CN110760495B

CN110760495B - 一种猪胰脂肪酶的共交联固定化方法

Info

Publication number: CN110760495B
Application number: CN201910417454.1A
Authority: CN
Inventors: 吴嘉沁; 张瑞丰; 李艳; 肖通虎; 龙能兵
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110760495A

Abstract

本发明是关于一种猪胰脂肪酶的共交联固定化方法。使用油溶性的丁二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的猪胰脂肪酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化猪胰脂肪酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，在负载量为42mg酶/g载体时，其活性达到最高值。

Description

一种猪胰脂肪酶的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种猪胰脂肪酶的共交联固定化方法，该新型固定化酶可用于油脂的水解，也可以用于手性化合物的动力学拆分。

背景技术

猪胰脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油水解酶，是一种重要的酰基水解酶，能催化甘油三酯水解生成甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。它的分子量在45000～50000Da，是一种酸性蛋白质(等电点为5.0)。在结构上，猪胰脂肪酶呈椭球形，三维尺寸为4.6nm×2.6nm×1.1nm它含有大量疏水性氨基酸，可以形成疏水区，其极性指数为47。在组成上，除异亮氨酸与其他脂肪酶不同外，其他氨基酸均相同在形状上。在催化性能上，脂肪酶的一个突出特点是它能够在油/水界面实施催化作用，它不仅能在水相中催化酯的水解反应，而且还能在有机相中催化酯合成和酯交换等多种反应，并且在强烈脱水和有机体系中能保持高活性、高稳定性和高区域、立体选择性。除了能催化酯水解以外，还可催化酯化、转酯化、氨解、酰胺化等反应，广泛应用于食品、化工、医药等诸多领域。作为一种高效生物催化剂，脂肪酶能在温和的条件下起高效率的催化作用，被广泛应用于油脂水解、油脂改性、皮革加工、造纸工业、洗涤剂工业以及手性合成等领域，成为应用酶中的一枝新秀。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的猪胰脂肪酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的猪胰脂肪酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的猪胰脂肪酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于猪胰脂肪酶的固定，利用猪胰脂肪酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪胰脂肪酶的固定化方法，这种方法是基于猪胰脂肪酶与另一种含有机胺的超分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为猪胰脂肪酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过猪胰脂肪酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使猪胰脂肪酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的猪胰脂肪酶；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将猪胰脂肪酶溶解在pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的猪胰脂肪酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化猪胰脂肪酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，猪胰脂肪酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精超分子复合物改善了固定化猪胰脂肪酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使猪胰脂肪酶以极高的效率被固定化。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将猪胰脂肪酶溶解在pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的猪胰脂肪酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化猪胰脂肪酶的产物。

酶的负载量测定：

由于共交联法固定猪胰脂肪酶后，反应残留液中测不到酶的活性，说明经过交联后猪胰脂肪酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶活的测定：猪胰脂肪酶的水解活性采用聚乙烯醇乳化橄榄油法测定。一个脂肪酶活力单位定义为在实验条件下脂肪酶水解橄榄油，每分钟催化产生1μmol脂肪酸的酶量。具体步骤如下：

准确配制2％(m/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液，再与橄榄油按3∶1体积比混合，置于冰水浴中冷却至5～10℃，然后用搅拌器强烈搅拌20min即成乳白色PVA橄榄油乳化液(底物)。取2.0mL，0.1M的pH＝7.0的磷酸缓冲液和2.5mL底物置于反应瓶中，充分混合，水浴加热至37℃且恒定10min，然后加入0.5mL酶液，同时计时，温和搅拌，保温反应30min后，加入等体积的丙酮与乙醇混合液以终止反应，然后再加入5.0mL浓度为0.05M的NaOH标准溶液与2滴1％的酚酞指示剂，用浓度为0.05M的标准盐酸滴定至溶液无色即为终点。空白样的测定方法和操作步骤与上述相同，只是在反应中不加酶液。酶活力用以下公式计算：

式中：B为滴定空白样的盐酸量(mL)；H为酶促反应后的滴定盐酸量(mL)；10为10个单位释放1μmol脂肪酸；C₁为标准盐酸的浓度(mol/L)；C₂酶溶液的浓度(mg/mL)；V为所加酶溶液的体积(mL)；C₃为标准NaOH溶液的浓度(mol/L)；0.6为0.6ml 0.05M的NaOH溶液相当于1μmol脂肪酸。

(2)固定化酶活的测定：固定化酶活力测定的方法与游离酶相似，其不同之处在于用固定化酶颗粒代替游离酶溶液，所以酶活力的计算公式为：

式中：B为滴定空白样的盐酸量(mL)；H为酶促反应后的滴定盐酸量(mL)；10为10个单位释放1μmol脂肪酸；C₁为标准盐酸的浓度(mol/L)；m为固定化酶中猪胰脂肪酶的质量(g)；V为所加酶溶液的体积(mL)；C₃为标准NaOH溶液的浓度(mol/L)；0.6为0.6mL 0.05M的NaOH溶液相当于1μmol脂肪酸。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化猪胰脂肪酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图1是相对活性与负载量的关系，当负载量为42mg酶/g载体的时候其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的92％，这个结果说明猪胰脂肪酶处于非常适合催化的状态。当负载量大于42mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，但本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又下降。

我们以负载量为42mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图2所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.0的条件下，经过28天的储存，游离酶溶液只残留36％的活性，而固定化酶能残留78％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1固定化猪胰脂肪酶的催化活性与其负载量的依赖关系。

图2固定化与游离猪胰脂肪酶的储存稳定性比较。

Claims

1.一种猪胰脂肪酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为猪胰脂肪酶及结构如下的分子复合物：

所述的猪胰脂肪酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：

1)将数均分子量为454的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

4)将不同浓度的猪胰脂肪酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合；

5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的猪胰脂肪酶固定化产物。