NO783976L - Fremgangsmaate ved fremstilling av et renset kapsulaert polysaccharid av streptococcus pneumoniae - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av et renset kapsulaert polysaccharid av streptococcus pneumoniaeInfo
- Publication number
- NO783976L NO783976L NO783976A NO783976A NO783976L NO 783976 L NO783976 L NO 783976L NO 783976 A NO783976 A NO 783976A NO 783976 A NO783976 A NO 783976A NO 783976 L NO783976 L NO 783976L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polysaccharide
- hours
- added
- stirring
- isopropanol
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims description 241
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 240
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 240
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title description 13
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 316
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 135
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 52
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 52
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 22
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 18
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 229960000800 cetrimonium bromide Drugs 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 claims description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 232
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 170
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 154
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 116
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 111
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 109
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 107
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 86
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 77
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 73
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 69
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 54
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 53
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 51
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 49
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 44
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 43
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 42
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 42
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 42
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 39
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 39
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 34
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 27
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 27
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 26
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 22
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 21
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 20
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 20
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 19
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 18
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 17
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 16
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 11
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 11
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 8
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 8
- 239000007691 rabbit blood agar Substances 0.000 description 8
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 229960003666 liquefied phenol Drugs 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 229910018626 Al(OH) Inorganic materials 0.000 description 1
- KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N Alophen Chemical compound C1=CC(OC(=O)C)=CC=C1C(C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1 KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- -1 KHCO^ ^ 2C0^ Chemical compound 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 241001233242 Lontra Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- FLEAADSSUQORCN-WIYIBBIWSA-N N-[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1-oxohexan-2-yl]acetamide N-[(3S,4R,5S,6R)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O FLEAADSSUQORCN-WIYIBBIWSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-WCTZXXKLSA-N aldehydo-N-acetyl-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000012254 magnesium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Fremgangsmåte ved fremstilling au et renset kapsulært polysaccharid av Streptococcus pneumoniae
Foreliggende oppfinnelse angår en flerverdig vaksine for bakteriell lungebetennelse. Vaksinen omfatter en rekke kapsulære polysaccharider av forskjellige typer av Streptococcus pneuraoniae. Hvert kapsulært polysaccharid er fremstilt ved å dyrke organismen som produserer det kapsulære polysaccharid under regulerte pH-betingelser og utfylle glucosekonsent rasjonen under fermenteringen. pH opprettholdes ved fra ca. 6,2 til ca. 7,0 ved tilsetning av den nødvendige mengde av et alkalisk reagens som f.eks . NaHC03>-Na2C03, NaOH, KHCO^ ^ 2C0^, KOH, Mg(0H)2, Ca(0H)2eller A1(0H)3- Pufferoppløsninger kan også anvendes for å regulere pH, men er mindre ønskelige på grunn av de relativt store volum av pufferoppløsning som kreves. En lyofilisert kultur anvendes bekvemt som kilden til organismen. Efter fermenteringen erholdes polysaccharidet ved en totrinns alkoholisk felning fulgt av fjernelse av proteiner og nucleinsyrer. I den første alkohol-felning tilsettes en f or ut best eint mengde av vannblandbar alkohol til et flytende materiale inneholdende polysaccharidet for å felle forurensninger mens polysaccharidet holdes i oppløsning. Efter fjernelse av de felte forurensninger tilsettes en annen forutbestemt mengde av en vannblandbar alkohol. Mengden valgt for denne felning er tilstrekkelig til å felle alt eller i det vesentlige alt av det kapsulære polysaccharid uten å felle en vesentlig mengde av annet materiale. Det flytende materiale inneholdende polysaccharidet kan være en fermenteringsvæske i hvilken den ønskede type av Streptococcus pneuraoniae er blitt dyrket. Skjønt en hvilken som helst vannblandbar alkohol kan anvendes ved felningen, anvendes fortrinnsvis en alkohol som har ett eller to ca rbonatomer.
Det felte polysaccharid resuspenderes i flytende medium og behandles for å fjerne proteinholdig materiale og nucleinsyrer. Dette kan gjøres ved å oppslutte det flytende medium inneholdende det kapsulære polysaccharid med et enzym som trypsin eller nucleaser som ribonuclease eller deoxyribonuclease. Alternativt'
kan det flytende materiale inneholdende det kapsulære poly-
saccharid behandles med et kationisk overflateaktivt middel som cet rimoniumbromid (N,N,N-trimethyl-1-hexadecanaminiumbromid). Om nødvendig kan prot einf ra gment er , f.eks. peptider og nucleinsyrefragmenter fjernes ved passende behandling, f.eks. ved dialyse. Det høyt rensede kapsulære saccharid av den ønskede type av Streptococcus pneuraoniae utvinnes så ved felning med en vannblandbar alkohol. Fortrinnsvis anvendes en alkohol med 2 eller 3 carbonatomer.
Mengden av alkohol eller cetrimoniumbromid som kreves i de foregående metoder, bestemmes ved en preliminær undersøkelse.
2 ml porsjoner, så mange som der er fraksjoner som skal under-
søkes, av hele fermenteringsvæsken (eller annen vandig oppløs-
ning) innføres i l6 x 25 mm engangs-kulturglass. Fraksjonene som skal undersøkes, taes vanligvis ved 5% intervaller over et område 10-15% som overspenner den ventede felningskonsentrasjon som tidligere er funnet for en spesiell type. Hvis f.eks. det ventede intervall er 40-45%, bør de følgende fraksjoner under-
søkes: 0-35%, 30-35%, 35-40%, 4o-45%, 45-50% og 5o-55%.
Under omrøring med en reagensglassrører tilsettes alkohol
til det lavere nivå av hvert område. Røring er nødvendig for å
unngå lokal overkonsentrasjon som vil føre til for tidlig felning. Alle reagensglass sentrifugeres på en arbeidsbenk-klinisk sentrifuge (7-10.000 r/min) i 10 minutter.
Den overstående væske fradekanteres i 16 x 125 ml reagensglass, og alkohol tilsettes, igjen under omrøring, inntil den øvre grense for hver fraksjon. Alle pellets unntatt den første
(som representerer materiale i O-lavgrensen av området)
kastes .
Rørene sentrifugeres igjen i 10 minutter, og den overstående væske kastes. Pelletene i hvert reagensglass representerer nu materiale felt i de individuelle alkoholfraks joner. Hver
pellet dispergeres (polysaccharideekstraheres) i 2 ml
"Dulbecco's PBS" (lx). Den dannede suspensjon klares for uopp-løselig materiale med et "Swinnex-25" filter ("Millipore")
anbrakt på en engangssprøyte. En del av filtratet fra hver fraksjon fortynnes 1:2 og 1:4 med "PBS". Fraksjonene er nu ferdige for undersøkelse.
Antiserura som tilført, fortynnes først 1:10 med "PBS" (lx),
og en porsjon (ca. 1,2 ml) av dette fortynnes ytterligere 1:6,7; tilstrekkelig til å bedømme alle fraksjoner i en spesiell under-søkelse. I alminnelighet greier disse fortynninger seg. Av og til har imidlertid et parti antiserura vist seg å være mindre "sterkt", og mere konsentrerte fortynninger må fremstilles. Dette kan ikke forutsies før erfaring med et spesielt parti er oppnådd.
0,2 ml fortynnet antiserum innføres i en rekke 10 x 75 ml engangs-kulturglass, tre for hvert fraksjonsintervall.
I hvert reagensglass inneholdende antiserum innføres 10 [ il
(for ethanolundersøkelser) av fraksjonene som skal sammenslåes ved de tre konsentrasjoner (ufortynnet, 1:2, 1:4)» 5 M-l anvendes for isopropanolundersøkelser. Reagensglassene omrøres og hensettes i 15 minutter til 1 time. For bekvemhets skyld arrangeres de vanligvis i følgende nettverk.
En positiv felningsreaksjon indikeres av en tydelig blakk-het eller en virkelig felning. Det ønskede polysaccharid kan spaltes over to nabo-fraksjoner , eller over tre fraksjoner hvor den midtre gir en tydeligere precipitinreaksjon. Begge disse er positive prøver, og prosessalkohol- eller cetavlon-fraksjonerings-område velges på basis av disse resultater.
'Det er en optimal konsentrasjon for precipitinreaksjonen,
og dette er grunnen til de tre forskjellige fortynninger. Et overskudd av antilegeme kan føre til ingen felning, mens et antigenoverskudd ofte indikerer positive resultater over et stort område, noen ganger med en svak reaksjon mellom to sterkere. I dette tilfelle er den svake reaksjon i virkeligheten den sterkst positive, og dette kan sees i det mere fortynnede (i antigen)
sy st em .
Alle Streptococcus pneuraoniae typebetegnelser anvendt her, er US typebetegnelser i motsetning til danske typebetegnelser . ATCC samlingsnumre for de forskjellige typer er som følger:
En vaksine kan fremstilles ved å inkorporere et renset kapsulært polysaccharid i et passende fysiologisk godtagbart
medium som f.eks. saltlake, vann for injeksjon eller fosfatpufret saltlake. Flerverdige vaksiner kan fremstilles ved å inkorporere to eller flere av de rensede kapsulære polysaccharider i et passende fysiologisk godtagbart medium.
En detaljert beskrivelse av fermenteringsfremgangsraåten for å danne pneuraococcisk polysaccharid følger.
En lyofilisert "L"-rørkultur suspenderes i 1 ml "Difco
Heart Infusion Broth" (HIB-buljong) , og 0,2 ml sprees på en kaninblod-agarplate (HIB). Efter ca. 18 timers inkubering ved 37"c resuspenderes veksten pa platen i 5 ml HIB-buljong, og 1 ml av suspensjonen overføres i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkuberes som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering undersøkes kulturen mikroskopisk og strekes på YED-
og HIB-plater for å kontrollere renheten. Den 100 ml kultur lagres i kjøleskap ved 4°C i maksimalt 1 uke.
20 ml av den foregående kultur anvendes til å inokulere
1 liter inokulummedium i en 2~litersErlenmeyerkolbe med sidearm for tilsetning av natriumbicarbonat. Kolben inkuberes stasjonært ved 37°C inntil spesifikasjonene for den spesielle type er til-fredsstilt. Fermenteringens pH reguleres (6,2-7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat under anvendelse av fenol-
rødt i mediet som indikator. En sluttprøve undersøkes mikroskopisk, og en agglutineringsprøve utføres for å kontrollere renhet og type. Hvis den erholdte kultur ikke anvendes straks,
kan den lagres i 3_4 timer ved 4°C. Det foretrekkes imidlertid å anvende kulturen straks i det følgende trinn.
1 liter fra det foregående trinn anvendes for å inokulere
en l4-liters fermentator inneholdende 9 1 kimraedium. Satsen inokuleres ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luft-
strøm. Forløpet av fermenteringen følges ved o.d.-, pH- og glucose-bestemmelser. Når en spesifikk od er nådd, undersøkes satsen mikroskopisk, og en agglutineringsreaksjon utføres, og en prøve påført på YED- og HIB-plater undersøkes på renhet. pH innstilles under fermentering (6,2-7,0) under anvendelse av 10%-ig natriumhydroxyd. Om ønskes, kan en del av denne kultur anvendes for å inokulere en større fermentator under anvendelse av den foregående fremgangsmåte.
Når satsen er avsluttet , påføres kulturen på YED- og HIB-plater, undersøkes på renhet ved Grams farvning, og identifiseres med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Fermenteringsvæsken inaktiveres så ved høstning i forvæsket fenol (89%) til en sluttkonsentrasjon på 1%. Efter 2 timer i fenol frigjøres fermenteringsvæsken for å utvinne produktet. En prøve taes og påføres på HIB for å kontrollere på levedyktighet.
De følgende kulturmedier anvendes i fermenteringspros-essene .
