CN110804606B - 一种葡萄糖氧化酶的共交联固定化方法 - Google Patents

一种葡萄糖氧化酶的共交联固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种葡萄糖氧化酶的共交联固定化方法。使用油溶性的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的葡萄糖氧化酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化葡萄糖氧化酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在77mg酶/g载体时具有最高的活性，达到游离酶的93％。

Description

一种葡萄糖氧化酶的共交联固定化方法
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种葡萄糖氧化酶的共交联固定化方法，该新型固定化葡萄糖氧化酶可广泛应用于酒类及饮料产品的除糖去氧脱氢。
背景技术
葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)属于需氧脱氢酶(等电点为4.9)，是一种由两个相同亚基组成的同源二聚体糖蛋白。葡萄糖氧化酶来源广泛，工业用酶主要来自黑曲霉和青霉。该酶在自然条件下的两个亚基是由硫化物共价连接，分子量约160KD，其含糖量在11％～13％之间，其中甘露糖及其衍生物占其总含糖量的80％。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的作用机理是，首先与一分子的氧气反应生成葡萄糖内酯和过氧化氢，然后葡萄糖内酯再与一分子的水结合生成葡萄糖酸。
葡萄糖氧化酶具有除氧脱氢和抗氧化作用，广泛应用在食品、饲料、医药、生物等方面。在医疗行业中，通常将葡萄糖氧化酶制成试剂盒或者试纸的形式用于血清、尿液或脑液中葡萄糖的体外定量分析。纺织工业中棉的漂白通常使用氯化物或者过氧化氢来进行的。因此，可以通过利用葡萄糖氧化酶氧化淀粉酶在脱浆过程中生成葡萄糖，从而得到过氧化氢来进行漂白。葡萄糖氧化酶在酒类中起到抗啤酒氧化，保持啤酒风味，延长保质期等方面的作用。其作用机理是通过葡萄糖氧化酶与啤酒中的葡萄糖发生反应并消耗溶解氧，从而除去啤酒中的溶解氧，防止啤酒发生氧化变质。在面粉及其制品方面，一方面葡萄糖氧化酶通过与面团中葡萄糖反应产生H2O2氧化面团中的色素，使面制品更加洁白。另一方面H2O2可以氧化面筋蛋白中的二硫键，使得面筋蛋白交联形成更强大的网络结构，从而优化面筋蛋白的组织结构，使面团更加筋道，提高小麦面粉的加工特性、提升面团的品质。
固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的葡萄糖氧化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的葡萄糖氧化酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的葡萄糖氧化酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。
本发明专利提供一种共交联的方法用于葡萄糖氧化酶的固定，利用葡萄糖氧化酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种葡萄糖氧化酶的固定化方法，这种方法是基于葡萄糖氧化酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。
1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为葡萄糖氧化酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过葡萄糖氧化酶的浓度来调节。
非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使葡萄糖氧化酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的葡萄糖氧化酶；
非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将葡萄糖氧化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化葡萄糖氧化酶的产物。
非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，葡萄糖氧化酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；
非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；
非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。
本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化葡萄糖氧化酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使葡萄糖氧化酶以极高的效率被固定化；4)采用多官能度的交联剂能使固定化产物形成支化结构，阻止酶的聚集，提高酶的催化性能。
具体实施方式
酶的固定化
1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-44，环氧值为0.44，数均分子量为454)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将葡萄糖氧化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；
4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；
5)在搅拌下将1.2g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化葡萄糖氧化酶的产物。
固定化酶的负载量测定：
由于共交联法固定葡萄糖氧化酶后，反应残留液中测不到葡萄糖氧化酶的活性，说明经过交联后葡萄糖氧化酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：
Figure BSA0000183368170000041
其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。
酶活力测定：
(1)游离酶活力测定：取250mL锥形瓶，加入2％的葡萄糖磷酸缓冲液25mL和1mL酶液(酶浓度应控制在6.5～7.0活力单位左右，此时约消耗0.1mol/L的盐酸溶液4mL)，立即放在振荡器上于30℃、180rpm振荡1小时，然后加入20mL 0.1mol/L氢氧化钠终止反应，再用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数(V1)。空白对照是在加酶之前先加20mL 0.1mol/L氢氧化钠，不必振荡，其他操作相同，记录所消耗的盐酸毫升数(V2)。在上述条件下，每分钟催化葡萄糖氧化生成1μmol葡萄糖酸的酶量定义为1个酶活力单位。
Figure BSA0000183368170000042
式中，V2为空白组消耗HCl标准溶液的体积(mL)；V1为样品消耗HCl标准溶液的体积(mL)；c为HCl标准溶液的浓度(mol/L)；F为酶液稀释倍数；60为反应时间(min)；1000为单位换算系数。
(2)固定化酶活力测定：取上述配置的2％的葡萄糖磷酸缓冲液25mL放置在250mL锥形瓶中，加入2.5g固定化葡萄糖氧化酶代替游离酶，放入摇床180rpm振荡1h，其余步骤按照游离酶的活力测定方法进行。固定化酶的酶活力定义与游离酶相同。酶活力为三次平行实验的平均值。
相对活性：
将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。
实验结果：
实验一共得到7个不同负载量的固定化葡萄糖氧化酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为77mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的93％，这个结果说明葡萄糖氧化酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量小于77mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而增大，这主要是因为，酶的含量较低时，聚合物结构比较紧密，酶的催化活性不容易发挥出来，随着酶含量增加，聚合物的结构变的松散，酶与底物的接触机会增大，其相对活性也随之提高。当负载量大于77mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外支化程度高的交联剂还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又迅速下降。
我们以负载量为77mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.0条件下经过28天的储存，游离酶溶液只残留47％的活性，固定化酶能残留81％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。
附图说明
图1 交联剂的化学结构。
图2 固定化的葡萄糖氧化酶催化活性与其负载量的依赖关系。
图3 固定化与游离的葡萄糖氧化酶储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种葡萄糖氧化酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相是作为交联剂的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，其结构如下：
Figure FSA0000183368160000011
水相中的反应物为葡萄糖氧化酶及结构如下的分子复合物：
Figure FSA0000183368160000012
所述的葡萄糖氧化酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为454的双酚A环氧树脂、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；
3)将葡萄糖氧化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围，将不同浓度的葡萄糖氧化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合；
4)在搅拌下将1.2g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的葡萄糖氧化酶固定化产物。
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