CN109929049B

CN109929049B - 一种脱除酸性多糖中重金属的方法

Info

Publication number: CN109929049B
Application number: CN201910249131.6A
Authority: CN
Inventors: 宋爽; 王琳琳; 温成荣; 艾春青; 付颖寰; 杨静峰; 杨琳; 宫悦; 王立龙; 祁立波; 张慧
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109929049A

Abstract

本申请涉及一种脱除酸性多糖中重金属的方法。所述方法包括如下步骤：A、酸性多糖中加入含有阳离子的化合物溶液并混合，得到混合溶液；B、搅拌所述混合溶液，所述搅拌过程的温度为15℃～60℃，转速为120～300r/min；C、所述混合溶液经截留分子量为500～3500Da的分离装置分离，除去所述混合溶液中的酸和/或盐，得到截留液，所述截留液中脱除了重金属。本申请提出的脱除酸性多糖中重金属的方法，成本较低，且操作过程简便、易控制，在脱除其中有害的重金属后，还能得到有益的产物。

Description

一种脱除酸性多糖中重金属的方法

技术领域

本发明涉及环境污染治理领域，具体涉及一种脱除酸性多糖中重金属的方法。

背景技术

多糖物质广泛存在于动物、植物和微生物的组织中，其应用范围比较广、生物活性高，具有增强免疫功能、抗病毒、抗肿瘤以及调节细胞的生长和衰老等多种生理调节功能。多糖具有很高的营养价值和保健功效，目前已成为全球研究的热点。然而，环境污染愈发严重，使得一些海洋多糖容易结合重金属离子，导致多糖中的重金属含量超标，从而极大地影响了海洋多糖及其相关制品的安全性。

海洋多糖易结合重金属离子，主要是由于多糖中含有的硫酸基、羧基具有较高的电负性，易吸附带正电的重金属离子。

目前，脱除加工产物中的重金属的方法包括电渗析法、离子交换树脂法、壳聚糖法等。由于一些海洋多糖与重金属的结合能力较强，重金属的脱除比较困难，就需要上述的两种技术结合使用才能达到脱除效果。

根据文献“鲍鱼性腺多糖中有害重金属的脱除[J].中国食品学报，2017，17(2)：148-151.”中提供的脱除多糖中有害重金属的方法，采用的是离子交换树脂法和电渗析法。其中，离子交换树脂法需要用水、酸、碱来交互清洗树脂，耗时长、操作过程冗杂，并且需要购买树脂，样品的体积也较大，而且需要进行浓缩、冻干等处理才能得到干燥粉末。电渗析法需要购买电渗析设备，电渗析过程的电压较大，达到了20V，进水流量为20L/h，需要循环进水50min，且该循环过程需要重复进行三次，耗费大量的水电资源。

上述的重金属脱除方法的成本均较高、操作过程复杂，目前还没有能被行业广泛接受。

发明内容

鉴于现有技术中存在的技术问题，本申请旨在提出一种脱除多糖中、尤其是海洋多糖中含有的重金属的方法，该方法的成本较低、操作简单、易控制。

本申请提出了一种脱除酸性多糖中重金属的方法，所述方法包括如下步骤：

A、酸性多糖中加入含有阳离子的化合物溶液并混合，得到混合溶液；

B、搅拌所述混合溶液，所述搅拌过程的温度为15℃～60℃，转速为120～300r/min；

C、所述混合溶液经截留分子量为500～3500Da的分离装置分离，除去所述混合溶液中的酸和/或盐，得到截留液，所述截留液中脱除了重金属。

作为本申请可选的实施方式，所述酸性多糖的浓度为0.5～10mg/mL。

作为本申请可选的实施方式，所述含有阳离子的化合物为含有铁离子的化合物。

进一步地，所述含有铁离子的化合物为氯化铁、硫酸铁铵、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸铁钠中的一种或多种。

