CN102392013A - 一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用。本发明首先用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀后,加入纤维素酶溶液,于10~25℃吸附1~5h;接着加入沉淀剂于4~25℃沉淀0.5~2h;接着在沉淀后的体系中加入戊二醛溶液,于25~40℃交联反应3~15h,得到磁性固定化交联纤维素酶聚集体。本发明的制备方法成本低、易于操作。本发明通过磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术有机结合,不仅提高了磁性固定化酶的活力,而且改善CLEAs操作性能差的问题,得到的既具有较高酶活力又有良好操作性能的磁性固定化交联脂肪酶聚集体性质稳定,能作为生物酶催化剂广泛应用,特别适用于大规模酶反应器。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域,特别涉及一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用。
背景技术
纤维素酶(cellulase)是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称,它们协同作用,分解纤维素产生寡糖和纤维二糖,最终水解为葡萄糖,广泛用于食品、纺织、饲料、石油勘探、中药成分提取等领域。纤维素酶最热门的应用是分解纤维类物质产生生物燃料,从而代替目前生产生物燃料所消耗的大量玉米农作物,缓解粮食对粮食消耗压力,作为石油的可持续利用替代品。但纤维素酶发酵活力较低,而且水解效率比其他糖苷酶低1-2个数量级,这严重限制了纤维素酶的工业应用。同时,游离的纤维素酶存在稳定性差、易失活、无法重复利用的问题。加入产品中反应,会存在与产物难分离、纯化困难等问题,催化活性、使用成本和后期纯化等难题使其在工业上生产仍存在着较大困难。
研究发现,磁性固定化酶具有可回收、可重复利用、操作性能好的优点,并且添加磁场后易与产物分离、可适用于大规格酶解反应器,因此近年对磁性固定化酶研究报道日益增多。我国对纤维素酶的研究主要是在高产纤维素酶菌株的筛选和基因克隆表达方面,目前对纤维素酶固定化的研究还非常少。而且磁性固定化酶的活性相对于游离酶要低,通常只有游离酶活性40-50%,这是由于①所固定的酶蛋白的分子状态都是游离状态或自然状态,这些酶分子在固定化过程中与磁性载体作用容易失活,有时固定化酶的相对酶活仅为10%;②磁性固定化载体对酶的“活力稀释”(dilution of activity)作用,通常酶与载体的质量比不到10%,单位质量固定化酶中酶的量大大减少了。针对这些问题,目前主要的改善措施包括:通过优化固定化条件来减少游离酶的失活,从而提高磁性固定化酶的活性,或者采用纳米级的磁性载体,载体较大的比表面积吸附的酶量增多,从而提高单位酶的固载量。
交联酶聚集体(CLEAs)是近十年发展起来的无载体固定化酶。它通过蛋白质的盐析作用,将酶从溶液中迅速沉淀,经过交联剂固定,使酶的聚集型态固定,制备出高酶量、高酶活保留率及具有良好稳定性的固定化酶,它的催化活性比一般的吸附或交联固定化酶要高20-30%,许多的交联酶聚集体表现出超原酶活现象。同时它的制备方法简单,对酶的纯度要求不高,形成交联酶聚集体后稳定性增加,重复利用多次酶活下降不大。目前青霉素酰化酶和多种脂肪酶聚集体已实现工业化应用,具有良好的应用前景。但交联酶聚集体的结构相对而言比较疏散,用于大规模酶反应器的操作性能明显差于磁性固定化酶。工业化大规模的酶反应器为了让底物与酶催化剂充分接触,通常采用增加底物流体流动的措施,这样交联酶聚集体的结构会被破坏,降低交联酶聚集体的酶活。
如何获得高酶活而操作性能好的磁性固化酶是酶生物催化工业化应用的关键难题,是酶工业化应用的瓶颈问题。磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术都酶固定化的两种新技术,对这两种技术都分别在进行着不断地改善与完善工作。但是,充分考虑两种技术的优缺点,将两种技术相结合的酶固定化技术未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的磁性固定化交联纤维素酶聚集体。
本发明的再一目的在于提供所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,包含以下步骤:
(1)纤维素酶聚集体的制备:用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀后,离心后再加入纤维素酶溶液中,于10~25℃吸附1~5h;接着加入沉淀剂于4~25℃沉淀0.5~2h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成具有一定空间结构的纤维素酶聚集体,沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面;
(2)磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备:在上述沉淀后的体系中加入戊二醛溶液,得到反应体系,在50~200r/min的搅拌速度下,于25~40℃交联反应3~15h,用磁铁分离,最后用蒸馏水充分洗涤至不再检出蛋白质后,得到磁性固定化交联纤维素酶聚集体。
所述的磷酸缓冲液优选为pH5.0~8.0、浓度0.05~0.2mol/L的磷酸缓冲液;
步骤(1)中所述纤维素酶溶液优选使用上述磷酸缓冲液配制得到;
步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球优选通过包含如下步骤的制备方法制备得到:
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.0~3.0%醋酸溶液中,得到均一透明的壳聚糖浓度为质量体积比1.0~4.0%的胶体溶液;接着加入Fe3O4纳米颗粒,Fe3O4纳米颗粒的用量相当于前述胶体溶液中壳聚糖质量的1/4~1,超声作用下分散,得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液,放置待用;
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液;司班与吐温按质量比1~4∶1配比,液体石蜡占液体石蜡油相溶液的质量百分比85~95%;
③将步骤①制备的磁性壳聚糖胶体溶液滴入在搅拌状态下的液体石蜡油相溶液,磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液按体积比1∶2~4配比;接着搅拌10~40min后迅速加入戊二醛溶液,控制戊二醛最终浓度为体积百分比0.2~1.0%,继续搅拌40~120min,调节pH值为9~11,于60~80℃条件下反应60~120min,最后经磁铁吸附,洗涤,干燥,得到磁性壳聚糖复合微球。
步骤①中所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径范围优选为50~300nm;
步骤①中所述的超声分散的条件优选为20~40KHz分散10~40min;
步骤②中所述的司班优选为司班-80或司班-65;
步骤②中所述的吐温优选为吐温-80或吐温-65;
步骤③中所述的洗涤优选为依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤;
步骤③中所述的干燥优选为真空干燥;
步骤(1)中所述的充分溶胀为磁性壳聚糖复合微球溶胀至体积不再变大;
步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液的用量优选为按每1g磁性壳聚糖复合微球配比20~50mL磷酸盐缓冲液计算;
步骤(1)中所述的溶胀的时间优选为10~24h;
步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球和所述的纤维素酶优选按质量比5~30∶1配比;
步骤(1)中所述沉淀剂优选为硫酸铵、聚乙二醇中的至少一种;
所述的硫酸铵的溶液的饱和度优选为60~95%;
所述的聚乙二醇优选为PEG6000或PEG4000;
所述的聚乙二醇的质量浓度优选为40~60%;
步骤(1)中所述的纤维素酶溶液的浓度优选为3~10mg/mL;
所述的纤维素酶溶液的用量优选为1~10mL;
所述的纤维素酶溶液与所述的沉淀剂溶液优选按体积比1∶1~10配比。
步骤(2)中所述的戊二醛在反应体系中的最终浓度优选为0.03~0.3%;更优选为0.05~0.1%。
一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体,通过上述方法制备得到;
所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的酶活回收率在55~83%,最重要的是重复利用10次后,酶活回收率下降幅度不大;而未经过沉淀制备的固定化交联酶在重复利用10次后,酶活回收率下降幅度大。
所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体在食品领域、生物领域或医药领域中作为生物酶催化剂进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明将CLEAs技术引入磁性固定化酶的制备,实现磁性载体颗粒大小与CLEAs大小相匹配,从而将CLEAs替代游离酶固定在磁性固定化载体。这样,不仅提高了磁性固定化酶的活力,而且改善CLEAs操作性能差的问题,从而获得一种既具有较高酶活力,同时又有良好操作性能的生物酶催化剂。
(2)本发明所提供的制备方法成本低、易于操作,采用复合有机溶剂对酶液进行沉淀,使酶保持了很高的活性,并且达到较好的沉淀效果;得到的磁性固定化交联纤维素酶性质稳定、可多次重复利用、适用于大规模酶反应器。
附图说明
图1为实施例1制备的磁性壳聚糖微球的显微镜图。
图2为不同浓度戊二醛溶液对固定化交联纤维素酶聚集体酶活回收率影响。
具体实施方式
下面结合实例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
采用DNS法测定还原糖含量,1个酶活力单位定义为在50℃条件下,溶解在pH5.0浓度为0.05mol/L的醋酸缓冲液中的纤维素酶,1分钟内水解质量浓度2%羧甲基纤维素产生1微摩尔葡萄糖的量。
实施例中壳聚糖脱乙酰度≥90%,粘度<100cps,购自于上海伯奥生物科技有限公司。
实施例中纤维素酶由绿色木霉发酵,分子量52000,催化活性15U/mg,购自于上海伯奥生物科技有限公司。
实施例中Fe3O4纯度≥98%,购于国药集团化学试剂有限公司。
酶活回收率的计算方法是固定所述的化酶的总活力与用于制备固定化酶所加入原酶的总活力比值。
实施例1
磁性壳聚糖微球的制备
称取1.2g壳聚糖溶解于40mL体积浓度为3%醋酸溶液中,配制成质量体积比为3%的壳聚糖酸性胶体溶液,再加入0.3g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散30min,形成分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述磁性壳聚糖溶液加入到油相体系(由160mL液体石蜡、4.2g司班80和2.1g吐温80组成)中,以1000r/min速度搅拌30min后,滴入体积浓度3%的戊二醛溶液,戊二醛的最终体积浓度为0.2%,40℃条件下继续以1000r/min搅拌反应1h,再用3mol/L的NaOH调节pH值至11。接着在80℃下继续反应2h,最后在磁铁吸附下收集磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥后保存。制备的磁性微球呈球形,表面光滑完整,分散性良好,如图1所示。
