CN110804604B

CN110804604B - 一种酪氨酸酶的共交联固定化方法

Info

Publication number: CN110804604B
Application number: CN201910417570.3A
Authority: CN
Inventors: 吴嘉沁; 张瑞丰; 李艳; 肖通虎; 龙能兵
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110804604A

Abstract

本发明是关于一种酪氨酸酶的共交联固定化方法。使用油溶性的噠嗪双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的酪氨酸酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化酪氨酸酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，在负载量为54mg酶/g载体时，其比活性高于游离的酪氨酸酶。

Description

一种酪氨酸酶的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种酪氨酸酶的共交联固定化方法，该新型固定化酶可用于废水中酚类物质的催化氧化，从而达到净化废水的目的。

背景技术

酪氨酸酶(等电点为5.5)，是一种分子量为75kD的铜蛋白酶，属于氧化还原酶，是参与黑色素代谢和儿茶酚胺合成的关键酶。L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成L-多巴，接着多巴被进一步催化氧化成为L-多巴醌。酪氨酸酶作为一种多酚氧化酶，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物体内，在生物体内具有许多重要的生理功能。广泛存在于动物、植物与微生物体内。酪氨酸酶是一种重要的生物资源，有着广泛的用途。酪氨酸酶对类黄酮、紫胶、鞣酸、酚类、生物碱、木质素、L-DOPA的生物合成起着重要作用；并且对植物的新陈代谢，如呼吸系统、中间物质的代谢、氧化-还原电位的调整、抗生素影响和植物的伤口愈合发挥着重要的作用。酪氨酸酶还与蔬菜和水果的酶促褐变有关，能催化酚类物质形成有色的醌及其聚合物，这一特性已经引起食品加工业的重视。在微生物体内，由于存在酪氨酸酶，很多微生物才能以单酚、二元酚以及联苯酚作为自己的能量物质。酚类化合物广泛存在于工业废水中。这种污染物在水中难降解，可产生毒性，对人体健康和环境具有严重危害，甚至具有致癌作用。酪氨酸酶可以使单酚类化合物羟基化生成邻苯二酚类化合物，再脱氢生成醌类化合物。醌类化合物在水溶液中不稳定，经过一系列酶催化和化学催化反应，自身聚合或与其它物质(有机胺类化合物等)聚合反应形成不溶于水的大分子物质而沉淀。因此酪氨酸酶不仅能除去酚类物质，还能去除其它多种有机物，如有机胺、有机氯化合物等。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的酪氨酸的酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的酪氨酸酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的酪氨酸酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于固定酪氨酸酶，利用酪氨酸酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酪氨酸酶的固定化方法，这种方法是基于酪氨酸酶与另一种含有机胺的超分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为酪氨酸酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物，固定化酶的负载量是通过酪氨酸酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使酪氨酸酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的酪氨酸酶；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1.1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将酪氨酸酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的酪氨酸酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，5～10分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化酪氨酸酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，酪氨酸酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精超分子复合物改善了固定化酪氨酸酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使酪氨酸酶以极高的效率被固定化。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1.1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将酪氨酸酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的酪氨酸酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，5～10分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化酪氨酸酶的产物。

酶的负载量测定：

由于共交联法固定酪氨酸酶后，反应残留液中测不到酶的活性，说明经过交联后酪氨酸酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶活的测定：酪氨酸酶催化反应的速度通过分光光度法监测L-多巴氧化生成多巴醌单位时间的生成量来计算，单位时间内多巴醌的生成量用475nm处的吸光值除以反应时间再除以多巴醌的摩尔吸光系数求得。

其中：ΔA475指475nm下吸光值的变化量；t指反应时间(min)；ε指多巴醌的摩尔吸光系数(L/mmol·mm)；L指比色皿的宽度(mm)。

在1cm的玻璃比色皿中加入0.8mL的L-多巴溶液(10mM)和1.2mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，50mM)，然后将比色皿迅速放入分光光度计中的加热槽里预热10min，再加入100μL酶液迅速混匀，立即启动分光光度计软件。通过跟踪产物在475nm处的吸光度随时间的变化，求出酶的初始反应速度。

(2)固定化酶活的测定：在50mL塑料离心管中加入1.6mL的L-多巴溶液(10mM)和18.4mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，50mM)，再加入5mg的固定化酶后置于摇床(30℃，200rmp)中反应，每隔5min取出2.0mL离心后取1.0mL测定其在475nm处的吸光值，测定后再倒回。以475nm处的吸光值表示固定化酶的活性。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化酪氨酸酶的样品，分别测定它们的催化反应初始速率，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为54mg酶/g载体的时候其相对活性达到105％，也就是说其比活是游离酶的105％，说明酶分子构象处于最适合催化的状态，并且这种构象得到了固定，因此其比活超过了游离酶。当负载量大于或小于54mg酶/g载体时，固定化酶的活性都会小于游离酶。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，但本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境达到最佳状态，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又下降。

我们以负载量为54mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝6.0的条件下，经过28天的储存，游离酶溶液的活性残留率为45％，而固定化酶的活性残留率为82％，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1交联剂的化学结构。

图2固定化酪氨酸酶的催化活性与其负载量的依赖关系。

图3固定化与游离酪氨酸酶的储存稳定性比较。

Claims

1.一种酪氨酸酶的共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如下：

水相中的反应物为酪氨酸酶及结构如下的分子复合物：

所述的酪氨酸酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：

1)将数均分子量为392的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1.1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

4)将不同浓度的酪氨酸酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合；

5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，5～10分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的酪氨酸酶固定化产物。