CN110804603B - 一种β-半乳糖苷酶的共交联固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种β‑半乳糖苷酶的共交联固定化方法。使用油溶性的一缩二乙二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的β‑半乳糖苷酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化β‑半乳糖苷酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在56mg酶/g载体时其相对活性达到最高值，为游离酶的93％。

Description

一种β-半乳糖苷酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种β-半乳糖苷酶的共交联固定化方法，该新型固定化β-半乳糖苷酶可专门用于提高乳制品的甜度，又能降低乳糖的含量，为乳糖不耐症消费者接受牛乳这一天然、具有良好平衡性的食品便利。
背景技术
β-半乳糖苷酶是一种酸性水解酶(等电点为4.6)，分子量为540kD，为四聚体结构，广泛存在于动物、植物和微生物中。乳糖是奶类中特有的糖类。然而儿童和成年人因体内比较容易缺乏乳糖酶，饮用牛乳后常会引起对乳糖的消化吸收不良。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，会引起腹胀、腹泻等症状，称之为乳糖不耐症。乳糖不耐症就是缺乏乳糖酶或其活性不足所造成的状况。β-半乳糖苷酶具有水解活性，能够催化乳糖分子中的β-1，4半乳糖苷键水解，生成α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖，使乳糖不耐症患者可以顺利消化吸收。β-半乳糖苷酶还具有转半乳糖苷的作用，催化乳糖水解和半乳糖基的转移反应的发生，生成物为低聚半乳糖，低聚半乳糖是一种重要的低聚糖，具有降低血脂、增强矿物质吸收、防龋齿等功能，增加了产品的营养价值。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的β-半乳糖苷酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的β-半乳糖苷酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的β-半乳糖苷酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于β-半乳糖苷酶的固定，利用β-半乳糖苷酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种β--半乳糖苷酶的固定化方法，这种方法是基于β-半乳糖苷酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为β-半乳糖苷酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过β-半乳糖苷酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使β-半乳糖苷酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的β-半乳糖苷酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将β-半乳糖苷酶溶解在pH＝7.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的β-半乳糖苷酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化β-半乳糖苷酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，β-半乳糖苷酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化β-半乳糖苷酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使β-半乳糖苷酶以极高的效率被固定化。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将β-半乳糖苷酶溶解在pH＝7.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的β-半乳糖苷酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化β-半乳糖苷酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定β-半乳糖苷酶后，反应残留液中测不到β-半乳糖苷酶的活性，说明经过交联后β-半乳糖苷酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183368860000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活力的测定：绘制邻硝基苯酚标准曲线。用pH值为6.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液配制5mmol/mL邻硝基苯酚(ONP)。取7支试管分别吸取0mL、0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL、0.35mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL ONP(5mmol/mL)，将上述缓冲液补至0.5mL，然后40℃保温15min，加入2mL，1mol/L碳酸钠溶液，以第一管为空白，于400nm测定吸光度，以ONP的量为横坐标，以A400为纵坐标绘制标准曲线。
向5mL具塞试管加0.2mL浓度为5mmol/L的ONPG，和0.7mL柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0.1mL一定浓度的酶液，准确反应15min，加入2mL 1mol/L的Na2CO3溶液将β-半乳糖苷酶灭活，于420nm比色测定吸光度，然后从ONP标准曲线上查出生成的ONP的量，计算酶活力。
(2)固定化酶活力测定：向所需的一定量固定化酶中加入磷酸-柠檬酸缓冲液，保温3min，40℃，加入0.2mL 5mmol/L ONPG准确反应时间是15min。加2mL 1mol/L的Na2CO3溶液将β-半乳糖苷酶灭活，取反应液于420nm测定吸光度，根据标准曲线计算固定化酶活力。酶活力计算公式：
Figure BSA0000183368860000042
其中：X为酶活力(U)；A为酶催化反应液在420nm下吸光度；B为ONP标准曲线的斜率；C为反应时间15min。
酶活力单位的定义：1个酶活力单位是在规定条件下，每分钟能释出1μmol邻硝基苯酚的酶量。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化β-半乳糖苷酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图1是相对活性与负载量的关系，当负载量在56mg酶/g载体时，固定化酶具有较高的活力，其比活力达到游离酶的93％，这个结果说明β-半乳糖苷酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量大于56mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法引入环糊精超分子结构单元，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性，但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活力会随负载量的增加而迅速下降。
我们以负载量为56mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图2所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝6.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液残留46％的活性，固定化酶残留86％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。
附图说明
图1固定化的β-半乳糖苷酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图2固定化与游离的β-半乳糖苷酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种β-半乳糖苷酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为β-半乳糖苷酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183368850000011
所述的β-半乳糖苷酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为454的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将β-半乳糖苷酶溶解在pH＝7.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)将不同浓度的β-半乳糖苷酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的β-半乳糖苷酶固定化产物。
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