1. YED- plater
Gjærekst rakt 10 g/l
Dextrose 10 g/l
Agar 20 g/l
2. HIB- buljong
"Heart Infusion Broth" 25 g/l
3. Agar- kaninblod- me dium ( HIB)
"Heart Infusion Broth" 25 g/l
Agar 20 g/l
Det ovenstående autoklavbehandles i 20 minutter og avkjøles til 50°C, og 10% defibrinert kaninblod tilsettes.
4. Ka ninblodvæskemedium
Samme som ovenfor unntatt at agar er sløyfet.
5. Inokulummedium - 2 liter "Hysoy" - Humko Sheffield 20 g
"Amberex 1003" 10 g
NaCl 5 g
k2h<p>o^2,5 g
Fenol-rødt 10 g
Destillert H20 til 900 ml
pH innstilles på 7>2, og mediet autoklavbehandles i 25 minutter ved 121°C.
Glucose 25 g
Glucosen autoklavbehandles for seg i 100 ml destillert H20 i 20 minutter og tilsettes aseptisk til ovenstående bestanddeler.
6. 14 liter kimmedium for type 20 og produksjonsmedium for alle andre typer
"Hysoy" - Humko Sheffield 180 g
"Amberex 1003" 90 g
NaCl 45 g K„HP0, '22,5 g
2 4
Fenol-rødt 90 rag
"UCON LB 625" 8% oppløsning
(forsterilisert i 1 time) 40 ml
Destillert H20 til 8 liter
pH innstilles på 7,2 før sterilisering. Ovenstående bestanddeler autoklavbehandles sammen i 90 minutter ved 121°C.
Glucose 225 Q
Destillert vann til 1 1 liter
Glucosen autoklavbehandles for seg i 25 minutter ved 121°C og tilsettes aseptisk til ovenstående bestanddeler.
7- Makroskopisk prepa rat glass- agglut ineringsident if ika sjonsprøve a. En løkkefull av spesifikt Pneumococcus antiserum
(spesifikk type) anbringes på et preparat glass.
b. En løkkefull av Streptococcus pneuraoniae (spesifikk type)
fra satsen overføres til dråpen av antiserum og blandes.
c. En positiv prøve fåes hvis en agglutinering av cellene inntrer med spesifikt antiserura.
8. Fremgangs måte for å påvise levedyktighet
En 0,5 ml prøve av buljongen som skal kontrolleres på levedyktige organismer, sprees på "Heart Infusion Blood" agar. Platene inkuberes ved 37°C i 48 timer. Ingen synlige tegn på vekst efter 48 timer representerer negativ levedyktighet.
Pneumococcisk polysaccharid type 19 angies i litteraturen
å bestå av L-rharanose, D-glucose, 2-acetamido-2-deoxy-D-mannose og fosfat i tilnærmet molart forhold på 2:1:1:1 (Miyazaki et al., Carbohydrate Research, Vol. l6, s. 153-159, 1971). Basert på denne publikasjon er den teoretiske mengde L-rhamnose i type 19 43%, og den teoretiske mengde D-glucose er 21,9%- Type 19 saccharidprodukt erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse inneholder imidlertid ca.. 15-20 vekt% L-rhamnose og ca.
5,5-8 vekt% D-glucose. Den har også vist seg å inneholde ca.
8-11 vekt% 2-acetamido-2-deoxy-D-mannose (N-acetyl-mannosamin).
Pneumococcisk polysaccharid type 23 er angitt i litteraturen å bestå av rharanose, glucose og galactose i molarforhold 5:2:2 (Heidelberger et al., Journal of Immunology, Vol. 99,
s. 794-796, 1967). Basert på disse forhold er den teoretiske mengde L-rhamnose 59,5%. Larm et al., i Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Tipson & Horton, redaktører,
Acadeinic Press, 1967, s. 314, angir at pneumococcisk polysaccharid type 23 inneholder 35% L-rhamnose, 31% D-galactose og 32% D-glucose. Type 23 polysaccharidprodukt erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse inneholder imidlertid rhamnose, galactose og glucose i mola rforholdet 2:1:1, og inneholder ca. 31_38 vekt% L-rhamnose, ca. 15-18 vekt% D-galactose og ca. 15-18 vekt%
D-glucose.
Pneumococcisk polysaccharid type 25 angies å inneholde galacturonsyre som dens uronsyre (Heidelberger, Immunochemistry of Bacterial Polysaccharides, i Research in Immunochemistry and Immunobiology, Vol. 3, s. 1-40, Kwapinski & Day, redaktører, University Park Press, Baltimore, 1973)• Type 25 polysaccharidprodukt erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse inneholder ca. 2-4 vekt% fucose, ca. 2-4 vekt% mannose, ca.
15-19 vekt% galactose, ca. 1,8~4vekt% D-glucose, ca. 7~9vekt% galactosamin, ca. 15-19 vekt% glucosamin og ca. 5~7vekt% uronsyre .
Pneumococcisk polysaccharid type 72 produkt erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse innbeholder ca. 5,5~8vekt% rhamnose, ca. 3-6,5 vekt% fucose, ca. 2,7~4,8 vekt% mannose,
ca. 17-22 vekt% D-galactose, ca. 11,5-16,5 vekt% galactosamin og ca. 27-32 vekt% glucosamin.
Pneumococcisk polysaccharid type 73 produkt erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse, inneholder ca. 1,8-3,5 vekt% fucose, ca. 2-5 vekt% mannose, ca. l4~19 vekt% D-galactose,
ca. 12-15 vekt% galactosamin og ca. 29~34vekt% glucosamin.
De ovenstående carbohydratanalyser for typene 19, 23, 25, 72 og 73 polysaccharidprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse er bestemt ved gasskromatografi.
De følgende eksempler belyser foreliggende oppfinnelse ytterligere', men begrenser den derimot ikke.
Eksempel 1
Pneumococcisk polysaccharid type 1
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 1 dyrkes på blodagar i l6 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ral prøve av blodbuljongveksten anvendes for å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers mellomrom for å nøytralisere mediet. En l4-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av den 2-liters kolbe og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers mellomrom for å nøy-tralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenolbehandlede hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra 38 til 52%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 3>68 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenolbehandlede hele buljong, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 2,82 1 ethanol langsomt til den overstående væske, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge for å få en klar overstående væske som kastes. Det urene polysaccharidfaststoff suspenderes i 0,09 1 3%_ig natriumacetatoppløsning. pH innstilles på 6,5 med iseddik og omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme optimalt isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra 20 til 30%.
Under, omrøring tilsettes 22,5 ml isopropanol langsomt, og den dannede oppløsning eldes i 4 timer under kontinuerlig omrør-ing. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullføres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere l6 ml isopropanol til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfal1 utvinnes ved sentrifugering ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Det urene polysaccharid suspenderes i 90 ml 3%-ig natriumacetat. pH innstilles på 6,5 med iseddik og 65 mg MgSO,, 2,7 mg ribonuclease og 2,7 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløs-ningen oppsluttes under omrøring ved 37°C i 3 timer og avkjøles til 0-5°C.
En cetrimoniumbromidundersøkelse utføres på en prøve av væsken for å bestemme det optimale cetavlonområde for poly-saccharidf eining . Med denne sats er området fra 33-52%. Under omrøring tilsettes 59 ml av en 1%-ig vandig cetrimoniurabromid-oppløsning , og den erholdte blanding eldes i 4 timer. Blandingen klares i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes, og ytterligere 96,3 ml 1%-ig vandig cetrimonium-bromidoppløsning tilsettes til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfall fjernes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Bunnfallet oppløses i 90 ml av en 20%-ig natriumacetat-oppløsning, og pH innstilles på 6,5 med iseddik. 90 ml isopropanol tilsettes under omrøring, blandingen omrøres i 2 timer og får lov til å bunnfelles i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres ved ca. 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 0,35 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 2
Pneumococcisk polysaccharid type 2
En kultur av Streptococcus pneumonia type 2 dyrkes på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml prøve av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet fra den 2-liters kolbe og dyrkes i l6 timer ved 37°C
under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenol-
iserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for dette parti er fra 40 til 55%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 4>0 liter ethanol langsomt til 6 liter av den fenoliserte hele buljong, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 3,33 liter ethanol langsomt til den overstående væske, og den erholdte blanding
eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge uten felning av noen vesentlig mengde annet materiale. Det flytende materiale inneholdende polysaccharidet kan være en fermenteringsbuljong hvori den ønskede type av Streptococcus pneuraoniae er blitt dyrket. Skjønt en hvilken som helst vannblandbar alkohol kan anvendes ved felningen, bør alkoholen fortrinnsvis ha ett eller to carbonatomer.
Det felte polysaccharid resuspenderes i flytende medium og behandles for å fjerne proteinholdig materiale og nucleinsyrer.
Dette kan utføres ved å oppslutte det flytende medium inneholdende det kapsulære polysaccharid med et enzym som trypsin eller nucleaser som ribonuclease eller deoxyribonuclease. Alternativt kan det flytende materiale inneholdende det kapsulære polysaccharid behandles med et kationisk overflateaktivt middel som cetrimoniumbromid (N,N,N-trimethyl-l-hexadecanaminiumbromid). Om nødvendig,
kan proteinfragmenter, f.eks. peptider og nucleinsyrefragmenter, fjernes ved passende behandling, f.eks. ved dialyse. Det høyt-rensede kapsulære saccharid av den ønskede type av Strepto coccus pneuraoniae utvinnes så ved felning med en vannblandbar alkohol-Fortrinnsvis har alkoholen 2 eller 3 carbonatomer.
Mengden av alkohol eller cetrimoniumbromid som er nødvendig
for de foregående prosesser, bestemmes ved en preliminær under-søkelse. 2 ml porsjoner, så mange som der er fraksjoner som skal undersøkes, av hel buljong (eller annen vandig oppløsning) inn-
føres i 16 x 25 cm engangs-kulturglass. Fraksjonene som skal undersøkes, taes vanligvis med 5% intervaller over et område 10-15% som spenner over den ventede felningskonsentrasjon funnet tidligere på en sentrifuge for å gi en klar overstående væske som kastes. De urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 0,6 liter 1%-ig natriumacetatoppløsning, og blandingen omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes.
Den overstående væskes pH innstilles på 8,0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 12 mg trypsin tilsettes, og oppløsningen oppsluttes ved 37°C i 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C,
og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den oppsluttede oppløsning avkjøles til 0-5°C, og 7,2 g cetrimoniumbromid tilsettes. Cetrimoniumbromidoppløsningen eldes i 4 timer ved 0-5°C og sentrifugeres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.OOO-3O.OOO r/min. Faststoffene kastes.
120 g natriumacetat tilsettes til væsken fulgt av 0,6 1 ethanol. Blandingen omrøres i 2 timer, og bunnfallet 'fjernes ved sentrifugering i en 10 cm Sharples sentrifuge ved 15-OOO r/min. Bunnfallet tritureres med 10-20 ml 66% ethanol/vann og utvinnes
ved filtrering på en nutsch.
Det urene polysaccharid suspenderes i 300 ml 3%-ig natrium-acetatoppløsning, og pH innstilles på 6,5 med iseddik, og bland ingen omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av væsken
for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Med denne sats er området fra 28~42 volum%. Under omrøring tilsettes 117 ml isopropanol, og den dannede blanding eldes i 4 timer. Blandingen forklares i en 10 cm Sharples sentrifuge ved 15-000 r/min. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes, og ytterligere lOO ml isopropanol tilsettes til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfal1 utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Wnatman nr. 2 papir) under vasking med 2x5 ml absolutt ethanol og 2x5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 4,6 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 3
Pneumococcisk polysaccharid type 3
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 3 dyrkes i blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml prøve av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekst rakt-meringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium inokuleres med innholdet fra 2-liters kolben og dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats er fra 28 til 45%-
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 2,33 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 2,58 1 ethanol lang-
somt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så
ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 1,8 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH innstilles på 6,5 med iseddik og omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme optimalt isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra 18 til 30 volum%.