实施例2
磁性壳聚糖微球的制备
称取0.8g壳聚糖溶解于40mL体积浓度为2%醋酸溶液中,配制成质量体积比为3%的壳聚糖酸性胶体溶液,再加入0.8g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散30min,形成分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述磁性壳聚糖溶液加入到油相体系(由160mL液体石蜡、5g司班80和2.5g吐温80组成)中,以1000r/min速度搅拌30min后,滴入体积浓度3%的戊二醛溶液,戊二醛的最终体积浓度为0.2%,40℃条件下继续以1000r/min搅拌反应1h,再用3mol/L的NaOH调节pH值至11。接着在60℃下继续反应2h,最后在磁铁吸附下收集磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥后保存。制备的磁性微球呈球形,表面光滑完整,分散性良好,由于Fe3O4纳米颗粒质量与壳聚糖质量比为1∶1,含量相对较多,微球的表面有大量Fe3O4微粒,呈深黑色。
实施例3
(1)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.45g实施例1制备的磁性壳聚糖复合微球加入到10mL磷酸缓冲液(pH7.5、0.05mol/L)中浸泡12h,使微球充分溶胀,离心后再加入到5mL浓度3mg/mL纤维素酶溶液(使用pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,于25℃充分吸附3h后加入5mL饱和度为60%硫酸铵溶液,10℃条件下静置沉淀2h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(2)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度为3%戊二醛溶液,戊二醛在溶液中的最终浓度为0.1%,在25℃,以125r/min的速度进行交联反应7h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率为83%。将制备的固定化交联酶聚集体与质量体积比为2%羧甲基纤维素于50℃反应30min后用磁铁分离,反复洗涤3次后,再加入底物参加反应,重复实验10次后仍有68%的酶活回收率。
实施例4
(1)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.5g实施例1制备的磁性壳聚糖复合微球加入到10mL磷酸缓冲液(pH7.5、0.05mol/L)中浸泡12h,使微球充分溶胀,离心后再加入到10mL浓度10mg/mL纤维素酶溶液(使用pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,于25℃充分吸附3h后加入10mL饱和度为95%硫酸铵溶液,10℃条件下静置沉淀2h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(2)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度为3%戊二醛溶液,戊二醛在溶液中的最终浓度为0.1%,在25℃,以125r/min的速度进行交联反应7h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率为77%。将制备的固定化交联酶聚集体与质量体积比为2%羧甲基纤维素于50℃反应30min后用磁铁分离,反复洗涤3次后,再加入底物参加反应,重复实验10次后仍有64%的酶活回收率。
实施例5
(1)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.2g实施例1制备的磁性壳聚糖复合微球加入到10mL磷酸缓冲液(pH7.5、0.05mol/L)中浸泡10h,使微球充分溶胀,离心后再加入到5mL浓度7mg/mL纤维素酶溶液(使用pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,于10℃充分吸附3h后加入15mL饱和度为80%硫酸铵溶液,10℃条件下静置沉淀2h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(2)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度3%戊二醛溶液,戊二醛的最终浓度为0.1%,在40℃以200r/min速度进行交联反应7h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH7.5、0.05mol/L磷酸缓冲液于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率为74%。将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后仍有61%的酶活回收率。
实施例6
(1)磁性壳聚糖微球的制备
