CN110804605B - 一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法 - Google Patents

一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法。使用油溶性的一缩二乙二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的碱性蛋白酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化碱性蛋白酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在58～79mg酶/g载体范围时其相对活性达到游离酶的90％以上。

Description

一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法，该新型固定化碱性蛋白酶可专门用于水解蛋白质，使之转化为多肽。
背景技术
碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类(等电点为8.0～9.0)，是一种蛋白水解酶，属于内切型丝氨酸蛋白酶。微生物碱性蛋白酶的作用pH值一般在7～11范围内有活性。在以酪蛋白为底物时的最适pH多在9.5～10.5范围内，蛋白酶除可以催化水解肽键外，还具有催化水解酯键、酰胺键以及酯交换及肽转换的能力。碱性蛋白酶的分子量在20000～34000Da之间。大多数微生物碱性蛋白酶作用于肽链。除酶本身的氨基酸残基外，不具有特定的活性基团，酶发挥作用时不需要特定的激活剂，而需要金属离子激活，除去金属离子就不能作用，必需的金属离子有Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等。目前，世界上使用最多的蛋白酶为碱性分解酶，达到了总量的60％，其中有一半为碱性蛋白酶，它在工业生产中具有非常重要的地位。碱性蛋白酶广泛用于食物添加剂、皮革和纺织品加工、药品生产及诊断和废弃物管理等行业中。其中包括大豆蛋白，面包发酵，肉浸膏的制造，鱼下脚料浸膏的制造，植物蛋白加工，肉鱼贝类软化，皮革酶解处理，丝绸精炼，去污剂、化妆品中添加，酿造尤其是味增、酱油的制造等领域。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的碱性蛋白酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的碱性蛋白酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的碱性蛋白酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于碱性蛋白酶的固定，利用碱性蛋白酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种碱性蛋白酶的固定化方法，这种方法是基于碱性蛋白酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为碱性蛋白酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过碱性蛋白酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使碱性蛋白酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的碱性蛋白酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组份按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将碱性蛋白酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的碱性蛋白酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化碱性蛋白酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，碱性蛋白酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化碱性蛋白酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使碱性蛋白酶以极高的效率被固定化。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组份按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将碱性蛋白酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的碱性蛋白酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化碱性蛋白酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定碱性蛋白酶后，反应残留液中测不到碱性蛋白酶的活性，说明经过交联后碱性蛋白酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183368430000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活的测定：分别配制浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的酪蛋白标准溶液，取上述溶液1.00mL(做三个平行实验)，加入碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，振荡均匀，置于40℃恒温水浴锅中显色20min，取出后在680nm波长下测定吸光度。蛋白酶的活力按GB/T23527-2009采用福林酚法进行测定。首先将酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴锅中，预热5min。将空白试管A与酶试样试管B(需做三个平行试样)加酶液1.00mL放入40℃恒温水浴锅中加热2min，试管A加三氯乙酸2.00mL，试管B加酪蛋白溶液1.00mL，分别摇匀后置于40℃恒温水浴锅中加热10min，然后试管A加酪蛋白溶液1.00mL，试管B加三氯乙酸2.00ml摇匀后取出静止10min，慢速定性滤纸分别过滤后各取1.00mL滤液，加入碳酸钠溶液5.0mL，再加入福林试剂使用液1.00mL于40℃下显色20min。在680nm波长下用10mm比色皿测定吸光度。样品的酶活力按下式进行计算：
Figure BSA0000183368430000042
式中：X3为蛋白酶的酶活力(U/g)；A1为由标准曲线得出的蛋白酶最终稀释液的活力(U/mL)；V1为溶解蛋白酶所使用的容量瓶的体积(mL)；n1为蛋白酶的稀释倍数；m4为蛋白酶的质量(g)。
蛋白酶活力定义为1g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g表示。
(2)固定化酶活的测定：加入2.5g固定化蛋白酶代替游离酶，放入摇床180rpm振荡1h，其余步骤按照游离酶的活力测定方法进行。固定化酶的酶活力定义与游离酶相同。酶活力为三次平行实验的平均值。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化碱性蛋白酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图1是相对活性与负载量的关系，当负载量在58～79mg酶/g载体范围时，固定化酶具有很高的活力，其比活力达到游离酶的90％以上，这个结果说明碱性蛋白酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量大于79mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法引入环糊精超分子结构单元，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性，但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活力会随负载量的增加而迅速下降。
我们以负载量为79mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图2所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液残留46％的活性，固定化酶残留84％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。
附图说明
图1固定化的碱性蛋白酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图2固定化与游离的碱性蛋白酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种碱性蛋白酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为碱性蛋白酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183368420000011
所述的碱性蛋白酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为454的双酚A环氧树脂、甲醇和三乙烯四胺三种组份按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将碱性蛋白酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)将不同浓度的碱性蛋白酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的碱性蛋白酶固定化产物。
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