作为本申请可选的实施方式，所述含有铁离子的化合物的溶液中，铁离子的浓度为1mol/L～4mol/L。

作为本申请可选的实施方式，所述混合溶液中，所述酸性多糖与所述铁离子的摩尔比为100～1000:1。

进一步地，控制所述混合溶液的pH为7.5～8.5。

作为本申请可选的实施方式，所述含有阳离子的化合物为含有氢离子的化合物。

进一步地，所述含有氢离子的化合物为盐酸、硫酸或柠檬酸中的一种或多种。

进一步地，所述含有氢离子的化合物溶液的pH为2～6。

作为本申请可选的实施方式，步骤B中，当在所述搅拌过程中产生不溶物后，对搅拌后的混合溶液进行离心，除去所述不溶物；优选的，所述离心过程的转速为3000～5000r/min，离心时间为10～20min。

作为本申请可选的实施方式，所述分离装置选用截留分子量为500～3500Da的透析袋或超滤装置。

本申请提出的脱除酸性多糖中重金属的方法，成本较低，且操作过程简便、易控制。

本申请提出的用氢离子脱除酸性多糖中重金属的方法，对重金属的脱除效果好，经处理后的多糖中重金属的含量在国标法允许的范围内。

并且，本申请提出的用铁离子或锌离子等脱除酸性多糖中重金属的方法，在脱除酸性多糖中有害重金属的同时，能得到具有补铁、补锌作用的酸性多糖复合物。

附图说明

图1为实施例1的AGSP-铁复合物不同倍数的透射电镜图。

图2为相同浓度的AGSP与实施例1的AGSP-铁复合物的紫外光谱对比图。

图3为相同浓度的AGSP与实施例1的AGSP-铁复合物在不同倍数的扫描电镜图。

图4为实施例1制备的AGSP-铁复合物在不同浓度时对Caco-2细胞铁吸收的影响结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

基于阳离子竞争法，本申请提出了一种脱除酸性多糖中重金属的方法。本申请的方法尤其适用于脱除海洋酸性多糖中的重金属。并且，本申请的方法也适用于富含海洋酸性多糖的提取物或相关制品。

酸性多糖中含有的硫酸基和/或羧基具有较高的电负性，易吸附带正电的重金属离子。本申请的技术方案利用一些阳离子与酸性多糖中的基团之间结合能力的大小不同，来替换酸性多糖上吸附的重金属离子，达到脱除重金属离子的目的。

本申请提出的脱除酸性多糖中重金属的方法，包括如下步骤：

A、向酸性多糖中加入含有阳离子的化合物溶液，混合均匀后得到混合溶液。

可选地，本步骤中，控制酸性多糖的浓度为0.5～10mg/mL(毫克/毫升)。

本步骤中，酸性多糖的浓度不易过高或过低：酸性多糖的浓度过高时，会加深混合溶液的颜色，不利于反应终点的判断；酸性多糖的浓度过低时，会增加混合溶液的体积，导致后期的处理成本提高。

B、对步骤A得到的混合溶液进行充分搅拌。其中，搅拌过程中，控制温度为15℃～60℃。搅拌过程搅拌子的转速为120～300r/min(转/分钟)。进一步地，对混合溶液搅拌2～8h(小时)。

进一步地，在搅拌过程中，由于一些阳离子与多糖不断聚合时会产生不溶物，趁热对搅拌后的混合溶液进行离心，除去其中的不溶物。可选地，离心过程的转速为3000～5000r/min，离心时间为10～20min(分钟)，保证充分分离不溶物。

C、步骤B中，经搅拌后的混合溶液经截留分子量为500～3500Da的分离装置进行分离，除去混合溶液中的酸和/或盐，得到截留液。

作为本申请可选的实施方式，分离装置选用截留分子量为500～3500Da的透析袋或超滤装置，例如超滤膜。并且，在透析或超滤过程中采用去离子水或是纯净水。

步骤C中得到的截留液中，脱除了酸性多糖中的重金属。

作为本申请可选的实施方式，阳离子选择铁离子、锌离子或氢离子等。进一步地，本申请的实施例中，阳离子选择铁离子或是氢离子。

其中，铁是人体必需的微量元素，三价的铁离子与大分子的电负性基团有较强的结合能力。因此，铁离子能够和有害的重金属离子进行竞争，替换多糖中的有害重金属离子，在生成多糖铁复合物的同时去除多糖中的有害重金属离子。并且，生成的多糖铁复合物还具有补铁等的功能活性。另外，氢离子也能够竞争替换下多糖中的重金属离子，从而达到脱除海洋多糖中重金属的目的。