称取1.6g壳聚糖溶解于40mL体积浓度为1%醋酸溶液中,配制成质量分数质量体积比为4%的壳聚糖酸性胶体溶液,再加入0.4g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散10min,得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述溶液加入到油相溶液(由80mL液体石蜡、5.0g司班85和4.5g吐温85组成)中,以800r/min搅拌30min后,加入体积浓度6%戊二醛溶液,戊二醛的最终浓度为0.5%,40℃条件下继续以800r/min搅拌反应2h后,用3mol/L的NaOH调节pH至9,在80℃下反应2h,最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。制备的磁性微球呈球形,表面光滑完整,无团聚现象分散性良好。
(2)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.5g步骤(1)制备的磁性壳聚糖复合微球加入到20mL磷酸缓冲液(pH7.0、0.1mol/L)中浸泡15h,使微球充分溶胀,离心后再加入到10mL浓度9mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附2h后加入40mL质量浓度为60%聚乙二醇6000溶液,25℃条件下静置沉淀1.0h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(3)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度1%戊二醛溶液,戊二醛的终浓度为0.08%,在25℃以50r/min速度进行交联反应9h得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。固定化酶的酶活回收率达到68%。将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后仍有56%的酶活回收率。
实施例7
(1)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.8g实施例6中步骤(1)制备的磁性壳聚糖复合微球加入到20mL磷酸缓冲液(pH6.0、0.05mol/L)中浸泡24h,使微球充分溶胀,离心后再加入到10mL浓度为10mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH5.0、0.2mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附4h后加入50mL饱和度95%硫酸铵溶液,4℃条件下沉淀2h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(2)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度5%戊二醛溶液,使戊二醛的终浓度为0.3%,在35℃以150r/min的速度进行交联反应12h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH6.0、浓度0.05mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率达到55%。将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后仍有42%的酶活回收率。
保持其他制备方法一致,改变步骤(2)中戊二醛的最终体积浓度为0.03%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,制备的固定化交联纤维素酶的酶活回收率呈现先上升后下降的结果,在戊二醛最终体积浓度为0.05~0.1%时,制备的固定化酶活性较高,如图2所示。
实施例8
(1)磁性壳聚糖微球的制备
称取0.8g壳聚糖溶解于80mL体积浓度为1%醋酸溶液中,配制成质量分数质量体积比为1%的壳聚糖酸性胶体溶液,再加入0.4g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散10min,得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述溶液加入到油相溶液(由240mL液体石蜡、5.1g司班80和5.1g吐温80组成)中,以800r/min搅拌30min后,加入体积浓度6%戊二醛溶液,戊二醛的最终浓度为1.0%,40℃条件下继续以1400r/min搅拌反应2h后,用3mol/L的NaOH调节pH至10,在80℃下反应2h,最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。制备的磁性微球呈球形,表面光滑完整,无团聚现象分散性良好。由于戊二醛添加量有些过量,因此将与壳聚糖表明氨基或醛基反应,微球有微量氧化,呈现黄褐色。
(2)纤维素酶聚集体的沉淀
将0.4g制备的磁性壳聚糖复合微球加入到20mL磷酸缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)中浸泡24h,使微球充分溶胀,离心后再加入到10mL浓度为10mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH6.0、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附4h后加入100mL质量浓度为40%聚乙二醇6000溶液,4℃条件下沉淀1h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(3)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度5%戊二醛溶液,使戊二醛的终浓度为0.15%,在30℃以150r/min的速度进行交联反应15h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH6.0、浓度0.05mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率达到57%。将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后仍有50%的酶活回收率。