Under omrøring tilsettes 0,395 1 isopropanol langsomt, og
den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,376 1 isopropanol langsomt til den overstå-
ende væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under om-røring. Det urene polysaccharid-bunnfa 11 utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høy-skjær-blander i 1,0 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH innstilles igjen på 7,0 med iseddik, og 60 mg MgCl^, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig nat riumhydroxyd, 18 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen
fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen
avkjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
• Den oppsluttede oppløsning diafiltreres i en "Romicon
hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske led-
ningsevne av perrneatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte,
som inneholder polysaccharidet, trekkes ut av systemet, og volumet gjenopprettes til 1,0 1 med systemvasker. 30 g natriumacetat tilsettes til oppløsningen av den polysaccharidholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik. Under omrøring tilsettes 2,0 1 isopropanol, og den erholdte blanding omrøres i 15 minutter og får lov til å bunnfelles i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske f radekanteres, og bunnfallet, tritureres 1 en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et/hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperåtur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 2,76 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 4
Pneumococcisk polysaccharid type 4
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 4 dyrkes på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml prøve av blodbuljongveksten anvendes for å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmediura. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av 2-liters kolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats er fra 68 til 80 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 12,75 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 11,25 1 ethanol lang-
somt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så
ved .15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og det urene polysaccharid-faststoff suspenderes i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-
blander . pH innstilles på 6,5 med iseddik og omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme optimalt isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra 42 til 55 volum%.
Under omrøring tilsettes 0,434 1 isopropanol langsomt, og
den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ult ra sentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,3 1 isopropanol langsomt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring.
Det'urene polysaccharidbunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske ka st es.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høy-skjær-blander i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH gjeninnstilles på 7,0 med iseddik og 60 mg MgCl2, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 18 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen av-
kjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den opps.luttede oppløsning diafiltreres i en "Romicon
hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte,
som inneholder polysaccharidet, avtømmes fra systemet, og volumet gjenopprettes til 0,3 1 med systemvasker. 9 g natriumacetat tilsettes til oppløsningen av den poly-saccha ridholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Under omrøring tilsettes 2,0 1 isopropanol, og den dannede bland-
ing omrøres i 15 minutter og fårbunnfelle i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er fraskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt
pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) fulgt av vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 656 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 1,32 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 5
Pneumococcisk polysaccharid type 6
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 6 dyrkes på
blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av den 2-liters kolbe og dyrkes i 16 timer ved 37°C
under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfeining . Området for denne sats var fra 47 til 60 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 5,32 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 3,68 1 ethanol langsomt til den overstående u.æske, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående, væske kastes, og de urene polysaccharid-faststoffer suspenderes'
i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH innstilles på 6,5 med iseddik og omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den poly-saccha ridholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 35 til 47 volum%.
Under omrøring tilsettes 0,323 1 isopropanol langsomt, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.OOO-3O.OOO r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,21 1 isopropanol langsomt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-bunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en .10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kast es.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høyskjær-blander i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH innstilles igjen på 7,0 med iseddik og 60 mg MgCl^, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under om-røring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 18 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den oppsluttede oppløsning diafiltreres i en "Romicon hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte,
som inneholder polysaccharidet, avtappes fra systemet, og volumet gjeninnstilles på 0,3 1 med systemvasker.
9 g nat riumacetat tilsettes til oppløsningen av den poly-saccha ridholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik. Under omrøring tilsettes 0,6 1 isopropanol, og den erholdte blanding omrøres i 15 minutter og får avsette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt^ ethanol inntil et hvitt
pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 4,08 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 6
Pneumococcisk polysaccharid type 8
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 8 dyrkes på blodagar i l6 timer ved 37°C. Cellene oppsamles, og anbringes i 250 ml blodbuljong i l6 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av 2-liters kolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for denne sats er fra 23 til 35 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 1,79 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 1,44 T ethanol lang-
somt til den overstående væske, og den dannede blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring.Blandingen sentrifugeres så
ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 0,3 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH innstilles på 6,5 med iseddik, og blandingen om-
røres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes.
pH av den overstående væske innstilles på 7, 0 med iseddik, og 60 mg MgCl2>0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8>0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 12 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den oppsluttede oppløsning diafiltreres på en "Romicon hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte som inneholder polysaccharidet, avtappes fra systemet, og volumet gjeninnstilles på 1,0 1 med systemvasker.
Den polysaccharidholdige væskes pH innstilles på 6,5 med iseddik, og en isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av væsken for å bestemme det optimale isopropanolområde for poly-saccharidf eining. Med denne sats er området fra 32-47%. Under omrøring tilsettes 0,l4l 1 isopropanol, og den dannede blanding eldes i 4 timer. Blandingen forklares i en 10 cm Sharples sentrifuge ved 15.000 r/min. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes og ytterligere 0,125 1 isopropanol tilsettes til den overstående væske, og blandingen eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Ved hjelp av en høyskjær-blander suspenderes det urene polysaccharid i 0,3 1 natriumacetatoppløsning, og pH innstilles på 6,5 med iseddik. 0,6 1 isopropanol tilsettes under omrøring, og blandingen omrøres i 2 timer og får lov til å avsette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en 'Waring blender ved ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch
(Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml' aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 0,72 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 7
Pneumococcisk pol ysaccharid type 9
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 9 dyrkes på
blodagar i l6 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i l6 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av 2-liters kolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats var fra 45 til 6o volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 4>91
ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
C Under omrøring tilsettes ytterligere 4,1 1 ethanol langsomt
til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander . pH innstilles på 6,5 med iseddik, og der omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det' optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra
32 til 47 volura%.
Under omrøring tilsettes 0,282 1 isopropanol, og den
erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullstendiggjøres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,25 1 isopropanol til den overstående væske,
og den erholdte blanding får lov til å eldes i 4 timer under om-røring. Det urene polysaccharidbunnfal1 utvinnes ved sentri-f ugering ved 15-OOO r/min i en 10 cm Sharples sent rif uge, og den overstående væske kastes.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høyskjær-blander i 0,6 1 0,9%-ig natriumklorid. pH innstilles på 8>0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 12 mg trypsin tilsettes, og oppløsningen oppsluttes ved 37°C i 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Oppløsningen avkjøles til 0-5°C, 285 g ammoniurasulfat tilsettes, og blandingen eldes ved 0-5°C i 4 timer. Bunnfallet som dannes, oppsamles ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes.
Bunnfallet oppløses i 0,3 1 pyrogenfritt vann, og oppløsn-ingen diafiltrerés i en "Romicon hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholder polysaccharidet, avtappes fra systemet, og volumet gjenopprettes til 0,3 1 med systemvasker. 9 g natriumacetat tilsettes til oppløsningen av den polysaccharidholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Under omrøring tilsettes 0,6 1 isopropanol, og den erholdte
blanding omrøres i 2 timer og får lov til å avsette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg
og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 1,68 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 8
Pneumococcisk polysaccharid type 10
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 10 mottatt fra American Type Culture Collection (ATCC nr. 63IO), og oppbevart
som en lyofilisert kultur, suspenderes i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong) og 0,2 ml sprees på en kaninblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C resuspenderes veksten på platen i 5 ml HIB-buljong,og 1 ml av suspensjonen overføres i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkuberes som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering under-søkes kulturen mikroskopisk og strekes på YED-og HIB-plater for å kontrollere renheten. De 100 ml kultur ble lagret i et kjøle-
skap ved 4°C. 10 ml av kulturen av den inkuberte buljong ble anvendt til å inokulere 1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert stasjonært i 18,5 timer ved 37°C. Fermenteringens pH ble kontrollert (6,4-7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d (optisk densitet) på
2,2 var nådd. Den 1-liters fermentering krever 80 ml natriumbicarbonat til å nå ovennevnte o.d. Før inokulering i det neste trinn påføres en prøve på YED-og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve ble også undersøkt mikroskopisk, og en agglutineringsprøve ble utført.
1 liter av fermenteringsbuljongen fra det foregående trinn
ble anvendt til å inokulere en l4~liters fermentator inneholdende
9 1 produktjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luftstrøm. Forløpet av fermenteringen ble fulgt ved bestemmelse av o.d., pH og glucose.
Efter den siste natriumhydroxydtilsetning ble fermenter-
ingen fortsatt i ytterligere 1 time og ble derpå avsluttet (totaltid 9 timer). Den endelige o.d. før høsting var 4,24-
pH ble regulert under fermentering (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-ig nat r iumhydroxyd. Tilsamrnen 725 ml 10%-ig NaOH ble anvendt. Efter at satsen var avsluttet, ble kulturen påført på YED-og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning og identifisert
med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen ble 1 n^Vf n trort WD/^ ri rA o + -i r-\ r~\ ^^th - y- m-* Irr^- h - f q t-» ^ 1 / Q dOZ\ +- -i 1 o r-» c 1 11 + + Vnn -
sent rasjon av 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for å utvinne produktet. En prøve ble tatt og påført på HIB-
plate for å kontrollere levedyktigheten.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for denne sats var fra 48 til 66 volum%. 95%-ig denaturert ethanol ble tilsatt til 10 1 av buljongen med en hastighet på 100 ml/min under konstant omrøring inntil ethanolkonsentrasjonen var 48 volum%. Buljongen ble så klaret ved sentrifugering ved 30.000 r/min i en Sharples sentrifuge,
modell T-l-P.
For å klare avløpet ble ethanol tilsatt til 66 volum% beregnet på det opprinnelige vandige system. Bunnfallet ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert og ved å sentrifugere den gjenværende overstående væske pluss urent polysaccharid i en "Sorvall RC5" ved 6.000 r/min (6.089 xg) i 20 minutter ved 15°C.
Pelletene ble resuspendert i 1.000 ml 3%-ig natriumacetat
ved hjelp av en Waring blender ved lav hastighet. pH ble innstilt på 6,5.
Isopropanolundersøkelse viste at polysaccharidet feltes
mellom 38 og 47 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol ble derfor tilsatt dråpevis under omrøring på en "thermolyne" røreplate, midtre innstilling, til en konsentrasjon på 38 volum%. Suspensjonen ble så klaret ved sentrifugering i en "Beckman J21" ved 14-000 r/min (30.050 xg) ved 15°C i 20 minutter. Den klare overstående væske ble fortynnet med isopropanol til en sluttkonsentrasjon på 47 volum%. Dette førte til utskillelse av et bunnfall som ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske (gul, brun farve) med en hevert.
Det felte polysaccharid resuspenderes i 1.000 ml vann og pH innstilles på 7,0 med konsentrert eddiksyre. 203 mg MgCl2
(1 mM), 8 mg deoxyribonuclease og 8 mg ribonuclease ble tilsatt
under omrøring. Suspensjonen inkuberes i roterende vannbad i 90 minutter ved 37°C- Efter inkubering ble pH innstilt på 8,0
med 1.. N natriumhydroxyd, og 49 mg trypsin ble tilsatt. Oppslutningen ble inkubert som ovenfor.
pH ble innstilt på 7,0, og oppslutningen ble overført i et 29 mm dialyserør og dialysert mot 14 1 vann med ett bytte av vann. Dialyseproduktet, 1080 ml, ble utvunnet og brakt til 3%-ig natriumacetat. Isopropanolundersøkelse indikerer at det rensede polysaccharid felles mellom 40 og 52 volura% isopropanol ved værelsetemperatur. Felningen ble utført som i den tidligere isopropanolfeining. Polysaccharidet som hefter til bunnen av glassbegeret, ble oppsamlet ved å fjerne den endelige overstående væske med en hevert. Det ble triturert i en Waring blender ved høy hastighet med 500 ml absolutt ethanol og ble helt i en middels sintret glasstrakt. Polysaccharidet ble vasket med 500 ml ethanol fulgt av 250 ml aceton. Overskudd av oppløsningsmiddel ble fjernet ved sug, og polysaccharidet tørret i vakuum over calciumsulfat. Utbyttet var 7,9 g pneumococcisk polysaccharid type 10 .
