分子微球作为载体，戊二醛交联法固定化β-半乳糖苷酶。
本发明的步骤如下，
步骤1：在50mL水中，加入胶体物，及有机石蜡、乙酸乙酯、span-80，在500rpm/min的转速下搅拌20min，缓慢滴加甲醛3mL，搅拌1hr，倾去上清液，用石油醚、丙酮洗涤，再用无水乙醇作溶剂洗涤若干次，得胶体物微球；
步骤2：所得胶体物微球再用3.0％的对氨基苯磺酸溶液处理，真空干燥，即得表面羟基被对氨基苯磺酸磺酰化的胶体物微球；
步骤3：称取上述微球2g，加入380U/100mL的β-半乳糖苷酶液2.0mL，加入0.4％的戊二醛，在4℃、pH 7.3的条件下反应10hr，抽滤，用缓冲液或蒸馏水洗除剩余戊二醛和未交联的酶，直至检测不出蛋白质，即得胶体物微球固定化β-半乳糖苷酶。
本发明的有益效果，利用扫描电镜、红外光谱、元素分析等表征固定化β-半乳糖苷酶，并进行活力测定。扫描电镜观察表明，微球表面吸附有大量β-半乳糖苷酶。
罗望子胶微球固定化的β-半乳糖苷酶，活力为2.0U/g载体，活力回收率为53％，固定化β-半乳糖苷酶稳定性提高，重复使用9次其活力可保持53％，最适宜pH 8.3，最适宜温度42℃，表观米氏常数(Km)6.65×10-4。罗望子胶微球固定化的β-半乳糖苷酶可将牛乳中的乳糖降解为半乳糖，35℃、10h下乳糖降解率65.38％。
本发明的特点是利用罗望子胶等生物多糖高分子材料制备微球为载体，通过戊二醛交联法固定化β-半乳糖苷酶。该法固定化的β-半乳糖苷酶生物相容性好、无毒，便于回收和重复使用，具有良好的操作性能和生产性能。罗望子胶等生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶能水解乳糖为葡萄糖和β-半乳糖，可应用于低乳糖乳制品的制备。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1罗望子微球固定化β-半乳糖苷酶放大2400倍扫描电镜图；
图2罗望子微球固定化β-半乳糖苷酶放大600倍扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1：罗望子胶微球的制备及固定化β-半乳糖苷酶；
步骤1：在50mL水中，加入胶体物0.5g罗望子胶，及有机石蜡、乙酸乙酯、span-80，在500rpm/min的转速下搅拌20min，缓慢滴加甲醛3mL，搅拌1hr，倾去上清液，用石油醚、丙酮洗涤，再用无水乙醇作溶剂洗涤若干次，得胶体物罗望子胶微球；
步骤2：所得胶体物罗望子胶微球再用3.0％的对氨基苯磺酸溶液处理，真空干燥，即得表面羟基被对氨基苯磺酸磺酰化的胶体物罗望子胶微球；
步骤3：称取上述胶体物罗望子胶微球2g，加入380U/100mL的β-半乳糖苷酶液2.0mL，加入0.4％的戊二醛，在4℃、pH 7.3的条件下反应10hr，抽滤，用缓冲液或蒸馏水洗除剩余戊二醛和未交联的酶，直至检测不出蛋白质，即得胶体物罗望子胶微球固定化β-半乳糖苷酶。
由图1、2可以观察出罗望子微球是多孔性载体，有利于酶的固定化反应的进行；扫描电镜观察表明，罗望子微球吸附附有大量的β-半乳糖苷酶。利用扫描电镜、红外光谱、元素分析等表征固定化β-半乳糖苷酶，并进行活力测定。
罗望子胶微球固定化的β-半乳糖苷酶，活力为2.0U/g载体，活力回收率为53％，固定化β-半乳糖苷酶稳定性提高，重复使用9次其活力可保持53％，最适宜pH 8.3，最适宜温度42℃，表观米氏常数(Km)6.65×10-4。罗望子胶微球固定化的β-半乳糖苷酶可将牛乳中的乳糖降解为半乳糖，35℃、10h下乳糖降解率65.38％。
实施例2：沙蒿胶微球的制备及其固定化β-半乳糖苷酶；
在步骤1中用0.40g沙蒿胶代替0.5g罗望子胶，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
在步骤3中称取沙蒿胶微球2g代替上述胶体物罗望子胶微球2g，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
沙蒿胶微球固定化β-半乳糖苷酶，活力为2.5U/g载体，活力回收率为51％，固定化β-半乳糖苷酶稳定性提高，重复使用9次其活力可保持56％，最适pH 8.0，最适温度43℃，表观米氏常数(Km)6.05×10-4。
实施例3：黄原胶微球的制备及其固定化β-半乳糖苷酶；
在步骤1中用0.8g黄原胶或黄原胶代替0.5g罗望子胶，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
