CN114377626A - 一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法 - Google Patents

一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法，同时采用琼脂糖及一种或多种其他具有亲水性可交联的间隔臂(纤维素、葡聚糖)进行成球，可以将纤维素或者葡聚糖覆盖在以琼脂糖微球的表面，琼脂糖在微球中充当骨架作用，纤维素或葡聚糖可以一端固定在琼脂糖骨架上，游离的另一端与蛋白A进行结合，从而达到增加微球的比表面积，增加微球载量，进而降低纯化成本的目的。

Description

一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法
技术领域
本发明属于磁珠制备技术领域，涉及一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法。
背景技术
琼脂糖磁珠是一种采用琼脂糖包埋四氧化三铁粉末，制备成具有良好顺磁性的琼脂糖微球，再将具有能够和抗体特异性结合的Protein A配基与微球进行偶联后得到同时具有磁性和特异性结合抗体的微球。该微球可以用于从动物腹水等培养液中快速提取抗体。
目前市场主要以单一琼脂糖为基质进行磁性琼脂糖微球的制备，并以此为基础进行蛋白A配基偶联，从而实现分离单克隆、多克隆抗体的目的。该种方法一般以降低磁珠粒径以提高比表面积，同时提高载量。但琼脂糖磁珠粒径过低时，会影响对四氧化三铁粉末的包埋效果，影响微球的结构强度，增加四氧化三铁粉末的泄露风险。同时，采用较小粒径的琼脂糖微球进行纯化时，会降低体系传质速率，增加磁吸分离时间，降低分离效果，使得进一步提高微球载量的成本和难度增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法，增加了微球载量，降低了纯化成本。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，包括：
1)制备复合多糖微球基球，包括：
1-1)制备含有多糖的油相：将非极性有机溶剂在搅拌状态下加热至50-90℃(更优选60-70℃)，然后将司班80或者司班80、司班60和/或吐温20的混合物加入非极性有机溶剂中得混合油相，然后再按照混合油相：多糖＝125:(1-2)的质量比加入纤维素或葡聚糖，搅拌使其完全溶解备用。
1-2)制备水相：制备琼脂糖水溶液(可在80-130℃条件下使琼脂糖完全溶解)，然后按照琼脂糖水溶液：四氧化三铁粉末＝100：(0.1-2)的质量比将四氧化三铁粉末加入其中，搅拌。
1-3)按照质量比5:(1-5)将步骤1-2)制备的水相加入步骤1-1)制备的油相中，搅拌，然后将反应在1h内降温至20℃以下。
1-4)使用去离子水进行清洗，去除有机相，得到复合多糖微球基球。
2)交联活化，包括：
2-1)将交联活化剂以及能够和水、非极性有机试剂均有良好互溶性的溶剂与复合多糖微球基球按照1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)的体积比混合。
2-2)将步骤2-1)得到的混合体系加热至30-40℃，按照微球：氢氧化钠＝10:(0.5-2)的体积质量比(ml/g)向其中加入30-60％氢氧化钠，反应3-18h，得到环氧基活化的复合多糖微球。
2-3)使用乙醇和去离子水对活化的复合多糖微球进行清洗，清除有机试剂及氢氧化钠，使其达到中性。
3)偶联Protein A配基，包括：
按照Protein A:磷酸盐缓冲液＝(1-1.5)：100的质量体积比(g/ml)将Protein A配基溶解于磷酸盐缓冲液中，然后与活化的复合多糖微球按照体积比1:1混合，向反应器中通入氮气，密封，排除空气，反应得到复合多糖磁性微球。
优选地，司班80、司班60、吐温20按照质量比10:(0-2):(0-1)的比例混合，即可以只加入司班80，或者同时加入司班80和司班60，或者同时加入司班80和吐温20，或者同时加入司班80、司班60、吐温20。
优选地，司班80或者司班80、司班60和/或吐温20的混合物的总质量与非极性有机溶剂的质量的比为(2-4):25。
优选地，步骤1-3)中，搅拌转速设置在100-300rpm之间，搅拌时间20-80min。