Eksempel 9
Pn eumococcis k polysaccharid type 12
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 12 ble dyrket på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene ble oppsamlet og anbrakt i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten ble anvendt til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen ble dyrket i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium ble inokulert med innholdet av den 2-liters kolbe og dyrket i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller, for å nøytralisere mediet. Fenol ble så tilsatt til mediet til 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for denne sats var fra 4-2 til 58 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur ble 4,35 1 ethanol langsomt tilsatt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den dannede blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene ble kastet.
Under omrøring ble ytterligere 3,94 1 ethanol langsomt til-
. satt til den overstående væske, og den dannede blanding ble
eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge.
Den overstående væske ble kastet, og de urene polysaccharid-faststoffer ble suspendert i 0,3 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH ble innstilt på 6,5 med iseddik og omrørt i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet .
En isopropanolundersøkelse ble utført på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 32 til 47 volum%.
Under omrøring ble 0,l4l 1 isopropanol tilsatt, og den
dannede blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble forklaret ved 15-000 r/min i en> 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen ble fullstendiggjort i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene ble kastet. Under omrøring ble ytterligere 0,125 1 isopropanol tilsatt til den overstående væske, og den dannede blanding fikk lov til å eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-bunnfall ble utvunnet ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske ble kastet.
Ved hjelp av en høyskjær-blander ble det urene polysaccharid suspendert i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH ble gjeninn-stilt på 7,0 med iseddik og 60 mg MgCl2, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease ble tilsatt. Oppløsningen ble oppsluttet ved 37°C i 6o minutter. pH ble innstilt på 8,0 med 50%-ig natriumhydroxyd, 12 mg trypsin ble tilsatt, og oppslutningen ble fortsatt ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen ble av-kjølt til 20-25°C, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik!
Oppløsningen ble avkjølt til 0-5°C, 1449ammoniumsulfat
ble tilsatt, og blandingen ble eldet ved 0-5°C i 4 timer. Bunnfallet som ble dannet, ble oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske ble kastet.
Bunnfallet ble oppløst i 0,3 1 pyrogenfritt 'vann, og oppløs-
ningen ble diafiltrert i en "Romicon hollow filter ultra-
filtration membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet nådde en konstant verdi. Reservoaret ble holdt ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholdt polysaccharidet, ble avtappet fra systemet, og volumet ble igjen brakt til 0,3 1 med systemvasker. 9 g natriumacetat ble tilsatt til oppløsningen av den polysaccharidholdige væske, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
Under omrøring ble 0,6 1 isopropanol tilsatt, og den erholdte blanding ble omrørt i 2 timer og fikk avsette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall var utskilt på bunnen. Hele den overstående væske ble fradekantert, og bunnfallet ble triturert i en Waring blender med ca. /fO ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver ble erholdt. Pulveret ble utvunnet ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver ble så tørret ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man fikk ca. 1,2 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 10
Penumococcisk polysaccharid type 14
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 14 ble dyrket på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene ble oppsamlet og anbrakt i 250 ml blodbuljong i l6'timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten ble anvendt til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-nær ingsmedium. Kulturen ble dyrket i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En 14-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium ble inokulert med innholdet av 2-liters kolben og dyrket i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat med 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol ble så tilsatt til mediet til en 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccha ridf eining . Området for denne sats var fra 38 til 53 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur ble 3>71 ethanol langsomt tilsatt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den dannede blanding ble eldet i 4 timer under fortsatt omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene ble kastet.
Under omrøring ble ytterligere 3,1 1 ethanol langsomt til-
satt til den overstående væske, og den dannede blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge.
Den overstående væske ble kastet, og de rå polysaccharid-fast - stoffer ble suspendert i 0,5 1 pyrogenfritt vann og omrørt i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet. 12 1 av en 5%-ig natriumacetatoppløsning ble tilsatt, og pH ble innstilt på
6,5 med iseddik.
En isopropanolundersøkelse ble utført på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 30 til 42 volum%.
Under omrøring ble 0,25 1 isopropanol tilsatt, og den
dannede blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble forklaret ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen ble fullstendiggjort i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene ble kastet. Under omrøring ble ytterligere 0,18 1 isopropanol tilsatt til den overstående væske fra ultrasentrifugen, og den erholdte blanding fikk lov til å eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-bunnfall ble utvunnet ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sent rif uge, og den overstående væske ble kastet.
Bunnfallet ble oppløst i 0,3 1 pyrogenfritt vann, og oppløs-ningen ble diafiltrert i en "Romicon hollow filter ultrafilt rat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet nådde en konstant verdi. Reservoaret ble holdt ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholdt polysaccharidet, ble avtappet fra systemet og volumet igjen brakt til 0,3 1 med systemvasker. Oppløsningen ble klaret i en K-2 ultra - sentrifuge ved 20.000-25-000 r/min.
Den klarede oppløsning ble avkjølt til 0-5°C. 30 ml av en oppløsning av 6,6 g cetavalon i pyrogenfritt vann ble tilsatt, hvorved man fikk en sluttkonsentras jon på 2%. Blandingen ble eldet i 4 timer ved 0,5°C og klaret i K-2 ultrasentrifugen ved 20.000-25-000 r/min. 66 g natriumacetat ble tilsatt til den overstående væske, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
En isopropanolundersøkelse ble utført på en prøve av suspensjonen for å bestemme det optimale isopropanolområde for poly-saccha ridf eining . Med denne sats var området fra 29 til 40 volum%. Under omrøring ble 0,14 1 isopropanol tilsatt, og den dannede blanding ble eldet i 4 timer. Blandingen ble forklaret i en 10 cm Sharples sentrifuge ved 15-000 r/min. Klaringen ble fullstendiggjort i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene ble kastet, og ytterligere 0,085 1 isopropanol ble innført i den overstående væske fra K-2 ultrasentrifugen, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-bunnfall ble utvunnet ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske ble kastet.
Bunnfallet ble triturert i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver ble erholdt. Pulveret ble utvunnet ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir)
under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton.
Det vaskede pulver ble så tørret ved 686 mm Hg og værelsetempera-
tur i 12-16 timer, hvorved man fikk 1,1 g av det rensede polysaccharid .
Eksempel 11
Pneumococcisk polysaccharid type 15
En lyofilisert kultur av Streptococcus pneuraoniae type 15
ble suspendert i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong)
og 0,2 ml ble spredd på en kaninblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C ble veksten på platen suspendert i 5 ral HIB-bul jong, og 1 ml av suspensjonen ble overført i 100 ml kaninblod-væskemedium og dyrket som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering ble kulturen undersøkt mikroskopisk og streket
på YED-og HIB-plater for å kontrollere renheten. 100 ml av kulturen ble lagret i kjøleskap ved 4°C.
10 ml av kulturen av den inkuberte buljong ble anvendt til
å inokulere 1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert stasjonært i 19 timer ved 37°C. pH av fer-
menteringen ble regulert (6,4-7)0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d. på 2,9 var nådd. Den 1-liters fermentering krevet 100 ml natriumbicarbonat for å nå den ovennevnte o.d. Før inokulering av det neste trinn ble en prøve anbrakt på YED-og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve ble også undersøkt mikroskopisk, og en agglutineringsprøve ble utført for å kontrollere renheten og typen.
1 liter av ferment eringsbuljongen fra det foregående trinn
ble anvendt til å inokulere en l4~liters fermentator inneholdende
9 1 produksjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luftstrøm. Forløpet av fermenteringen ble overvåket ved o.d.-, pH- og glucose-bestemmelser.
Efter den siste natriumhydroxydtilsetning ble fermenteringen fortsatt i ytterligere 1 time og derpå avsluttet (totaltid 8 timer). Den endelige o.d. før høsting var 4>0. pH ble regulert under fermenteringen (6,2-7>0) ved å anvende 10%-ig natriumhydroxyd. Tilsammen 720 ml 10%-ig natriumhydroxyd ble anvendt.
Efter at satsen var avsluttet, ble kulturen platet på YED-
og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning og identifisert med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Bul-
jongen ble inaktivert ved høsting i forvæsket fenol (89%) til en sluttkonsentrasjon på 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for utvinning av produktet. En prøve ble tatt og platet på HIB for å kontrollere levedyktigheten.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for denne sats var fra 63 til 72 volura%. 95%-ig denaturert alkohol ble tilsatt til 10 1 av buljongen med en strømningshastighet på 100 ml/min inntil alkohol-konsentrasjonen var 63 volum%. Buljongen ble så sentrifugert i en Sharples sentrifuge modell T-l-P ved 30.000 r/min.
Til det klare avløp ble tilsatt 95%-ig denaturert alkohol
til en sluttkonsentrasjon på 72 volum% beregnet på det opprinne-
lige vandige volum. Suspensjonen ble hensatt over natten ved værelsetemperatur. Da polysaccharidet ikke feltes, ble natriumacetat tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1%. Det urene polysaccharid ble felt og oppsamlet ved å fjerne den klare overstå-
ende væske med en hevert, Polysaccharidet ble suspendert i 5%-ig nat r iumacet at .
Isopropanolundersøkelse viste at polysaccharidet feltes mellom 40 og 50 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Derfor ble isopropanol tilsatt dråpevis under omrøring på en "thermolyne" magnetrører, midtstilling , til en konsentrasjon på 1+ 0 volum%. Suspensjonen ble klaret ved sentrifugering i en Beckman J21 sentrifuge ved 14-000 r/min (ca. 30.050 xg) i 20 minutter ved 4°C i 250 ml kopper. Den klare overstående væske ble brakt til 50 volum% isopropanol. Det felte polysaccharid ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med hevert.
Bunnfallet ble suspendert i 1.000 ml vann. 0,203 g MgCl2
(1 mM), 8 m9ribonuclease og 7 mg deoxyribonuclease ble tilsatt under omrøring som i det foregående trinn. pH ble innstilt på
7,0 med iseddik, og blandingen ble inkubert i 90 minutter ved 37°C i et roterende rystevannbad, innstilling 2-3, ryster modell G76, New Brunswick Scientific. Efter inkubering ble pH hevet til 8,0, 50 mg trypsin (Worthington) ble tilsatt under om-røring, og oppslutningen ble inkubert som ovenfor i 90 minutter.
pH ble innstilt på 6,5, og oppslutningen ble overført i
16 mm dialyserør og dialysert mot 14 1 vann.
Den dialyserte oppløsning (1.030-ml) ble brakt til 5% nat riumacetat. Isopropanolundersøkelse indikerer at polysaccharidet felles mellom 45 og 52 volum% isopropanol. Fraksjonering og felning ble utført som i det tidligere isopropanoltrinn. Det endelige felte polysaccharid ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert. Bunnfallet ble skrapet inn i en Waring blender, triturert med 500 ml absolutt ethanol og vasket i en middels sinterglasstrakt. Polysaccharidet ble vasket ytterligere med 500 ml absolutt ethanol fulgt av 250 ml aceton. Overskudd av oppløsningsmidlet ble fjernet ved sug, og sluttproduktet ble tørret i vakuum over calciumsulfat. Utbyttet var 4,0 g.
Eksempel 12
Pneumococcisk polysaccharid type 17
En lyofilisert kultur av Streptococcus pneumoniae type 17 ble suspendert i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB buljong), og 0,2 ml sprees på en kaninblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C ble veksten på platen suspendert i 5 ml HIB-buljong,og 1 ml av suspensjonen ble overført i lOO ml kaninblod-væskemedium og inkubert som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering ble kulturen undersøkt mikroskopisk og streket på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. De 100 ml kultur ble oppbevart i kjøleskap ved 4°C 10 ml av kulturen av den inkuberte buljong ble anvendt til å inokulere 1 liter inokulummedium i en 2-liter Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert stasjonært i 19 timer ved 37°C Fermenteringsvæskens pH ble regulert (6,4 - 7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d. på 3,68 var nådd. 1 liter fermenteringsvæske forbruker 100 ml natriumbicarbonat for å nå ovennevnte O.D. Før inokulering av det neste trinn ble en prøve påført YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve ble også undersøkt mikroskopisk, og en agglutiner i ngsprøve ble ut-ført for å kontrollere renhet og type. 1 liter av ferment e ringsvæsken fra det foregående trinn ble anvendt til å inokulere en l4~liters fermentator inneholdende 9 1 produksjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luftstrøm. Efter den siste natriumhydroxydtilsetning ble fermenteringen fortsatt i ytterligere 1 time og derpå avsluttet (tilsammen 8 timer). Den endelige o.d. før høsting var 4,4- pH ble regulert under fermenteringen (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-ig natriumhydroxyd. Tilsammen 695 ml 10%-ig natriumhydroxyd ble anvendt.
