CN110777133B - 一种溶菌酶的共交联固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种溶菌酶的共交联固定化方法。使用油溶性的噠嗪双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的溶菌酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化溶菌酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在77mg酶/g载体时具有最高的活性，达到游离酶的76％。

Description

一种溶菌酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种溶菌酶的共交联固定化方法，该新型固定化溶菌酶可专门用于杀灭水或空气中的细菌，从而起到净化水或空气的作用。
背景技术
溶菌酶(EC 3.2.1.17)又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种安全、无毒的天然抑菌剂。溶菌酶能够破坏细胞壁中的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成细胞壁破损，内容物流出，导致菌体死亡。溶菌酶抗菌谱较广，对革兰氏阳性菌，如枯草菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有较好的抗菌效果。溶菌酶是一种碱性蛋白质(等电点为10.7～11.5)，是由一条多肽链所构成的，并通过其自身的4个二硫键交联结合，从而使其结构非常稳定，并且对酸、碱都极其稳定。溶菌酶其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。溶菌酶广泛存在于各种生物组织中，鸟类和家禽的蛋清，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液，鱼类、爬行动物、昆虫、植物等中都有发现，此外微生物中也含此酶，目前报道以蛋清含量最为丰富。近年来，随着生物技术的普及和人们环保意识的增强，尤其是高新技术产业的不断发展，溶菌酶作为一类天然无毒、安全有效的酶制剂，其作用价值正得到更加广泛的关注和新的认识，在医药、食品、饲料工业及生物工程、疾病诊断等高新技术产业等领域有独特优势和广阔的市场前景。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的溶菌酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的溶菌酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的溶菌酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于溶菌酶的固定，利用溶菌酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种溶菌酶的固定化方法，这种方法是基于溶菌酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为溶菌酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过溶菌酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使溶菌酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的溶菌酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和乙二胺三种组分按照2∶2∶0.8的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将溶菌酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的溶菌酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化溶菌酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，溶菌酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精超分子复合物改善了固定化溶菌酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使溶菌酶以极高的效率被固定化。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和乙二胺三种组分按照2∶2∶0.8的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将溶菌酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的溶菌酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化溶菌酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定溶菌酶后，反应残留液中测不到溶菌酶的活性，说明经过交联后溶菌酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183368710000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活的测定：取少量溶壁微球菌加入到LB液体培养基中，于28℃恒温震荡培养12h，菌液明显出现浑浊。将菌液收集，以4000r/min，4℃离心20min。倒去上清液，然后用少量0.1mol/LpH6.2的磷酸缓冲液悬浮菌体沉淀，然后倒入灭菌研体中研磨2min，使固/液相分布体系均匀稳定，再以0.1mol/LpH6.2磷酸缓冲液稀释菌液。以空白培养基设置为零时读数后，使稀释菌液在分光光度计中，以450nm波长扫描时的数值约为0.7。
取纯化后的鸡蛋清溶菌酶溶液稀释至50μg/mL的酶液，再分别将菌液和酶液置于25℃水浴中保温15min。然后在分光光度计中设定波长为450nm，进行时间扫描。吸取3mL菌液与200μL的酶液在比色杯中迅速摇匀后，放入分光光度计中进行测量，每隔30s记录A450nm，直至吸光值下降至恒定。重复3次，然后根据下式计算出每毫克酶制品中的活性单位数：
Figure BSA0000183368710000042
式中：ΔA450nm为450nm处每分钟吸光值的变化；Ew为200μL中含酶的质量(mg)；0.001为一个酶活性单位在每分钟内使光吸收下降的值。
(2)固定化酶活的测定：基本方法与步骤与上述游离酶活测定相同，只是用固定化酶代替游离酶溶液进行试验，酶活力也按照上述方程计算，其中的Ew为固定化酶中溶菌酶的实际含量。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化溶菌酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为77mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的76％，这个结果说明溶菌酶在固定化状态下其活力明显比游离状态下低，其主要原因是因为溶菌酶的底物是细菌，它们比小分子大得多，所以只有颗粒表面的溶菌酶才能起到杀菌的作用，颗粒中间的溶菌酶无法与底物接触，其活力自然要低很多。所以对固定化溶菌酶而言，其活力主要由传质的阻力决定。本发明专利的共交联固定法引入环糊精超分子结构单元，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性，但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性会迅速下降。
我们以负载量为77mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝6.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液残留77％的活性，固定化酶残留88％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要稍优于游离酶，这主要是因为溶菌酶本身具有很高的稳定性所致。
附图说明
图1交联剂的化学结构。
图2固定化的溶菌酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图3固定化与游离的溶菌酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种溶菌酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如下：
Figure FSA0000183368700000011
水相中的反应物为溶菌酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183368700000012
所述的溶菌酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为392的双酚A环氧树脂、甲醇和乙二胺三种组分按照2∶2∶0.8的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将溶菌酶溶解在pH＝9.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)将不同浓度的溶菌酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合；
5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的溶菌酶固定化产物。
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