优选地，步骤2-1)中，所述交联活化剂为环氧氯丙烷、1,4丁二醇二缩水甘油醚中的一种或两种。
优选地，步骤1-1)中，所述非极性有机溶剂包括但不限于液体石蜡，石油醚，甲苯，邻二甲苯等中的一种或多种；步骤2-1)中，能够和水、非极性有机试剂均有良好互溶性的溶剂包括但不限于丙酮，1,4-二氧六环，二甲基亚砜中的一种或多种。
优选地，步骤3)中，所述磷酸盐缓冲液为0.05-0.3M、pH为7.0-9.0的磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤3)中，排除空气后，在80-150rpm、25-40℃条件下反应12-20h。
优选地，步骤3)还包括使用去离子水对复合多糖磁性微球进行清洗，去除未反应完的配基和磷酸盐。
本发明还提供了上述制备方法制备的一种新型复合多糖protein A磁珠。
本发明的有益效果在于：
本发明采用一种新型成球技术，同时采用琼脂糖及一种或多种其他具有亲水性可交联的间隔臂(纤维素、葡聚糖)进行成球，可以将纤维素或者葡聚糖覆盖在以琼脂糖微球的表面，琼脂糖在微球中充当骨架作用，纤维素或葡聚糖可以一端固定在琼脂糖骨架上，游离的另一端与蛋白A进行结合，从而达到增加微球的比表面积，增加微球载量，进而降低纯化成本的目的。普通Protein A琼脂糖微球载量一般为20-30mg/ml h-IgG，本工艺制备的复合多糖protein A磁珠载量可达40mg/ml以上。
附图说明
图1是本发明复合多糖Protein A磁性微球的结构示意图。
图2是本发明实施例1复合多糖Protein A磁性微球的光镜照片。
图3是本发明实施例1复合多糖Protein A磁性微球的粒径分布。
图4是本发明实施例2复合多糖Protein A磁性微球的粒径分布。
图5是本发明实施例3复合多糖Protein A磁性微球的粒径分布。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1.制备复合多糖微球基球
1)制备油相：称取500g液体石蜡于1L反应釜中，在机械搅拌120rpm条件下加热至70℃，然后称量40g司班80、2.0g司班60，混合后加入油相中，然后再加入4.0g葡聚糖，搅拌30min使其完全溶解备用。
2)制备水相：称取8.0g琼脂糖溶解于200g去离子水中，在120℃条件下加热1h使其完全溶解，然后将0.5g四氧化三铁粉末加入其中，搅拌。
3)将油相温度降至60℃，将水相加入油相中，将搅拌转速设置在200rpm，搅拌30min，然后水浴替换为冰水混合物，使用冰水混合物将反应在1h内降温至20℃以下。
4)使用去离子水进行清洗，去除有机相，得到200ml复合多糖微球基球。
2.交联活化
1)量取200ml环氧氯丙烷，200ml丙酮与复合多糖微球基球混合，加入1L反应釜中。
2)将上述混合体系加热至35℃，向其中加入30g 50％氢氧化钠，在200rpm条件下反应6h，得到环氧基活化的复合多糖微球。
3)使用乙醇和去离子水对活化的复合多糖微球进行清洗，清除有机试剂及氢氧化钠，使其达到中性。
3.偶联Protein A配基
1)称取2.0g Protein A配基溶解于200ml 0.2M的pH为8.0的磷酸盐缓冲液中，然后与200ml活化的复合多糖微球混合，加入1L反应釜中，向反应器中通入大量氮气，密封，排除空气。
2)将反应在80rpm、37℃条件下反应16h，得到复合多糖Protein A磁性微球。
3)使用去离子水对复合多糖微球进行清洗，去除未反应完的配基和磷酸盐，并对清洗液进行收集，测试未反应完的配基含量。
4)将清洗后多糖Protein A磁性微球保存于同体积的20％乙醇中，2-8℃。
5)进行h-IgG载量测试。
实施例2
1.制备复合多糖微球基球
1)制备油相：称取300g甲苯，200g石油醚于1L反应釜中，在机械搅拌120rpm条件下加热至80℃，然后称量40g司班80、3.5g吐温20，混合后加入油相中，然后再加入4.0g纤维素，搅拌30min使其完全溶解备用。
2)制备水相：称取8.0g琼脂糖溶解于200g去离子水中，在120℃条件下加热1h使其完全溶解，然后将0.5g四氧化三铁粉末加入其中，搅拌。
3)将油相温度降至60℃，将水相加入油相中，将搅拌转速设置在280rpm，搅拌30min，然后水浴替换为冰水混合物，使用冰水混合物将反应在1h内降温至20℃以下。