Efter at satsen var avsluttet, ble kulturen påført YED- og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning og identifisert med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen ble inaktivert ved høsting i 89%-ig forvæsket fenol til en sluttkonsentrasjon på 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for å utvinne produktet. En prøve ble tatt og platet på HIB for å kontrollere levedyktigheten.
Efter ethanolundersøkelse ble 10 1 av buljongen brakt til 50 volum% ethanol (95% denaturert ethanol) ved tilsetning av alkoholen under konstant omrøring ved en strømningshastighet på 100 ml/min. Buljongen ble så sentrifugert i en Sharples sentrifuge modell T-l-P, 30.000 r/min.
For å klare avløpet ble 95%-ig denaturert ethanol tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 57 volum% beregnet på det opprinnelige vandige volum. Suspensjonen ble hensatt over natten ved værelsetemperatur i løpet av hvilken tid bunnfallet satte seg.
Det urene polysaccharid ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert, og bunnfallet ble oppløst i 1.000 ml 3%-ig natriumacetat .
Isopropanolundersøkelse indikerte at polysaccharidet feltes mellom 35 og 42 volura% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol ble derfor tilsatt dråpevis under omrøring på en magnet-rører, til en konsentrasjon på 35 volum%. Suspensjonen ble klaret ved sentrifugering i en Beckman J21 ved 14-000 r/min (ca. 30.050 xg) i 20 minutter ved 4°C. Den klare overstående væske ble brakt til 42% isopropanol, og polysaccharidet ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert.
Bunnfallet ble oppløst i 1.OOO ml vann. pH ble innstilt på 7,0, og 0,2039MgCl2(1 mM), 8 mg ribonuclease og 8 mg deoxyribonuclease ble tilsatt under omrøring som i det foregående trinn. Blandingen ble inkubert i 90 minutter ved 37°C i et roterende rystende vannbad. Efter inkubering ble 49 mg trypsin (Worthington) tilsatt. Oppslutningen ble brakt til pH 8,0 med
IN NaOH og inkubert i 90 minutter som ovenfor.
pH ble innstilt på 6,5, og oppslutningen ble overført i
15,9 mm dialyserør og dialysert mot 14 1 vann.
980 ml ble utvunnet og brakt til 3% nat riumacetat . Iso-propanolundersøkelse viste at polysaccharidet feltes mellom 40 og 47 volum% isopropanol. Fraksjonering og felning ble utført som i det tidligere isopropanoltrinn. Det endelige felte polysaccharid ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert. Polysaccharidet ble skrapet over i en Waring blender, triturert med 500 ml absolutt ethanol og vasket over på en middels sintret glasstrakt. Det vaskes ytterligere med 500 ml absolutt ethanol fulgt av 250 ml aceton. Overskudd av oppløsningsmiddel fjernes ved sug, og sluttproduktet tørres i vakuum over CaSO^. Utbytte: 3,3 g.
Eksempel 13
Pneumococcisk polysaccharid type 19
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 19 ble dyrket på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene ble oppsamlet og anbrakt i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten ble anvendt til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøt tekst rakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium ble inokulert med innholdet av 2-liters kolben og dyrket i 16 timer ved 37°C
under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol ble så tilsatt til mediet til en 1 volum% konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining . Området for denne sats var fra 48 til 62 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur ble 5,54 1 ethanol langsomt tilsatt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrør-
ing. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-000 r/min i en'10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene ble kastet.
Under omrøring ble ytterligere 4525 1 ethanol langsomt tilsatt til den overstående væske, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-O00 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge.
Den overstående væske ble kastet, og de urene polysaccharid-faststoffer ble suspendert i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH ble innstilt på 6,5 med iseddik og omrørt i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet .
En isopropanolundersøkelse ble utført på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 35 til 45 volum%.
Under omrøring ble 0,323 1 isopropanol tilsatt, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrør-
ing. Blandingen ble forklaret ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen ble fullstendiggjort i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene ble kastet. Under omrøring ble ytterligere 0,168 1 isopropanol tilsatt til den overstående væske, og den erholdte blanding fikk lov til å eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfa 11 ble utvunnet ved sentrifugering ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske ble kastet.
Det urene polysaccharid ble suspendert ved hjelp av en høyskjær-blander i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH ble igjen innstilt på 7,0 med iseddik og 60 mg MgC^, 0,3 m9ribonuclease og 0,3 m9deoxyribonuclease ble tilsatt. Oppløsningen ble oppsluttet under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH ble innstilt på 8,0 med 50%-ig NaOH, 0,6 mg trypsin ble tilsatt, og oppslutningen ble fortsatt ved 37°C i 90 minutter. Blandingen ble avkjølt til 20-25°C, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
Oppløsningen ble avkjølt til 0-5°C, 180 g ammoniumsulfat
ble tilsatt, og blandingen ble eldet ved 0-5°C i 4 timer. Bunnfallet som dannet seg, ble oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske ble kastet.
Bunnfallet ble oppløst i 0,3 1 pyrogenfritt vann, og oppløs-ningen ble diafiltrert i en "Romicon hollow filter ult rafiltration membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet nådde en konstant verdi. Reservoaret ble holdt ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholdt polysaccharidet, ble avtappet fra systemet og volumet igjen brakt til 0,3 1
med systemvasker.
9 g natriumacetat ble tilsatt til oppløsningen av den poly-saccha ridholdige væske, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
Under omrøring ble 0,6 1 isopropanol tilsatt, og den dannede
blanding ble omrørt i 2 timer og fikk sette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall var utskilt på bunnen. Hele den overstående væske ble fradekantert, og bunnfallet ble triturert i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt
pulver var erholdt. Pulveret ble utvunnet ved filtrering på en
nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver ble så tørret ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man fikk ca. 5,49av det rensede polysaccharid.
Eksempel 14
Pneumococcisk polysaccharid type 20
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 20 (ATCC 6320) suspenderes i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong) og 0,2 ml sprees på en hareblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C suspenderes veksten på platen i 5 ml HIB-buljong, og 1 ml av suspensjonen overføres i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkuberes som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering undersøkes kulturen mikroskopisk og strekes på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. De 100 ml kultur lagres
i kjøleskap.ved 4°C.
10 ml av den inkuberte kultur anvendes til å inokulere
1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben inkuberes stasjonært i 18 timer ved 37°C. Fermenteringsvæskens pH reguleres (6,4~7,0) ved tilsetning av 12%-ig bicarbonat inntil en o.d. på 2,8 nåes. 1 liter fermenteringsvæske forbruker 85 ml natriumbicarbonat til å nå ovennevnte o.d. Før inokulering av det neste trinn strykes en prøve på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve undersøkes også mikroskopisk, og en agglutineringsprøve utføres for å kontrollere renhet og type. 1 liter fermenteringsbuljong fra det foregående trinn anvendes til å inokulere en 14-liters fermentator inneholdende 9 1 produksjonsmedium. Satsen inkuberes ved 37°C under mild omrør-ing (100 r/min) uten luftstrøm. Forløpet av fermenteringen over-våkes ved o.d.-, pH- og glucose-bestemmelser.
Efter den siste natriumhydroxydtilsetning fortsettes fermenteringen i ytterligere 2 timer og avsluttes så (samlet tid 10,5 timer). Den endelige o.d. før høsting er 3,1. pH reguleres under fermenteringen (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-ig NaOH. Tilsammen 700 ml 10%-ig NaOH anvendes.
Efter at satsen- er avsluttet, strykes kulturen på YED- og HIB-plater, undersøkes på renhet ved Gram-farvning, og identi fiseres med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen inaktiveres ved høsting i 89% forvæsket fenol til en sluttkonsentrasjon på 1 volum%. Efter 2 timer i fenol frigjøres buljongen, og produktet utvinnes. En prøve taes og trykkes på
HIB for å kontrollere levedyktigheten.
Efter ethanolundersøkelse tilsettes 95%-ig denaturert alko-
hol til 10 1 av buljongen for å bringe alkoholinnholdet på
53 volum%. Alkohol tilsettes under konstant røring med en strøm-ningshastighet på 100 ml/min. Buljongen sentrifugeres så i en Sharples sentrifuge modell T-l-P, ved 30.000 r/min.
For å klare avløpet tilsettes ytterligere 95%-ig denaturert alkohol til en sluttkonsentrasjon på 65 volum% beregnet på det opprinnelige vandige system. Det uoppløselige materiale (som felles straks ved tilsetning av alkoholen) oppsamles ved å fjerne den overstående væske med hevert og ved sentrifugering i en "Sorvall RC5" ved IO.000 r/min (I6.3OO xg) i 500 ml kopper ved 23°C i ca. 15. minutter.
Pelletene suspenderes i 1.000 ml 3%-ig natriumacetat.
Isopropanolundersøkelse viser at polysaccharidet felles
mellom 44 og 52 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol tilsettes derfor dråpevis under omrøring på en "thermolyne" røreplate, midtinnstilling, til et 44 volum% nivå. Suspensjonen sentrifugeres så i en "Sorvall RC5" i 250 ml kopper ved 14.000 r/min i 15 minutter ved 23°C (ca. 31.700 xg). Den klare overstående væske fortynnes med isopropanol til en konsentrasjon på 52 volum%. Dette fører til utskillelse av en gummi som oppsamles ved å fjerne den overstående væske med hevert.
Gummien suspenderes i 1.000 ml pyrogenfritt vann. pH innstilles på 7,0, 203 mg MgCl2(1 mM), 4 mg ribonuclease og 6 mg deoxyribonuclease tilsettes under omrøring som i det foregående trinn. Dette inkuberes i et rystende vannbad i 1 time ved 37°C. Efter inkubering innstilles pH på 8,0 med NaOH, og 30 mg trypsin tilsettes under omrøring som i det foregående trinn. Blandingen inkuberes i 90 minutter som ovenfor.
pH innstilles på 7,0, og oppslutningen overføres i 15,9 mm dialyserør og dialyseres mot 14 1 vann med et bytte av vann.
Den dialyserte oppløsning fortynnes med 2 volum 95%-ig denaturert alkohol. Tilsetning av 300 ml av en alkoholisk elektrolytt (1 volum 20%-ig natriumacetat, pH 6,5, pluss 2 volum 95%-ig denaturert alkohol) fører til felning av polysaccharidet. Polysaccharidet oppsamles ved sentrifugering på en Beckman J21 i 500 ml kopper ved 10.000 r/min (17.680 xg) i 15 minutter ved 23°C. Pelletene overføres til en Waring blender og tritureres med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol. De faste partikler vaskes over på en middels sinterglasstrakt og vaskes igjen med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol og 250 ml aceton. Efter fjernelse av overskudd av oppløsningsmiddel ved sug tørres polysaccharidet i vakuum over CaSO^. Utbyttet er 4,39-
Eksempel 15
Pn eumococcisk polysaccharid type 23
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 23 dyrkes på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved
2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En l4~liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet fra 2-literskolben og dyrkes i l6 timer ved 37°C
under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på prøven av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats er fra 48 til 62 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 5,54 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifuteres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 4,25 1 ethanol lang-
somt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres
så ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH innstilles på 6,5 med iseddik og omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats er fra 33 til 48 volum%.