在步骤3中称取黄原胶微球2g代替上述胶体物罗望子胶微球2g，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
黄原胶微球固定化β-半乳糖苷酶，活力为2.2U/g载体，活力回收率为62％，固定化β-半乳糖苷酶稳定性提高，重复使用9次其活力可保持51％，最适pH 8.4，最适温度41℃，表观米氏常数(Km)6.75×10-4。
实施例4：瓜尔豆胶微球的制备及其固定化β-半乳糖苷酶；
在步骤1中用0.6g瓜尔豆胶代替0.5g罗望子胶，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
在步骤3中称取瓜尔豆胶微球2g代替上述胶体物罗望子胶微球2g，其它试剂的种类、配比以及制备方法同实施例1所述。
瓜尔豆胶微球固定化β-半乳糖苷酶，活力为2.6U/g载体，活力回收率为54％，固定化β-半乳糖苷酶稳定性提高，重复使用9次其活力可保持52％，最适pH 8.2，最适温度42℃，表观米氏常数(Km)6.25×10-4。
实施例5：生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶的应用，应用于低乳糖乳制品的制备，将牛乳中的乳糖降解为半乳糖，35℃、10h，乳糖降解率65.38％。
Claims (6)
1.一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征是：步骤如下，
步骤1：在50mL水中，加入0.5g罗望子胶、或0.4g沙蒿胶、或0.8g黄原胶、或0.6g瓜尔豆胶，及有机石蜡、乙酸乙酯、span-80，在500rpm/min的转速下搅拌20min，缓慢滴加甲醛3mL，搅拌1hr，倾去上清液，用石油醚、丙酮洗涤，再用无水乙醇作溶剂洗涤若干次，得罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球；
步骤2：所得罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球再用3.0％的对氨基苯磺酸溶液处理，真空干燥，即得表面羟基被对氨基苯磺酸磺酰化的罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球；
步骤3：称取上述步骤2的罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球2g，加入380U/100mL的β-半乳糖苷酶液2.0mL，加入0.4％的戊二醛，在4℃、pH 7.3的条件下反应10hr，抽滤，用缓冲液或蒸馏水洗除剩余戊二醛和未交联的酶，直至检测不出蛋白质，即得罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球固定化β-半乳糖苷酶。
2.如权利要求1所述的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶制备方法制备的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶，其特征在于：为罗望子胶、或沙蒿胶、或黄原胶、或瓜尔豆胶微球固定化β-半乳糖苷酶。
3.如权利要求2所述的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶，其特征在于：微球体呈表面多孔蜂窝状结构，微球形态均一，颗粒直径在2.0×102-6.3×102μm范围内。
4.如权利要求2所述的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶，其特征在于：所述的微球固定化β-半乳糖苷酶，活力为2.0-2.6U/g载体，活力回收率为51-62％，最适宜pH值为8.0-8.4，最适宜温度为41℃-43℃，表观米氏常数Km为6.05×10-4-6.75×10-4。
5.如权利要求2所述的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶的应用，其特征在于：应用于低乳糖乳制品的制备，将牛乳中的乳糖降解为半乳糖，35℃、10h，乳糖降解率65.38％。
6.如权利要求5所述的一种生物多糖高分子微球固定化β-半乳糖苷酶的应用，其特征在于：用于水解乳糖为葡萄糖和β-半乳糖。
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