实施例9
(1)纤维素酶聚集体的沉淀
将实施例8制备的0.4g磁性壳聚糖复合微球加入到20mL磷酸缓冲液(pH8.0、0.1mol/L)中浸泡24h,使微球充分溶胀,离心后再加入到10mL浓度为8mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH6.0、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附4h后加入100mL质量浓度为60%聚乙二醇4000溶液,4℃条件下沉淀1h,此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成纤维素酶聚集体沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面。
(3)固定化交联纤维素酶聚集体的制备
在沉淀后的酶液中加入体积浓度5%戊二醛溶液,使戊二醛的终浓度为0.15%,在30℃以125r/min的速度进行交联反应12h,得到固定化交联纤维素酶聚集体,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH6.0、浓度0.05mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。制备的固定化酶的酶活回收率达到56%。将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后仍有48%的酶活回收率。
对比实施例1
磁性壳聚糖微球的制备
称取1.2g壳聚糖溶解于40mL体积浓度为3%醋酸溶液中,配制成质量体积比为3%的壳聚糖酸性胶体溶液。再加入0.3g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散30min,形成分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述磁性壳聚糖溶液加入到油相体系(由80mL液体石蜡、2.3g司班80组成)中,以1000r/min速度搅拌30min后,滴入体积浓度3%的戊二醛溶液,戊二醛的最终浓度为0.2%,40℃条件下继续以1000r/min搅拌反应1h,再用3mol/L的NaOH调节pH值至11。接着在80℃下继续反应2h,最后在磁铁吸附下收集磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥后保存。在制备的过程中,壳聚糖溶液的乳化效果不是很好,停止高速搅拌后,较快破乳油水相易分层,制备的磁性微球粒度分布范围大(50-500μm)、团聚使得颗粒无规则形态。因此,从实验结果上考虑再添加亲水性较强的乳化剂吐温,与司班组成复合乳化剂对磁性壳聚糖溶液进行乳化交联,添加吐温后乳化效果明显比只用司班一种乳化剂效果好,微球呈球形,表明光滑,分散效果良好。
对比实施例2
(1)磁性壳聚糖复合微球的制备
称取1.2g壳聚糖溶解于40mL体积浓度为3%醋酸溶液中,配制成质量体积比为3%的壳聚糖酸性胶体溶液,再加入0.3g Fe3O4纳米颗粒,30KHz超声分散30min,形成分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液。在缓慢搅拌下,将上述磁性壳聚糖溶液加入到油相体系(由160mL液体石蜡、2.3g司班80和1.1g吐温80组成)中,以1000r/min速度搅拌30min后,滴入体积浓度3%的戊二醛溶液,戊二醛的最终体积浓度为0.2%,40℃条件下继续以1000r/min搅拌反应1h,再用3mol/L的NaOH调节pH值至11。接着在70℃下继续反应2h,最后在磁铁吸附下收集磁性壳聚糖复合微球,依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤,真空干燥后保存。
(2)固定化交联纤维素酶的制备
将0.2g制备的磁性壳聚糖复合微球加入到10mL磷酸缓冲液(pH6.0、0.05mol/L)中浸泡24h,使微球充分溶胀,再加入到5mL浓度为10mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH6.0、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附4h后,直接加入戊二醛溶液,至最终的体积浓度为0.1%,30℃条件下交联反应12h,得到固定化交联纤维素酶,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH6.0、浓度0.05mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。所制备的固定化酶的酶活回收率为62%,将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后有35%的酶活回收率。
对比实施例3