Under omrøring tilsettes 0,295 1 isopropanol, og den
erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullføres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000 - 30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,259 1 isopropanol til den overstående væske, og den erholdte blanding får lov til å eldes i 4 timer under omrøring.
Det urene polysaccharidbunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kast es.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høyskjær-blander i 0,6 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH innstilles igjen på 7,0 med iseddik og 60 mg MgClg, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes ved omrør-ing ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig NaOH, 18 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Oppløsningen avkjøles til 0-5°C, 5,1 g NaCl og 240 g ammoniumsulfat tilsettes, og blandingen eldes ved 0-5°C i 4 timer. Bunnfallet som dannes, oppsamles ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes.
Bunnfallet oppløses i 0,3 1 pyrogenfritt vann, og oppløs-ningen diafiltreres i en "Romicon hollow filter ult rafiltrat ion membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholder polysaccharidet, tappes av fra systemet, og volumet gjenopprettes til 0,3 1 med
systemvasker.
9 g natrxumacetat tilsettes til oppløsningen av den polysaccharidholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik. Under omrøring tilsettes 0,6 1 isopropanol, og den erholdte blanding omrøres i 2 timer og får bunnfelles i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres, og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en rutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 1,92 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel l6
Pneumococcisk polysaccharid type 25
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 25 dyrkes på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En 14-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av 2-literskolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats var fra 52 til 65 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 6,5 1 ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 4,6" 1 ethanol langsomt til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de -urene polysaccharid-faststoffer suspenderes i 0,6 1 3%~ig natriumacetatoppløsning. pH innstilles på 6,5 med iseddik, og blandingen omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den poly-saccha ridholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 38 til 52 volum%.
Under omrøring tilsettes 0,37 1 isopropanol, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under stadig omrøring. Blandingen forklares ved 15.000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klar-
ingen fullføres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,3 1 isopropanol til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge, og den overstående væske kastes.
Det urene polysaccharid suspenderes i 0,3 1 pyrogenfritt
vann. pH innstilles på 7,0 med iseddik, og 0,12 g MgCl2, 3,0 mg ribonuclease og 3,0 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig NaOH, 0,5 g trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen av-
kjøles til 20-25°C, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den oppsluttede oppløsning diafiltreres i en "Romicon hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske lednings-
evne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholder polysaccharidet avledes fra systemet, og volumet bringes igjen på 0,3 1 med systemvasker.
Den polysaccharidholdige væskes pH innstilles på 6,5 med iseddik, og en isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av væsken for å bestemme det optimale isopropanoloraråde for poly-saccha ridf eining . Med denne sats var området fra 38 til 47 volum%. Under omrøring tilsettes 0,18 1 isopropanol, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer. Blandingen forklares i en 10 cm Sharples sentrifuge ved 15-000 r/min. Klaringen fullføres i en
K-2 ultrasentrifuge ved 25-000-30.000 r/min. Faststoffene kastes, og ytterligere 0,082 1 isopropanol innføres i den overstående væske fra K-2 sentrifugen, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-
bunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sent rif uge, og den overstående væske kastes.
Bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt pulver oppnåes. Pulveret ut-
vinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 2,5 g av det rensede polysaccharid .
Eksempel 17
Pneumococcisk polysaccharid type 51
En kultur av Streptococcus pneumonia type 51 dyrkes på
blodagar i l6 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En 14-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium inokuleres med innholdet fra 2-literskolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse utføres på en prøve av den fenolis-
erte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for polysaccharidfelning. Området for denne sats var fra 50 til 70 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur tilsettes 6 1
ethanol langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge.Faststoffene kastes.
Under omrøring tilsettes ytterligere 8 1 ethanol langsomt
til den overstående væske, og den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen sentrifugeres så ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Den overstående væske kastes, og de urene polysaccharid-fast stoffer suspenderes i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH innstilles på 6,5 med iseddik, og bland-
ingen omrøres i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet.
En isopropanolundersøkelse utføres på en prøve av den poly-saccha ridholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfelning. Området for denne sats er fra 42 til 5.7volum%.
Under omrøring tilsettes 0,434 1 isopropanol langsomt, og
den erholdte blanding eldes i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen forklares ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen fullføres i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.000-30.000 r/min. Faststoffene kastes. Under omrøring tilsettes ytterligere 0,361 1 isopropanol langsomt til den overstå-
ende væske, og den erholdte blanding får lov til å eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharid-bunnfall utvinnes ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentri-
fuge, og den overstående væske kastes.
Det urene polysaccharid suspenderes ved hjelp av en høyskjær-blander i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH innstilles igjen på 7,0 med iseddik og 60 mg MgCl2, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease tilsettes. Oppløsningen oppsluttes under om-røring ved 37°C i 60 minutter. pH innstilles på 8,0 med 50%-ig NaOH, 18 mg trypsin tilsettes, og oppslutningen fortsettes ved
37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen avkjøles til 20-25°C,
og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Den oppsluttede oppløsning diafiltreres i en "Romicon hollow filter ult rafilt rat ion membrane" inntil den elektriske lednings-
evne av permeatet når en konstant verdi. Reservoaret holdes ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte, som inneholder polysaccharidet, avtappes fra systemet, og volumet gjenopprettes på 0,3 1 med systemvasker. 9 g natriumacetat tilsettes til oppløsningen av den poly-saccha ridholdige væske, og pH innstilles på 6,5 med iseddik.
Under omrøring tilsettes 0,6 1 isopropanol, og den erholdte
blanding omrøres i 15 minutter og får avsette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall er utskilt på bunnen. Hele den overstående væske fradekanteres , og bunnfallet tritureres i en Waring blender med ca. 40 ml absolutt ethanol inntil et hvitt
pulver fåes. Pulveret utvinnes ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver tørres så ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man får ca. 3j339
renset polysaccharid.
Eksempel 18
Pneumococcisk polysaccharid type 56
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 56 dyrkes på blodagar i 16 timer ved 37°C. Cellene oppsamles og anbringes i 250 ml blodbuljong i 16 timer ved 37°C. En 5-10 ml porsjon av blodbuljongveksten anvendes til å inokulere en 2-liters kolbe inneholdende kjøttekstrakt-næringsmedium. Kulturen dyrkes i l6 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. En 14-liters kolbe inneholdende kjøtt ekst rakt-næringsmedium inokuleres med innholdet av 2-literskolben og dyrkes i 16 timer ved 37°C under tilsetning av natriumbicarbonat ved 2 timers intervaller for å nøytralisere mediet. Fenol tilsettes så til mediet til en 1 volum%-ig konsentrasjon for å drepe bakteriene.
En ethanolundersøkelse ble utført på en prøve av den fenoliserte hele buljong for å bestemme ethanolområdet for poly-saccharidf eining. Området for denne sats var fra 52 til 67 volum%.
Under omrøring og ved værelsetemperatur ble 6,5 1 ethanol tilsatt langsomt til 6 1 av den fenoliserte hele buljong, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring.
Blandingen ble så sentrifugert ved 15.000 r/min i en 10 cm
Sharples sentrifuge. Faststoffene ble kastet.
Under omrøring ble ytterligere 5>68 1 ethanol tilsatt langsomt til den overstående væske, og den erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble så sentrifugert ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge.
Den overstående væske ble kastet, og de urene polysaccharid-faststoffer ble suspendert i 0,6 1 3%-ig natriumacetatoppløsning ved hjelp av en høyskjær-blander. pH ble innstilt på 6,5 med iseddik og omrørt i 4 timer for å sikre oppløsning av polysaccharidet .
En isopropanolundersøkelse ble utført på en prøve av den polysaccharidholdige væske for å bestemme det optimale isopropanolområde for polysaccharidfeining. Området for denne sats var fra 38 til 50 volum%.
Under omrøring ble 0,368 1 isopropanol tilsatt, og den
erholdte blanding ble eldet i 4 timer under kontinuerlig omrøring. Blandingen ble forklaret ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge. Klaringen ble fullført i en K-2 ultrasentrifuge ved 25.OOO-30.OOO r/min. Faststoffene ble kastet. Under omrøring ble ytterligere 0,232 1 isopropanol tilsatt til den overstående væske, og den erholdte blanding fikk lov til å eldes i 4 timer under omrøring. Det urene polysaccharidbunnfall ble utvunnet ved sentrifugering ved 15-000 r/min i en 10 cm Sharples sentrifuge,
og den overstående væske ble kastet.
Det urene polysaccharid ble suspendert ved hjelp av en høy-skjær-blander i 0,3 1 pH 7,0, 0,05 M fosfatpuffer. pH ble igjen innstilt på 7,0 med iseddik og 60 mg MgCl2, 0,6 mg ribonuclease og 0,6 mg deoxyribonuclease ble tilsatt. Den erholdte oppløsning ble oppsluttet under omrøring ved 37°C i 60 minutter. pH ble innstilt på 8,0 med 50%-ig NaOH, 18 mg trypsin ble tilsatt, og oppslutningen ble fortsatt ved 37°C i ytterligere 90 minutter. Blandingen ble avkjølt til 20-25°C, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
Oppløsningen ble avkjølt til 0-5°C, 2,55 g NaCl og 120 g ammoniumsulfat ble tilsatt, og blandingen ble eldet ved 0-5°C i 4 timer. Bunnfallet som ble dannet, ble oppsamlet ved sentrifugering ved 20.000-25-000 r/min i K-2 ultrasentrifugen. Den overstående væske ble kastet.
Bunnfallet ble oppløst i 0,3 1 pyrogenfritt vann, og oppløs-ningen ble diafiltrert i en "Romicon hollow filter ultrafiltration membrane" inntil den elektriske ledningsevne av permeatet nådde en konstant verdi. Reservoaret ble holdt ved konstant volum med pyrogenfritt vann. Det tilbakeholdte som inneholdt polysaccharidet, ble avtappet fra systemet, og volumet ble igjen brakt til 0,3 1 med systemvasker. 9 g natriumacetat ble tilsatt til oppløsningen av den polysaccharidholdige væske, og pH ble innstilt på 6,5 med iseddik.
Under omrøring ble 0,6 1 isopropanol tilsatt, og den erholdte blanding ble omrørt i 2 timer og fikk sette seg i flere timer inntil et gummiaktig bunnfall var utskilt på bunnen. Hele den overstående væske ble fradekantert, og bunnfallet ble triturert i en Waring blender med ca. L\ Q ml absolutt ethanol inntil man fikk et hvitt pulver. Pulveret ble utvunnet ved filtrering på en nutsch (Whatman nr. 2 papir) under vasking med 2 x 5 ml absolutt ethanol og 2 x 5 ml aceton. Det vaskede pulver ble så tørret ved 686 mm Hg og værelsetemperatur i 12-16 timer, hvorved man fikk ca. 2,04 g av det rensede polysaccharid.
Eksempel 19
Pneumococcisk polysaccharid type 57
En kultur av Streptococcus pneuraoniae type 57 ble suspendert
i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong), og 0,2 ml sprees på en hareblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C
ble veksten på platen suspendert i 5 ml HIB-buljong, og 1 ml av suspensjonen ble overført i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkubert som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C Efter inkubering ble kulturen undersøkt mikroskopisk og streket på YED-
og HIB-plater for å kontrollere renheten. Den 100 ral kultur ble lagret i kjøleskap ved 4°C.
10 ml av den inkuberte kultur ble anvendt til å inokulere
1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert stasjonært i 18 timer ved 37°C. Fermenteringsmediets pH ble regulert (6,4-7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d. på 2,0 var nådd. Den 1-liters fermentering forbrukte 100 ml natriumbicarbonat ved oppnåelse av ovennevnte o.d.- Før inokulering av det neste trinn ble en prøve strøket på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve ble også undersøkt mikroskopisk,og en agglutineringsprøve
ble utført for å kontrollere renhet og type.