作为本申请其中一种实施方式，向酸性多糖中加入含有铁离子的化合物。该实施方式中，含有铁离子的化合物选用氯化铁、硫酸铁铵、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸铁钠等三价铁离子化合物中的一种或多种的混合物。酸性多糖的浓度为0.5～10mg/mL。含有铁离子的化合物中，铁离子的浓度控制为1mol/L～4mol/L。

本实施方式中，酸性多糖在搅拌时，向其中逐滴滴加含有铁离子的化合物溶液，直至酸性多糖与铁离子的摩尔比达到100～1000:1，经混合均匀后得到混合溶液。混合溶液中，铁离子能够与酸性多糖的基团充分结合，避免铁离子过量时会产生沉淀。

进一步地，在酸性多糖和铁离子的混合过程中，通过滴加氢氧化钠溶液，控制混合溶液的pH在7.5～8.5之间。通过控制混合溶液的pH为7.5～8.5，能够促进铁离子与多糖中的基团结合，且不会产生氢氧化铁沉淀。

作为本申请的又一种实施方式，向酸性多糖中加入含有氢离子的化合物。该实施方式中，含有氢离子的化合物选用盐酸、硫酸或柠檬酸等含有氢离子的有机酸或无机酸中的一种或多种的混合物。酸性多糖的浓度为0.5～10mg/mL。含有氢离子的化合物溶液的pH为2～6。当含有氢离子的化合物溶液pH小于2时，会导致多糖分解。当pH大于6时，无法起到脱除重金属的作用。

在该实施方式中，将酸性多糖溶解在pH为2～6的含有氢离子的化合物溶液中，混合均匀后得到混合溶液。

在上述两种实施方式中，还均包括截留液的干燥步骤。将步骤C得到的截留液冻干，对于其中一种使用铁离子的实施方式，将得到已脱除重金属的多糖-铁复合物；对于另一种使用氢离子的实施方式，将得到已脱除重金属的酸性多糖。

本申请的脱除酸性多糖中重金属的方法，适用于海洋多糖中含有的有害重金属的脱除。通常，这些海洋多糖为含有硫酸基和/或羧基的酸性多糖。其中，海洋多糖包括海藻、贝类等海产品中的多糖。进一步地，本申请的脱除酸性多糖中重金属的方法，同样适用于富含海洋酸性多糖的提取物或相关制品。

以下，将结合具体实施例，对本申请的具体实施方案进行详细描述。下述实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

(1)称取2g干燥的鲍鱼内脏多糖(AGSP)，称取1g柠檬酸三钠。

将鲍鱼内脏多糖和柠檬酸三钠加入2L的烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器中。

打开磁力搅拌器，设置烧杯中转子的转速为300rpm(转/分钟)，将磁力搅拌器的温度设置为50℃。向烧杯中加入800mL的去离子水，在磁力搅拌器的搅拌下，溶解鲍鱼内脏多糖和柠檬酸三钠，得到澄清透明的溶液。

保持磁力搅拌器的温度不变，并维持在连续搅拌的状态下，向烧杯中逐滴滴加6mL浓度为2mol/L的FeCl₃·6H₂O溶液。同时，向烧杯中滴加质量浓度为20％的氢氧化钠溶液，控制烧杯中溶液的pH为8。

(2)保持磁力搅拌器的温度为50℃，并保持磁力搅拌器中转子的转速为300rpm，对烧杯中的溶液连续搅拌4小时，得到混合溶液。

(3)将混合溶液趁热离心10min，离心过程中，控制转速为4000r/min，除去混合溶液中的不溶物。

(4)使用截留分子量为500Da的透析袋对混合溶液进行透析。首先，使用自来水流水透析24h，再用去离子水透析48h，除去混合溶液中的盐，并收集截留液。

(5)对截留液进行冻干处理，得到AGSP-铁复合物粉末。

本实施例中，获得的AGSP-铁复合物的外观呈红棕色棉絮状。

按照GB 5009.15-2014所提供的方法，进行重金属镉的检测：原鲍鱼内脏多糖(AGSP)中金属镉的含量为0.39mg/kg(毫克/千克)；经铁离子竞争法处理后得到的AGSP-铁复合物中金属镉的含量为0.19mg/kg。