4)使用去离子水进行清洗，去除有机相，得到200ml复合多糖微球基球。
2.交联活化
1)量取200ml 1,4丁二醇二缩水甘油醚，200ml二甲基亚砜与复合多糖微球基球混合，加入1L反应釜中。
2)将上述混合体系加热至40℃，向其中加入20g 50％氢氧化钠，在200rpm条件下反应6h，得到环氧基活化的复合多糖微球。
3)使用乙醇和去离子水对活化的复合多糖微球进行清洗，清除有机试剂及氢氧化钠，使其达到中性。
3.偶联Protein A配基
1)称取2.0g Protein A配基溶解于200ml 0.2M的pH为8.0的磷酸盐缓冲液中，然后与200ml活化的复合多糖微球混合，加入1L反应釜中，向反应器中通入大量氮气，密封，排除空气。
2)将反应在80rpm、37℃条件下反应16h，得到复合多糖Protein A磁性微球。
3)使用去离子水对复合多糖微球进行清洗，去除未反应完的配基和磷酸盐，并对清洗液进行收集，测试未反应完的配基含量。
4)将清洗后多糖Protein A磁性微球保存于同体积的20％乙醇中，2-8℃。
5)进行h-IgG载量测试。
实施例3
1.制备复合多糖微球基球
1)制备油相：称取300g甲苯，100g邻二甲苯，100g石油醚于1L反应釜中，在机械搅拌120rpm条件下加热至60℃，然后称量35g司班80、1.0g司班60、3.5g吐温20，混合后加入油相中，然后再加入4.0g葡聚糖，搅拌30min使其完全溶解备用。
2)制备水相：称取8.0g琼脂糖溶解于200g去离子水中，在120℃条件下加热1h使其完全溶解，然后将0.5g四氧化三铁粉末加入其中，搅拌。
3)将油相温度降至60℃，将水相加入油相中，将搅拌转速设置在300rpm，搅拌30min，然后水浴替换为冰水混合物，使用冰水混合物将反应在1h内降温至20℃以下。
4)使用去离子水进行清洗，去除有机相，得到200ml复合多糖微球基球。
2.交联活化
1)量取100ml环氧氯丙烷，100ml 1,4丁二醇二缩水甘油醚，200ml 1,4-二氧六环与复合多糖微球基球混合，加入1L反应釜中。
2)将上述混合体系加热至40℃，向其中加入20g 50％氢氧化钠，在200rpm条件下反应6h，得到环氧基活化的复合多糖微球。
3)使用乙醇和去离子水对活化的复合多糖微球进行清洗，清除有机试剂及氢氧化钠，使其达到中性。
3.偶联Protein A配基
1)称取2.0g Protein A配基溶解于200ml 0.2M的pH为8.0的磷酸盐缓冲液中，然后与200ml活化的复合多糖微球混合，加入1L反应釜中，向反应器中通如大量氮气，密封，排除空气。
2)将反应在80rpm、37℃条件下反应16h，得到复合多糖Protein A磁性微球。
3)使用去离子水对复合多糖微球进行清洗，去除未反应完的配基和磷酸盐，并对清洗液进行收集，测试未反应完的配基含量。
4)将清洗后多糖Protein A磁性微球保存于同体积的20％乙醇中，2-8℃。
5)进行h-IgG载量测试。
本发明制备得到的复合多糖Protein A磁性微球的结构如图1所示。
测试例
1.配基密度测试：
使用紫外分光分度计分别测试实施例1/2/3的未反应完的配基含量m2，配基投料量m1，参与反应的琼脂糖磁性微球的体积为v，则配基密度＝(m1-m2)/v，配基密度数据见表1。
2.h-IgG载量测试：
1)使用移液器分别量取100μL(v)实施例1/2/3与某公司市售Magrose Protein A至5ml离心管中。
2)磁性分离去除保存液，然后加入1mL Wash Buffer(PBST，pH 7.2-7.4:PBS with0.02％Tween-20)混匀磁珠，磁性分离去除上清液(重复3次)。
3)使用Binding Buffer(PBST,pH 7.2-7.4:PBS with 0.02％Tween-20)稀释h-IgG样品至5mg/mL，然后吸取1ml加入到装有磁珠的离心管中，使用摇床在120rpm、室温条件下震荡30min。
4)使用1mL Wash Buffer洗涤磁珠-抗体复合物3次。
5)向离心管中加入1mL的Elution Buffer(100mM Glycine,pH 2.5-2.8)，用移液器轻轻混匀避免气泡产生，颠倒混匀10分钟。
6)磁吸分离上清液，收集，使用紫外分光分度计(考马斯亮蓝法)测试h-IgG含量(m)。
7)载量计算：载量＝m/v，载量数据见表1。