将0.2g对比实施例2制备的磁性壳聚糖复合微球加入到10mL磷酸缓冲液(pH6.0、0.05mol/L)中浸泡24h,使微球充分溶胀,再加入到5mL浓度为10mg/mL的纤维素酶溶液(使用pH6.0、0.05mol/L磷酸缓冲液配制)中,经充分吸附4h后,直接加入戊二醛溶液,至最终的体积浓度为0.1%,30℃条件下交联反应20h,得到固定化交联纤维素酶,经离心分离,蒸馏水充分洗涤后,加入pH6.0、浓度0.05mol/L磷酸缓冲液后于4℃保存。所制备的固定化酶的酶活回收率为65%,将制备的固定化交联酶聚集体与底物羧甲基纤维素反应30min后离心回收,重复实验10次后有40%的酶活回收率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
(1)纤维素酶聚集体的制备:用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀后,离心后再加入纤维素酶溶液中,于10~25℃吸附1~5h;接着加入沉淀剂于4~25℃沉淀0.5~2h;
(2)磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备:在上述沉淀后的体系中加入戊二醛溶液,得到反应体系,在50~200r/min的搅拌速度下,于25~40℃交联反应3~15h,用磁铁分离,最后用蒸馏水充分洗涤至不再检出蛋白质后,得到磁性固定化交联纤维素酶聚集体。
2.根据权利要求1所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:所述的磷酸缓冲液为pH5.0~8.0、浓度0.05~0.2mol/L的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球为通过包含如下步骤的制备方法制备得到:
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.0~3.0%醋酸溶液中,得到均一透明的壳聚糖浓度为质量体积比1.0~4.0%的胶体溶液;接着加入Fe3O4纳米颗粒,Fe3O4纳米颗粒的用量相当于前述胶体溶液中壳聚糖质量的1/4~1,超声作用下分散,得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液,放置待用;
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液;司班与吐温按质量比1~4∶1配比,液体石蜡占液体石蜡油相溶液的质量百分比85~95%;
③将步骤①制备的磁性壳聚糖胶体溶液滴入在搅拌状态下的液体石蜡油相溶液,磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液按体积比1∶2~4配比;接着搅拌10~40min后加入戊二醛溶液,控制戊二醛最终浓度为体积百分比0.2~1.0%,继续搅拌40~120min,调节pH值为9~11,于60~80℃条件下反应60~120min,最后经磁铁吸附,洗涤,干燥,得到磁性壳聚糖复合微球。
4.根据权利要求3所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:步骤①中所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径范围为50~300nm;
步骤②中所述的司班为司班-80或司班-65;
步骤②中所述的吐温为吐温-80或吐温-65;
步骤③中所述的洗涤为依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤;
步骤③中所述的干燥为真空干燥。
5.根据权利要求1所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液的用量为按每1g磁性壳聚糖复合微球配比20~50mL磷酸盐缓冲液计算;
步骤(1)中所述的溶胀的时间为10~24h;
步骤(1)中所述的纤维素酶溶液的浓度为3~10mg/mL;
步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球和所述的纤维素酶按质量比5~30∶1配比;
步骤(1)中所述沉淀剂为硫酸铵或聚乙二醇中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:所述的硫酸铵的溶液的饱和度为60~95%;
所述的聚乙二醇为PEG6000或PEG4000;
所述的聚乙二醇的质量浓度为40~60%;
所述的纤维素酶溶液的用量为1~10mL;
所述的纤维素酶溶液与所述的沉淀剂溶液按体积比1∶1~10配比。
7.根据权利要求1所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的戊二醛在反应体系中的最终浓度为0.03~0.3%。
8.一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体,通过权利要求1~7任一项所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法得到。
9.根据权利要求8所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体,其特征在于:所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的酶活回收率在55~83%。
10.权利要求8或9所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的应用,其特征在于:所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体在制备生物酶催化剂中的应用。
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