如图1所示，为本实施例得到的AGSP-铁复合物在不同倍数的透射电镜图。其中，图片A为12000×倍数，图片B为60000×倍数。由图1，本实施例得到的AGSP-铁复合物呈现不规则的结构。

如图2所示，为相同浓度的AGSP与本实施例得到的AGSP-铁复合物的紫外光谱对比图。如图所示，在横坐标波长为310nm处，Fe-O键的吸收峰处，AGSP-铁复合物的吸光度明显高于AGSP的吸光度。

如图3所示，为相同浓度的AGSP与本实施例的AGSP-铁复合物在不同倍数下的扫描电镜图。其中，图片A和图片B分别为1000×倍数时AGSP和AGSP-铁复合物的扫描电镜图。图片C和图片D分别为10000×倍数时AGSP和AGSP-铁复合物的扫描电镜图。由图3可以看出，AGSP为呈现不规则厚度的片状结构，AGSP-铁复合物为实心的球状或棒状结构。

实施例2

(1)称取1.5g鲍鱼内脏多糖，置于烧杯中，并溶解于150mL pH＝2的盐酸水溶液中。

(2)打开磁力搅拌器，设置温度为37℃，设置转子转速为300rpm，连续搅拌4h，得到混合溶液。

(3)将上述得到的混合溶液装入截留分子量为3500Da超滤膜的超滤杯中，在氮气加压的情况下搅拌5h。保持氮气加压，再加入150mL pH＝2的盐酸溶液，搅拌5h，重复该过程三次。然后加入150mL超纯水，搅拌5h，重复该过程三次。超滤分离除去混合溶液中的酸，并收集截留液。

(4)对截留液进行浓缩、冷冻干燥，得到脱除了重金属的海洋多糖粉末。

按照GB 5009.15-2014所提供的方法，进行重金属镉的检测：原鲍鱼内脏多糖(AGSP)中金属镉的含量为0.174mg/kg；经氢离子竞争法处理后得到的鲍鱼内脏多糖(AGSP)中，金属镉的含量小于国标法(GB5009.15-2014)所允许的含量(＜0.06mg/kg)。

因此，经过上述实施例的验证，本申请所提出的脱除酸性多糖中重金属的方法，能够较好的脱除酸性多糖中的重金属，操作过程简便且成本低。

实施例3

(1)称取实施例1制备的AGSP-铁复合物50mg，并溶解于10mL的蒸馏水中。

(2)胃蛋白酶溶液和胰酶-胆汁溶液皆现配现用。

胃蛋白酶溶液的配置过程如下：称取0.08g胃蛋白酶，溶于1mL0.1mol/L的盐酸溶液中，再加入0.5g氢型交换树脂(50WX8，200～400目)，用磁力搅拌器在恒温37℃对其搅拌30分钟。然后将含树脂的胃蛋白酶溶液倒入直径为1.6cm的过滤柱中，以从胃蛋白酶溶液中过滤出树脂。再向过滤柱中加入另外1mL 0.1mol/L的盐酸溶液，并将滤液收集到胃蛋白酶溶液中。

胰酶-胆汁溶液的配置过程如下：将0.01g胰酶和0.06g胆汁提取物溶于5mL0.1mol/L的NaHCO₃(碳酸氢钠溶液)中，加入2.5g树脂，并将所得混合物在磁力搅拌器上恒温37℃搅拌30分钟。然后将混合物倒入直径为1.6cm的过滤柱中过滤出树脂。再向柱中加入另外2mL 0.1mol/L NaHCO₃并将滤液收集到胰酶-胆汁溶液中。洗脱的胃蛋白酶溶液和胰酶-胆汁溶液的最终体积分别为1.6mL和5.4mL。

进行模拟消化前，用5mol/L的盐酸溶液调节样品的pH为2。将10mL的样品转移到50mL的离心管中，加入0.5mL胃蛋白酶溶液，并用磁力搅拌器在37℃下搅拌60分钟。通过滴加1mol/L的NaHCO₃溶液，使样品的pH＝6.0，然后，再加入2.5mL胰酶-胆汁溶液。使用NaOH将pH调节至pH＝7.0，并使用120mol/L的NaCl和5mmol/L的KCl使溶液的体积达到13.4mL，经冷冻干燥后得到红棕色粉末状样品。