1 liter fermenteringsbuljong fra det foregående trinn ble anvendt til å inokulere en l4-liters fermentator inneholdende 9 1 produksjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild om-røring (100 r/min) uten .luftstrøm. Forløpet av fermenteringen ble overvåket ved o.d.-, pH- og glucose-bestemme Is er. Efter den siste natriumhydroxydtilsetning ble fermenteringen fortsatt i ytterligere 1 time og derpå avsluttet (samlet tid 10,5 timer).
Den endelige o.d. før høsting var 5,0. pH ble regulert under fermenteringen (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-igNaOH. Tilsammen 655 ml 10%-ig NaOH ble anvendt.
Når satsen var avsluttet, ble kulturen påført på YED- og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning og identifisert
med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen ble inaktivert ved høsting i 89%-ig forvæsket fenol til en sluttkonsentrasjon på 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for å utvinne produktet. En prøve ble tatt og påført på HIB for å kontrollere levedyktigheten.
Efter ethanolundersøkelse ble 10 1 av buljongen brakt til
50 volum% ethanol ved tilsetning av 95%-ig denaturert alkohol med en strømningshastighet på 100 ml/min under konstant omrøring. Buljongen ble så klaret ved sentrifugering i Sharples-sentrifugen
ved 40.000 r/min.
Til det klare avløp ble tilsatt ytterligere 95%-ig denaturert alkohol til 65 volum% beregnet på det opprinnelige vandige system. Bunnfallet ble oppsamlet ved å fjerne det meste av den over-
stående væske med hevert og ved å sentrifugere den gjenværende overstående væske pluss det urene polysaccharid i en "Sorvall RC5" ved 6.000 r/min (6.089 xg) i 20 minutter ved 5°C.
Pelletene ble suspendert i 1.000 ml 3%-ig natriumacetat ved hjelp av en Waring blender ved lav hastighet. pH ble innstilt på 6,5.
Isopropanolundersøkelse viste at polysaccharidet felles
mellom 30 og 42 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol ble derfor tilsatt dråpevis under omrøring på en "themolyne" omrø ringsplate , midt st illing, til en konsentrasjon
på 30 volum%. Suspensjonen ble så klaret ved sentrifugering i en Beckman J21 ved 14-000 r/min (30.050 xg) ved 15°C i 20 min-
utter. Den klare overstående væske ble fortynnet med isopropanol til en sluttkonsent rasjon på 42%. Dette fører til utskillelse av et bunnfall som oppsamles ved sentrifugering på en Beckman J21 ved 6.000r/min i 15 minutter ved 5°C (6.370 xg).
Det utfelte polysaccharid suspenderes i 1.000 ml vann, og
pH innstilles på 7,0 med iseddik. 203 m9MgCl2(1 mM), 10 mg deoxyribonuclease og 15 mg ribonuclease tilsettes under omrøring. Blandingen inkuberes i et roterende vannbad i 80 minutter ved
37°C Efter inkubering innstilles pH på 8>0 med 1 N NaOH, og 30 mg trypsin tilsettes. Oppslutningen inkuberes som ovenfor.
pH innstilles på 7) 0, og oppslutningen overføres i 28,6 mm dialyserør og dialyseres mot 14 1 vann med et bytte av vann.
Ca. 1.000 ml utvinnes og bringes til 3% natriumacetat. Isopropanolundersøkelse indikerer at det rensede polysaccharid
felles mellom 40 og 50 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Felningen utføres som i det tidligere isopropanoltrinn. Polysaccharidet som hefter ved bunnen av begerglasset, oppsamles ved at den endelige overstående væske fjernes med en hevert. Det tritureres i en Waring blender ved høy hastighet med 500 ml absolutt ethanol og helles i en middels sinterglasstrakt. Polysaccharidet vaskes med 500 ml ethanol fulgt av 250 ml aceton. Overskudd av oppløsningsmiddel fjernes ved sug, og polysaccharidet tørres i vakuum over CaSO^. Utbyttet er 3>7g-
Eksempel 20
Pneumococcisk polysaccharid type 72
En kultur av Streptococcus pneumoniae type 72 suspenderes i
1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong), og 0,2 ml sprees på en kaninblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C suspenderes veksten på platen i 5 ml HIB-buljong, og 1 ml av suspensjonen overføres i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkuberes som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering undersøkes kult uren. mikroskopisk og strekes på YED- og HIB-plager for å kontrollere renheten. Den 100 ml kultur lagres
i kjøleskap ved 4°C.
10 ml av den inkuberte kultur anvendes til å inokulere
1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben inkuberes stasjonært i 19 timer ved 37°C. Fermenteringsmediets pH reguleres (6,4-7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d. på 1,24 nåes. 1 liter av fermenteringen forbruker 55 ml natriumbicarbonat for å nå den ovennevnte o.d. Før inokulering av det'neste trinn strykes en prøve på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve undersøkes også mikroskopisk, og en agglutineringsprøve utføres for å kontrollere renhet og type.
1 liter av fermenteringsbuljongen fra det foregående trinn
ble anvendt til å inokulere en l4~liters fermentator inneholdende
9 liter produksjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luftstrøm. Forløpet av fermenteringen ble fulgt ved o.d.-, pH- og glucose-bestemmelser. Når o.d.-bestemmelsene var like over en 2-timers periode, ble fermenter-
ingen avsluttet (samlet inkubasjonstid 10 timer). Den endelige o.d. før høsting var 3,68- pH ble regulert under fermenteringen (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-ig NaOH. Tilsammen 600 ml 10%-ig NaOH ble brukt.
Efter at satsen var avsluttet, ble kulturen strøket på YED-
og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning og identifisert med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen ble inaktivert ved høsting i 89%-ig forvæsket fenol til en sluttkonsent ras jon på 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for å utvinne produktet. En prøve ble tatt og påført på HIB-
plater for å kontrollere levedyktigheten.
Efter ethanolundersøkelse ble buljongen brakt til 42 volum%-ig ethanol ved tilsetning av 95%-ig denaturert ethanol. Alkoholen ble tilsatt langsomt under konstant omrøring med en strømnings-hastighet på 100 ml/min. Buljongen ble så sentrifugert i en Sharples sentrifuge, modell T-l-P, ved 30.000 r/min.
For å klare avløpet ble 95%-ig denaturert ethanol tilsatt
til en sluttkonsentrasjon på 57 volum% beregnet på det opprinnelige vandige system. Det uoppløselige materiale (som utfelles straks ved tilsetning av alkoholen) ble oppsamlet ved at den overstående væske, ble fjernet med hevert, og ved sent rif ugering i en Beck-
man J21 ved 9.000 r/min (ca. 14-000 xg) ved 23°C i 20 minutter.
Pelletene ble suspendert i 1.000 ml 3%-ig natriumacetat,
pH 6,5.
Isopropanolundersøkelse viste at polysaccharidet feltes
mellom 30 og 45 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol ble derfor tilsatt dråpevis under omrøring til et 30 volum% nivå. Suspensjonen ble så sentrifugert i en Beckman J21 i 250 ml kopper ved 10.000 r/min ved 23°C
(15-380 xg). Den klare overstående væske ble fortynnet med isopropanol til en konsentrasjon på 45 volum%. Dette førte til utskillelse av en halvflytende gummi som ble oppsamlet ved å
fjerne den overstående væske med hevert.
Gummien ble suspendert i 1.000 ml pyrogenfritt vann. pH
ble innstilt på 7,0. 203 mg MgCl2(1 mM), 4 mg ribonuclease og 6 mg deoxyribonuclease ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble inkubert i et roterende vannbad i 1 time ved 37°C. Efter inkubering ble pH innstilt på 8,0 medNaOH, og 30 mg trypsin ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble inkubert i 90 minutter som ovenfor.
pH ble innstilt på 6,5, og oppslutningen ble overført i
15,9 mm dialyserør og dialysert mot 14 1 vann med et bytte av vann.
Den dialyserte oppløsning (950 ml) ble fortynnet med
2 volum 95%-ig denaturert ethanol. Tilsetning av 150 ml av en alkoholisk elektrolytt (1 volum 20%-ig natriumacetat, pH 6,5,
pluss 2 volum 95%-ig denaturert ethanol) førte til felning av polysaccharidet. Polysaccharidet ble oppsamlet ved å fjerne den overstående væske med en hevert, og "matten" ble overført til en Waring blender og triturert med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol.
De faste partikler ble vasket over på en middels sintret glass-
trakt og vasket igjen med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol og 250 ml aceton. Efter fjernelse av overskudd av oppløsningsmiddel ved sug ble polysaccharidet tørret i vakuum over CaSO^. Utbyttet var 7,3 g.
Eksempel 21
Pneumococcisk polysaccharid type 73
En lyofilisert kultur av Streptococcus pneuraoniae type 73 ble suspendert i 1 ml "Difco Heart Infusion Broth" (HIB-buljong) og 0,2 ml ble spredt på en hareblod-agarplate. Efter 18 timers inkubering ved 37°C ble veksten på platen suspendert i 5 ml HIB-buljong og 1 ml av suspensjonen ble overført i 100 ml kaninblod-væskemedium og inkubert som en stasjonær kultur i 18 timer ved 37°C. Efter inkubering ble kulturen undersøkt mikroskopisk og streket på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. De 100 ml kultur ble lagret i kjøleskap ved 4°C .
10 ml av inkubasjonskulturen ble anvendt til å inokulere
1 liter inokulummedium i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert stasjonært i 16 timer ved 37°C. Fermenteringens pH ble regulert (6,4-7,0) ved tilsetning av 12%-ig natriumbicarbonat inntil en o.d. på 1,4 var nådd. Den 1-liters fermentering forbrukte 120 ml natriumbicarbonat for å nå den ovennevnte o.d.
Før inokulering i det neste trinn ble en prøve påført på YED- og HIB-plater for å kontrollere renheten. En prøve ble også under-søkt mikroskopisk, og en agglutineringsprøve ble utført for å kontrollere renhet og type. 1 liter av fermenteringsbuljongen fra det foregående trinn ble anvendt til å inokulere en l4~liters fermentator inneholdende 9 liter produksjonsmedium. Satsen ble inkubert ved 37°C under mild omrøring (100 r/min) uten luftstrøm. Forløpet av fermenteringen ble overvåket ved o.d.-, pH- og glucose-bestemmelser. Når o.d.-bestemmelsene var like over en 2-timers periode, ble fermenteringen avsluttet (17 timer total inkubasjon). Den endelige o.d. før høsting var 4,48- PH ble regulert under fermenteringen (6,2-7,0) ved anvendelse av 10%-igNaOH. Tilsammen 665 ml 10%-ig NaOH ble anvendt.
Efter at satsen var avsluttet, ble kulturen påført på YED-og HIB-plater, undersøkt på renhet ved Gram-farvning, og identifisert med hensyn til type ved agglutineringsreaksjonen. Buljongen ble inaktivert ved høsting i 89%-ig forvæsket fenol til en sluttkonsentrasjon på 1%. Efter 2 timer i fenol ble buljongen frigjort for å utvinne produktet. En prøve ble tatt og påført på HIB-plater for å kontrollere levedyktigheten.
Efter ethanolundersøkelse ble buljongen brakt til /+0 volura% alkohol ved tilsetning av 95%-ig denaturert ethanol. Alkoholen ble tilsatt langsomt under stadig omrøring med en strømnings-hastighet på 100 ml/min. Buljongen ble så sentrifugert i en Sharples sentrifuge, modell T-l-P, ved 30.000 r/min.
For å klare avløpet ble 95%-ig denaturert ethanol tilsatt
til en sluttkonsentrasjon på 6o volum% beregnet på det opprinne-
lige vandige system. Suspensjonen ble hensatt over natten ved værelsetemperatur i løpet av hvilken tid bunnfallet avsatte seg.
Det uoppløselige materiale (urent polysaccharid) ble oppsamlet ved
å fjerne den overstående klare væske med hevert og sentrifugere i en Beckman J21 ved 5.000 r/min (ca. 4-000 xg) i 10 minutter ved 23°C i 500 ml kopper.
