CN110760505B - 一种α-乙酰乳酸脱羧酶的共交联固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种α‑乙酰乳酸脱羧酶的共交联固定化方法。使用油溶性的一缩二乙二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的α‑乙酰乳酸脱羧酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化α‑乙酰乳酸脱羧酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在39～79mg酶/g载体范围时其相对活性达到游离酶的90％以上。

Description

一种α-乙酰乳酸脱羧酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种α-乙酰乳酸脱羧酶的共交联固定化方法，该新型固定化α-乙酰乳酸脱羧酶可专门用于啤酒酿造工业中将α-乙酰乳酸脱羧转化为乙偶姻。
背景技术
α-乙酰乳酸脱羧酶(等电点为4.7)首次于1952年从产气肠杆菌中分离得到，之后有关该酶在生物界中的分布及菌种选育得到了广泛研究。据研究发现，只在原核生物某些细菌中有α-乙酰乳酸脱羧酶，多数α-乙酰乳酸脱羧酶的全酶分子量是单个亚基分子量的2倍，表明该酶由两个相同大小的亚基组成，最适pH值在5～7之间，最适反应温度为40℃。酶的活性依赖于Zn2+等金属离子，因此能与金属离子络合的配体，如8-羟基哇琳、邻苯二氮杂菲、二乙基二硫代氨基甲酸钠，都能抑制酶的活性。
α-乙酰乳酸脱羧酶主要应用于啤酒酿造工业中。双乙酰是啤酒发酵过程中必然产生的不良风味物。在成品啤酒中，若双乙酰含量超过其味阈值(0.15mg/L)时，会导致啤酒口味不纯，产生馊饭味。α-乙酰乳酸脱羧酶可以直接将双乙酰前驱物质-α-乙酰乳酸脱羧转化为乙偶姻，而不经形成双乙酰这一步骤，因而可以大大降解酒液中残留的α-乙酰乳酸，快速降低啤酒中双乙酰的含量，有效地缩短啤酒的生产周期，提高了设备的利用率及降低生产成本。保持啤酒在贮存过程中的质量稳定，避免发生双乙酰含量回升现象。同时因该反应的终产物没有发生改变，因而对啤酒风味没有影响。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于α-乙酰乳酸脱羧酶的固定，利用α-乙酰乳酸脱羧酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种α-乙酰乳酸脱羧酶的固定化方法，这种方法是基于α-乙酰乳酸脱羧酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为α-乙酰乳酸脱羧酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过α-乙酰乳酸脱羧酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使α-乙酰乳酸脱羧酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的α-乙酰乳酸脱羧酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将α-乙酰乳酸脱羧酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的α-乙酰乳酸脱羧酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，α-乙酰乳酸脱羧酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使α-乙酰乳酸脱羧酶以极高的效率被固定化。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将α-乙酰乳酸脱羧酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的α-乙酰乳酸脱羧酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定α-乙酰乳酸脱羧酶后，反应残留液中测不到α-乙酰乳酸脱羧酶的活性，说明经过交联后α-乙酰乳酸脱羧酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183362970000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活的测定：绘制乙偶姻标准曲线。将乙偶姻标准品配制成0～800μmol/L的各种浓度。各种浓度各取400μL，加入4.6mL显色剂，30℃显色40min后于波长522nm处读取吸光值，用吸光值对乙偶姻浓度(μmol/L)作图。
将原α-乙酰乳酸脱羧酶液进行稀释，取20μL稀释的酶溶液于试管中，加MES缓冲液300μL，30℃水浴预热10min，将底物混合液同时放入30℃水浴预热10min；在反应管中加入80μL α-乙酰乳酸底物混合液，迅速混匀后立即置于30℃恒温水浴中，精确反应20min后，迅速加入4.6mL显色剂，混匀，置于30℃显色40min后于波长522nm处读取吸光值。用缓冲液代替稀释酶液的反应管作为空白对照。
(2)固定化酶活的测定：取0.01g抽滤后的固定化酶代替20μL稀释酶液于试管中，其它操作同游离酶酶活力测定方法。
Figure BSA0000183362970000042
其中：N表示原α-乙酰乳酸脱羧酶溶液的稀释倍数；Ec表示从标准曲线对应522nm吸光值上读出的乙偶姻浓度值(μmol/L)。
酶活力单位：将在pH 6.0，30℃的试验条件下，α-乙酰乳酸脱羧酶反应每分钟转化生成1μmol乙偶姻所需的酶量，定义为1个酶活力单位U。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图1是相对活性与负载量的关系，当负载量在39～79mg酶/g载体范围时，固定化酶具有很高的活力，其比活力达到游离酶的90％以上，这个结果说明α-乙酰乳酸脱羧酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量大于79mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法引入环糊精超分子结构单元，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性，但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活力会随负载量的增加而迅速下降。
我们以负载量为79mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图2所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝6.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液残留52％的活性，固定化酶残留88％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。
附图说明
图1 固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图2 固定化与游离的α-乙酰乳酸脱羧酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种α-乙酰乳酸脱羧酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂一缩二乙二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为α-乙酰乳酸脱羧酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183362960000011
所述的α-乙酰乳酸脱羧酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为392的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将α-乙酰乳酸脱羧酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)将不同浓度的α-乙酰乳酸脱羧酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合；
5)在搅拌下将1.2g一缩二乙二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的α-乙酰乳酸脱羧酶固定化产物。
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