(3)在高糖混合培养基(主要含有10％FBS、1％非必需氨基酸、1％抗生素、DMEM基础培养液)中培养Caco-2细胞(60-80代)。将在对数生长期的细胞制成细胞悬液，调节细胞浓度达到6×10⁴个/mL。向24孔板中加入0.5mL细胞悬液，置于培养箱培养，每两天换一次液，每孔培养液0.8mL。培养12天后，加入0.5mL不同浓度经过模拟消化后的AGSP-铁复合物和50μmol/L FeCl₃(氯化铁)的培养液。培养24h后，吸除培养基，用0.5mL 5mmol/L pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液冲洗2～3遍，随后加入10μL缓冲液。每孔加40μLPBS，刮起细胞并转移到离心管中，振荡后置于冰上反应30min，超声破裂细胞。14,000g离心力下将样品离心15min，取上清液，测定总蛋白和铁蛋白含量。

(4)总蛋白含量的测定：应用BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒测定，向96孔板中加入3μL细胞裂解上清液和200μL显色液(A:B＝50:1)，37℃培育60min，用酶标仪于562nm处测定吸光度，计算总蛋白含量。

(5)铁蛋白含量的测定：采用酶联免疫分析法，利用铁蛋白作为抗原与其抗体结合的专一性，再加入四甲基联苯胺呈色后，即可测得铁蛋白含量。吸取10μL不同浓度的标准品或者样品加入到试剂盒预制空板中，并加入200μL的铁蛋白抗体，在室温下180-200r/min振荡培养2h。移除孔里的液体并加入200μL的去离子水清洗，振荡，轻轻倒出水，此过程重复三次，在最后一次清洗时，在纸上倒扣孔板，轻轻拍打孔板顶部30秒以上确保水分全部除尽。向每个孔中加入200μL底物溶液，在室温下培养30min，加入100μL 0.24％的铁氰化钾溶液并混合均匀。以只加200μL底物溶液和100μL的铁氰化钾的孔作为空白，用酶标仪在500nm和625nm下，测定吸光度值。以标准品铁蛋白的浓度为横坐标，A500-A625的差值的对数(log-log)为纵坐标，绘制标准曲线。对照标准曲线即可得到样品中的铁蛋白含量。

(6)以铁蛋白与总蛋白的比值作为铁吸收指标。

图4为实施例1得到的不同浓度的AGSP-铁复合物对Caco-2细胞铁吸收的影响结果示意图。在浓度≥0.005mg/mL时AGSP-铁复合物可以显著促进Caco-2细胞对铁的吸收，随着AGSP-铁复合物浓度的增加，细胞中铁的含量也在升高。

因此，经过上述实施例的验证，本申请实施例1中所提出的脱除酸性多糖中重金属的方法所得到的AGSP-铁复合物产物，能够有效提高Caco-2细胞中铁的含量，起到补铁剂的作用。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

C、所述混合溶液经截留分子量为500～3500Da的分离装置分离，除去所述混合溶液中的酸和/或盐，得到截留液，所述截留液中脱除了重金属；

其中，

所述含有阳离子的化合物为含有铁离子的化合物，控制所述混合溶液的pH为7.5～8.5；或，

所述含有阳离子的化合物为含有氢离子的化合物，所述含有氢离子的化合物溶液的pH为2～6；或，

所述含有阳离子的化合物为含有锌离子的化合物。

2.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述酸性多糖的浓度为0.5～10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述含有铁离子的化合物为氯化铁、硫酸铁铵、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸铁钠中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述含有铁离子的化合物的溶液中，铁离子的浓度为1mol/L～4mol/L。

5.根据权利要求4所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述混合溶液中，所述酸性多糖与所述铁离子的摩尔比为100～1000:1。

6.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述含有氢离子的化合物为盐酸、硫酸或柠檬酸中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，步骤B中，当在所述搅拌过程中产生不溶物后，对搅拌后的混合溶液进行离心，除去所述不溶物。

8.根据权利要求7所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述离心过程的转速为3000～5000r/min，离心时间为10～20min。

9.根据权利要求1所述的脱除酸性多糖中重金属的方法，其特征在于，所述分离装置选用截留分子量为500～3500Da的透析袋或超滤装置。