Det pelletiserte materiale ble suspendert i 1.000 ml 3%_ig natriumacetatpuffer, pH 6,5, under omrøring på en "thermolyne" omrøringsplate, midtre innstilling.
Isopropanolundersøkelse indikerte at polysaccharidet feltes mellom 20 og 42 volum% isopropanol ved værelsetemperatur. Isopropanol ble derfor tilsatt dråpevis under omrøring til en konsentrasjon på 20 volum%, og suspensjonen ble sentrifugert i en Beckman J21 ved 10.000 r/min (15-380 xg) i 250 ml kopper ved 23°C. Den klare overstående væske ble fortynnet ytterligere med isopropanol til en konsentrasjon på 42 volum%. Dette førte til utskillelse av en "halvflytende gummi" som ble oppsamlet ved å
fjerne den overstående væske med hevert og sentrifugering i en Beckman J21 ved 6.000 r/min (ca. 5-520 xg) i 250 ml kopper ved
23°C
Pelleten fra det foregående trinn ble oppløst' i 1.400 ml
1%-ig natriumacetatpuffer. pHble innstilt på 7,0, 284 mg MgCl2
(1 mM), 1 mg ribonuclease og 1 mg deoxyribonuclease ble tilsatt
under omrøring som i det foregående trinn. Blandingen ble inkubert i et roterende rystevannbad i 1 time ved 37°C- Efter inkubering ble pH innstilt på 8,0 med 1 M NaOH, og 30 mg trypsin ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble inkubert som ovenfor i 90 minutter .
pH ble innstilt på 6,5, og oppslutningen ble overført i 15,9 mm dialyserør og dialysert mot 14 1 vann (byttet tre ganger).
Den dialyserte oppløsning (1.680 ml) ble fortynnet med 2 volum 95%-ig denaturert ethanol. Tilsetningen av 150 ml av en alkoholisk elektrolytt (1 volum 20%-ig natriumacetat pluss
2 volum 95%-ig denaturert ethanol) førte til øyeblikkelig flokkul-ering av polysaccharidet. Polysaccharidet ble oppsamlet ved sentrifugering i en Beckman J21, 250 ml kopper, i 15 minutter ved 10.000 r/min (15-380 xg) ved 23°C. Pellet ene ble overført i en Waring blender og ble triturert med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol. De faste partikler ble vasket over på en middels sintret glasstrakt med 500 ml 95%-ig denaturert ethanol fulgt av 250 ml aceton. Efter fjernelse av overskudd av oppløsningsmiddel ved sug ble polysaccharidet tørret i vakuum over CaSO^. Utbyttet var 7,9 g-
Eksempel 22
En polyvalent vaksine ble fremstilt ved å tilsette under aseptiske betingelser ved værelsetemperatur de følgende mengder kapsulært polysaccharid til 3-l60 ml pyrogenfri saltlake (0,85%). Polysaccharidene ble tilsatt individuelt med 15 sekunders mellomrom under kontinuerlig omrøring i en blander. Efter at det siste polysaccharid var tilsatt, ble omrøringen fortsatt i ytterligere 2-3 minut ter.
Blandingen, ble så sterilfiltrert og pakket i ampuller, 6 ml (10 doser) pr. ampulle.
Claims (6)
1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et renset kapsulært polysaccharid av Streptococcus pneuraoniae, karakterisert ved at en forutbestemt mengde av en vannblandbar alkohol tilsettes til et flytende medium inneholdende polysaccharidet og derved felle forurensninger, for-urensningene skilles fra det flytende medium, en forutbestemt mengde av en vannblandbar alkohol tilsettes til det flytende medium for å felle polysaccharidet, polysaccharidet suspenderes i et flytende medium, og proteiner og nucleinsyrer fjernes fra polysaccharidet.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at der som flytende medium anvendes en fermenteringsbuljong.
3- Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at der som vannblandbar alkohol anvendes en alkohol med 2 eller 3 carbonatomer.
4' Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at proteiner og nucleinsyrer fjernes ved behandling med trypsin og nucleaser.
5- Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at proteiner og nucleinsyrer fjernes ved behandling med et kationisk overflateaktivt middel.
6.F remgangsmåte ifølge krav 5,
karakterisert ved at der som kationisk overflateaktivt middel anvendes cetrimoniumbromid.
7- Fremgangsmåte ifølge krav 4-6, karakterisert ved at proteinfragmenter og nucleinsyrefragmenter fjernes ved diafiltrering.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85549177A | 1977-11-28 | 1977-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO783976L true NO783976L (no) | 1979-05-29 |
Family
ID=25321387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO783976A NO783976L (no) | 1977-11-28 | 1978-11-27 | Fremgangsmaate ved fremstilling av et renset kapsulaert polysaccharid av streptococcus pneumoniae |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0002404A1 (no) |
| JP (1) | JPS5495724A (no) |
| AU (1) | AU529128B2 (no) |
| CA (1) | CA1115210A (no) |
| DK (1) | DK527078A (no) |
| ES (1) | ES475509A1 (no) |
| FI (1) | FI783620A (no) |
| IT (1) | IT1109450B (no) |
| NO (1) | NO783976L (no) |
| NZ (1) | NZ188966A (no) |
| PT (1) | PT68831A (no) |
| YU (1) | YU283378A (no) |
| ZA (1) | ZA786664B (no) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4242501A (en) * | 1979-08-08 | 1980-12-30 | American Cyanamid Company | Purification of pneumococcal capsular polysaccharides |
| US4287173A (en) * | 1979-09-24 | 1981-09-01 | Merck & Co., Inc. | Vaccine for dental caries |
| FR2510606A1 (fr) * | 1981-07-30 | 1983-02-04 | Berri Balzac | Procede d'obtention de polyosides capsulaires, polyosides capsulaires ainsi obtenus et leur application a la preparation de vaccins |
| BE889979A (fr) * | 1981-08-14 | 1982-02-15 | Smith Kline Rit | Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation |
| NL8202527A (nl) * | 1982-06-22 | 1984-01-16 | Univ Utrecht | Vaccins tegen door bacterien met kapsel-polysacchariden verwekte ziekten en werkwijze voor het bereiden daarvan. |
| US4686102A (en) * | 1984-04-12 | 1987-08-11 | American Cyanamid Company | Multivalent pneumococcal vaccine and preparation thereof |
| NZ214503A (en) * | 1984-12-20 | 1990-02-26 | Merck & Co Inc | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates |
| US5714354A (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-03 | American Home Products Corporation | Alcohol-free pneumococcal polysaccharide purification process |
| US6224880B1 (en) | 1997-09-24 | 2001-05-01 | Merck & Co., Inc. | Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines |
| US7718791B2 (en) * | 2005-04-08 | 2010-05-18 | Wyeth Llc | Separation of contaminants from Streptococcus pneumoniae polysaccharide by pH manipulation |
| CA2604363C (en) | 2005-04-08 | 2015-06-16 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| ES2922132T3 (es) * | 2007-03-23 | 2022-09-08 | Wyeth Llc | Procedimiento abreviado de purificación para la producción de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae |
| DK2379734T3 (en) | 2008-12-18 | 2018-04-23 | Wyeth Llc | Method for Controlling the Molecular Weight of Polysaccharide of Streptococcus Pneumoniae Serotype 19A |
| PL2385981T3 (pl) | 2008-12-18 | 2020-01-31 | Wyeth Llc | Sposób kontroli masy cząsteczkowej polisacharydów streptococcus pneumoniae z zastosowaniem węgla |
| US20140106030A1 (en) * | 2011-05-02 | 2014-04-17 | Friesland Brands B.V. | Probiotics with Enhanced Survival Properties |
| EP3140429B1 (en) | 2014-05-05 | 2020-02-19 | Medtronic Inc. | Methods for scd, crt, crt-d, or sca therapy identification and/or selection |
| CN114853917A (zh) * | 2022-04-22 | 2022-08-05 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2388563A1 (fr) * | 1977-04-29 | 1978-11-24 | Fabre Sa Pierre | Vaccins acellulaires perfectionnes contenant des polysaccharides capsulaires |
-
1978
- 1978-10-24 CA CA314,028A patent/CA1115210A/en not_active Expired
- 1978-11-16 EP EP78400185A patent/EP0002404A1/en not_active Withdrawn
- 1978-11-20 AU AU41728/78A patent/AU529128B2/en not_active Expired
- 1978-11-21 NZ NZ188966A patent/NZ188966A/xx unknown
- 1978-11-27 IT IT52075/78A patent/IT1109450B/it active
- 1978-11-27 NO NO783976A patent/NO783976L/no unknown
- 1978-11-27 DK DK527078A patent/DK527078A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-11-27 FI FI783620A patent/FI783620A/fi unknown
- 1978-11-27 ZA ZA786664A patent/ZA786664B/xx unknown
- 1978-11-27 PT PT68831A patent/PT68831A/pt unknown
- 1978-11-28 JP JP14614478A patent/JPS5495724A/ja active Pending
- 1978-11-28 ES ES475509A patent/ES475509A1/es not_active Expired
- 1978-12-04 YU YU02833/78A patent/YU283378A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0002404A1 (en) | 1979-06-13 |
| IT7852075A0 (it) | 1978-11-27 |
| PT68831A (en) | 1978-12-01 |
| JPS5495724A (en) | 1979-07-28 |
| CA1115210A (en) | 1981-12-29 |
| IT1109450B (it) | 1985-12-16 |
| YU283378A (en) | 1983-04-30 |
| NZ188966A (en) | 1982-03-23 |
| FI783620A (fi) | 1979-05-29 |
| ZA786664B (en) | 1980-07-30 |
| AU4172878A (en) | 1979-06-07 |
| AU529128B2 (en) | 1983-05-26 |
| DK527078A (da) | 1979-07-04 |
| ES475509A1 (es) | 1980-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO783976L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av et renset kapsulaert polysaccharid av streptococcus pneumoniae | |
| DK173681B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ud fra en hyaluronsyreproducerende streptococbakterie | |
| Barry | Colominic acid, a polymer of N-acetylneuraminic acid | |
| Wilson et al. | Bone resorbing activity of purified capsular material from Actinobacillus actinomycetemcomitans | |
| Roberton et al. | In vitro utilization of mucin by Bacteroides fragilis | |
| Dudman et al. | The composition of the extracellular polysaccharides of Aerobacter–Klebsiella strains | |
| EP0024493B1 (en) | Multivalent pneumococcal vaccine | |
| JPS60251898A (ja) | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 | |
| CN106635924B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备及用途 | |
| Landsteiner et al. | On Group Specific a Substances: Iv. The Substance from Hog Stomach | |
| EP0041897B1 (en) | Polysaccharide antigen from streptococcus and vaccines | |
| EP0038265B1 (en) | Group b streptococcal capsular polysaccharides | |
| JPS61186328A (ja) | 新規錯体 | |
| US4123520A (en) | Method for preparing high molecular weight meningococcal Group C vaccine | |
| EP0407037B1 (en) | Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides | |
| EP0008969A2 (en) | Vaccine and method of making | |
| Englesberg et al. | STUDIES ON IMMUNIZATION AGAINST PLAGUE VI: Growth of Pasteurella pestis and the Production of the Envelope and Other Soluble Antigens in a Casein Hydrolyzate Mineral Glucose Medium | |
| DISCHE et al. | Polysaccharides of the Vitreous Tibers | |
| US4235994A (en) | High molecular weight meningococcal group C vaccine and method for preparation thereof | |
| US5019502A (en) | Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides | |
| US5039610A (en) | Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides | |
| NO142961B (no) | Steroidbindende globulin til anvendelse ved in vitro-diagnostikk og ved fremstilling av antisera | |
| US2826571A (en) | Protein product and process | |
| Young et al. | Agglutination of mycelial cell wall fragments and spores of Colletotrichum lindemuthianum by plant extracts, and by various proteins | |
| US2975100A (en) | E. histolytica diagnostic antigen and production thereof |