CN110760496B - 一种青霉素g酰化酶的共交联固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法。使用油溶性的丁二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的青霉素G酰化酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化青霉素G酰化酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在37mg酶/g载体时其相对活性达到游离酶的91％。

Description

一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法，该新型固定化青霉素G酰化酶可专门用于多种反应的特异性催化剂。
背景技术
青霉素G酰化酶(EC 3.5.1.11)又名青霉素氨基水解酶，属于氨基水解酶类，可以特异性地将酰胺健水解，是一种重要的工业用酶。青霉素G酰化酶属于分子量较大的球蛋白，其三维结构由含有催化位点的大亚基和含有侧链结合位点的小亚基(通过氢键结合而成。该酶等电点约在6.5～6.7。青霉素G酰化酶由α、β两个亚基组成，α或β亚基单独存在时均不具有酶活性，当二者通过氢键结合以后才有活性。α亚基可与青霉素G的侧链发生特异性结合，从而决定酶的底物专一性；β亚基含有催化位点和与催化有关的残基-丝氨酸残基，因而青霉素酰化酶与丝氨酸蛋白酶有相似之处，均可通过丝氨酸残基来催化反应。青霉素G酰化酶也是一种多功能酶，具有广泛的底物谱、高区域选择性、化学选择性和对映体选择性，能够催化多种反应。青霉素G酰化酶在手性化学品合成中应用广泛，主要可以分为6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的制备、β内酰胺抗生素的合成。此外，作为生物催化剂的青霉素酰化酶在很多反应中有潜在的价值，如在肽的合成过程中用于保护氨基和羟基，以及用于拆分手性化合物的外消旋混合物等，具有反应速度快、条件温和、对环境的污染小等优势。手性化合物的拆分、前手性化合物的不对称水解和多肽合成5个方面。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的青霉素G酰化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的青霉素G酰化酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的青霉素G酰化酶的储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于青霉素G酰化酶的固定，利用青霉素G酰化酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种青霉素G酰化酶的固定化方法，这种方法是基于青霉素G酰化酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为青霉素G酰化酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过青霉素G酰化酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使青霉素G酰化酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的青霉素G酰化酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将青霉素G酰化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的青霉素G酰化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化青霉素G酰化酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，青霉素G酰化酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化青霉素G酰化酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使青霉素G酰化酶以极高的效率被固定化。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将青霉素G酰化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的青霉素G酰化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的固定化青霉素G酰化酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定青霉素G酰化酶后，反应残留液中测不到青霉素G酰化酶的活性，说明经过交联后青霉素G酰化酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183373170000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活的测定：将1mL酶液与1mL青霉素G钾盐(4％w/v)混合，在37℃下，于摇床反应5min，取出1mL反应液加入1mL PDAB(0.25％)和3mL HAc-NaAc(pH＝2.5)缓冲液，室温下避光反应10min，在415nm下测吸光值。由标准曲线计算席夫碱浓度。
(2)固定化酶活的测定：利用碱滴定法。用100mL烧杯装入pH＝7.8的磷酸缓冲液20mL，按2％的量加入青霉素G钾盐0.4g，放入水浴锅中预热5min使底物溶液的温度维持在37℃，然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH到pH 8.0以上，最后加入超声破碎的待测酶液，然后再用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH到pH 8.0以上一点，当溶液pH降至pH 8.0时开始计时。反应过程中用被邻苯二甲酸氢钾标定过的0.1mol/L标准氢氧化钠溶液将底物溶液pH维持在pH 8.0左右，使反应时间维持5min，当溶液pH再次降为pH 8.0时，停止反应，立即记录反应时间和消耗的氢氧化钠溶液体积。
Figure BSA0000183373170000042
式中：U是待测青霉素G酰化酶溶液的酶活力(U/mL)；CNaOH是氢氧化钠溶液的物质的量浓度(mol/L)；VNaOH是消耗的氢氧化钠溶液体积(mL)；t是反应时间(min)；V1是PGA酶液的体积或固定化酶干重(mL或g)。
PGA酶活力定义：在1min内单位体积的PGA酶液催化青霉素G钾盐分解生成1μmol的6-APA所使用的酶量即为1个酶活力单位(U)。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化青霉素G酰化酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图1是相对活性与负载量的关系，当负载量在37mg酶/g载体范围时，固定化酶具有最高的活力，其比活力达到游离酶的91％以上，这个结果说明青霉素G酰化酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量大于37mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法引入环糊精超分子结构单元，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性，但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活力会随负载量的增加而迅速下降。
我们以负载量为37mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图2所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液残留36％的活性，固定化酶残留83％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。
附图说明
图1固定化的青霉素G酰化酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图2固定化与游离的青霉素G酰化酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种青霉素G酰化酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为青霉素G酰化酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183373160000011
所述的青霉素G酰化酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为392的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将青霉素G酰化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)将不同浓度的青霉素G酰化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合；
5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的青霉素G酰化酶固定化产物。
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