表1：实施例1/2/3和市售竞品的配基密度及载量
Figure BDA0003441379970000071
3.外观及粒径测试：
使用显微镜观察实施例1的外观，见图2，四氧化三铁粉末包埋良好，琼脂糖骨架及外层包覆多糖呈通透状态，球体圆润光滑。
使用激光粒度仪对实施例1/2/3进行粒径分布测试，见图3/4/5，微球平均粒径在45-50μm，粒径分散较窄(SPAN值＜0.9，SPAN＝(D90-D10)/D50)，呈单分散状态。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，包括：
1)制备复合多糖微球基球，包括：
1-1)制备含有多糖的油相：将非极性有机溶剂在搅拌状态下加热至50-90℃，然后将司班80或者司班80、司班60和/或吐温20的混合物加入非极性有机溶剂中得混合油相，然后再按照混合油相：多糖＝125:1-2的质量比加入纤维素或葡聚糖，搅拌使其完全溶解备用；
1-2)制备水相：制备琼脂糖水溶液，然后按照琼脂糖水溶液：四氧化三铁粉末＝100：0.1-2的质量比将四氧化三铁粉末加入其中，搅拌；
1-3)按照质量比5:1-5将步骤1-2)制备的水相加入步骤1-1)制备的油相中，搅拌，然后将反应在1h内降温至20℃以下；
1-4)使用去离子水进行清洗，去除有机相，得到复合多糖微球基球；
2)交联活化，包括：
2-1)将交联活化剂以及能够和水、非极性有机试剂均有良好互溶性的溶剂与复合多糖微球基球按照1:0.8-1.2:0.8-1.2的体积比混合；
2-2)将步骤2-1)得到的混合体系加热至30-40℃，按照微球：氢氧化钠＝10:0.5-2的体积质量比向其中加入30-60％氢氧化钠，反应3-18h，得到环氧基活化的复合多糖微球；
2-3)使用乙醇和去离子水对活化的复合多糖微球进行清洗，清除有机试剂及氢氧化钠，使其达到中性；
3)偶联Protein A配基，包括：
按照Protein A:磷酸盐缓冲液＝1-1.5：100的质量体积比将Protein A配基溶解于磷酸盐缓冲液中，然后与活化的复合多糖微球按照体积比1:1混合，向反应器中通入氮气，密封，排除空气，反应得到复合多糖磁性微球。
2.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，所述司班80、司班60、吐温20按照10:0-2:0-1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，司班80或者司班80、司班60和/或吐温20的混合物的总质量与非极性有机溶剂的质量的比为2-4:25。
4.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤1-3)中，搅拌转速设置在100-300rpm之间，搅拌时间20-80min。
5.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤2-1)中，所述交联活化剂为环氧氯丙烷、1,4丁二醇二缩水甘油醚中的一种或两种。
6.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤1-1)中，所述非极性有机溶剂包括液体石蜡，石油醚，甲苯，邻二甲苯中的一种或多种；步骤2-1)中，能够和水、非极性有机试剂均有良好互溶性的溶剂包括丙酮，1,4-二氧六环，二甲基亚砜中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述磷酸盐缓冲液为0.05-0.3M、pH为7.0-9.0的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤3)中，排除空气后，在80-150rpm、25-40℃条件下反应12-20h。
9.根据权利要求1所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法，其特征在于，步骤3)还包括使用去离子水对复合多糖磁性微球进行清洗，去除未反应完的配基和磷酸盐。
10.权利要求1-9任意一项所述的一种新型复合多糖protein A磁珠的制备方法制备的一种新型复合多糖protein A磁珠。
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