NL8202527A - Vaccins tegen door bacterien met kapsel-polysacchariden verwekte ziekten en werkwijze voor het bereiden daarvan. - Google Patents

Description

Λ - '* > t i 1 : VQ 3^98

T

Vaccins tegen door bacteriën met kapsel-polysacchariden verwekte ziekten en werkwijze voor het bereiden daarvan*

Da- uitvinding- heeft betrekking op vaccins gericht tegen bacteriën met kapsel-polysacchariden en. op een werkwijze voor het bereiden van dit soort, vaccins.

De bereiding van vaccins tegen bacteriëm, die zich omge— 5 ven met kapsel-polysacchariden, zoals de diverse typen van Streptococcus pneumoniae- en Klebsiella pneumoniae is een-probleem* Deze kapsel-polysacchariden beschermen de bacteriën nl* zeer effectief tegen fagocytose· door cellen van de patiënt * Men heeft derhalve gezocht naar vaccins die bij mens- en dier de aamnaak stimuleren van specifiek tegen de kapsel-10 polysacchariden gerichte antilichamen. Hebben deze het beschermend kap— . sel nl* eenmaal vernietigd, dan volgt verdere vernietiging van de· infecterende bacteriën snel en zeker* Proeven met vaccins op basis van de intacte kapsel-polysacchariden van dit soort bacteriën hebben aangetoond, dat dit soort vaccins zeer weinig effectief zijn. Daar deze polysacchari— 15 den zijn opgebouwd uit zich steeds herhalende eenheden, is nagegaan of afbraakprodukten in.de vorm van oligosacchariden van deze polysacchariden· misschien effectiever zouden: zijn. Inderdaad werd gevonden, dat fracties van- oligosacchariden met 2-12, bij voorkeur 6-10 monosacchari-de-eenheden een sterke antigens activiteit ontplooien.

20 Bij toediening aan mens en. dier van dit soort oligo sacchariden is evenwel bij verdere proeven gebleken, dat zij vaak in het lichaam daarvan worden ontleed, alvorens zij hun antigene activiteit hebben kunnen ontplooien, oftewel de aanmaak van antilichamen tegen de intacte polysacchariden hebben kunnen stimuleren. Volgens de uitvinding 25 is derhalve gezocht naar een mogelijkheid de oligosacchariden in een zodanige vorm toe te dienen, dat zij voldoende tegen ontleding in het lichaam van de patiënt, hetzij mens of dier, zijn beschermd, totdat zij de produktie van antilichamen voldoende hebben kunnen stimuleren. Gevonden werd nu, dat men een dergelijke bescherming op effectieve wijze bereikt, 30 indien men de oligosacchariden via een primair lipofiel alkylamine van 1^ — 22 koolstofatomen, of andere aminen met een sterk hydrofoob deel, zoals die uit de reeks van de fosfatidylethanolaminen, in een liposoom 8202527 ........

2 * » verankert- De onderhavige vaccins· "bevatten dos oligosacchariden, die· via alkylaminen aan liposomen zijn verankerd.

Door oligosacchariden, herkomstig van verschillende bacteriën in te· bouwen: in het liposoom kan. een tegen verschillende- bac— 5 teriën gericht multivalent, vaccin worden verkregen. Het is echter ook mogelijk om langs chemische weg bereide oligosacchariden te gebruiken.

De onderdelen van de onderhavige vaccins worden hieronder nader beschreven.

Om de actiefste fracties aan. oligosacchariden te be-10 reiden,- dient ,te worden uitgegaan van de intacte poljsacchariden. De laatster kunnen worden verkregen door de betreffende bacterie op een passende- voedingsbodem, te kweken,, de verkregen cultuur met loog te neutraliseren^ de polysacchariden met calciumchloride of een ander passend zout neer te slaan,, met water te wassen, enige-malen in zure., basische of 15 zoutoplossingen weer op te lossen er'telkens daarna bijvoorbeeld met ethanol of aceton weer neer te slaan. Aldus wordt uiteindelijk een voldoend zuivere polysaccharide-fr actie· verkregen. Hieruit kunnen door hydrolyse de gewenste oligosacchariden. worden verkregen. De hydrolyse kan langs enzymatische weg of langs chemische weg, in het bijzonder door 20 zure hydrolyse worden tot stand gebracht. Door de verkregen polysacchari— defractie enige tijd in een zuur milieu te verhitten wordt onder meer de gewenste oligosaceharidefractie gevormd. Meestal, xs hiervoor ca. 30 min verhitten op 100°C in een 1ΙΓ-zuuroplossing zeer' geschikt gebleken. Deze zure hydrolyse levert een aantal, oligosacchariden met 2. tot vele 25 saccharide-eenheden. Deze oligosacchariden kunnen naar ketenlegte worden gescheiden door ze over bijvoorbeeld Sephadex te chromatograferen, waardoor oligosacchariden van verschillende ketenlengte worden opgevangen en aldus worden gescheiden. De meest· actieve fracties zijn die met 6-8 monosaccharide-eenheden per molecuul gebleken. De respectievelijke frac-30 ties kunnen dunnelaag-chromatografisch, gasvloeistof-chromatografisch en aan de hand van hun kern-spin-resonantie worden geïdentificeerd.

De aldus verkregen oligosaccharidefracties kunnen niet direct aan liposomen worden gehecht, maar moeten daarvoor eerst in. de vorm van een glycolipide worden gebracht. Dit kan het beste geschieden 35 door ze met een. alkylamine en een reductiemiddel, zoals laBH^, laCHBH^ of LiAlïï^ reductief te amineren. Deze reactie wordt uitgevoerd bij kamer- 8202527 * ( 3 ί '. temperatuur· gedurende T - ΐ^·' dagen tot het meeste- ongekoppelde oligosaccharide is verdwenen*. Dit wordt dnnnelaag-chromatografis ch nagegaan.

Out met een redelijke reactietijd, te kunnen volstaan wordt hij voorkeur een flinke overmaat* liefst een vijfvoudige overmaat aan amine en re-5 ductiemiddel toegepast ► Als medium waarin deze reactie plaatsvindt * kan ieder oplosmiddel dat de betreffende reactanten toereikend oplost worden gebruikt* liefst wordt een alcohol toegepast. Methanol is zeer geschikt gebleken. Om de gewenste glycolipiden in een zuivere vorm te verkrijgen* worden ze na droogdampen van het' reactxemengsel in een hydro-10 foob oplosmiddel* bijvoorbeeld chloroform,, opgenomen, hieraan een gelijk volume water toegevoegd* dit geheel door schudden tot een emulsie gemaakt* de emulsie-tussen-Iaag door centrifugeren geïsoleerd en uit. deze- tussenlaag het gewenste glycolipxde verkregen* Ook kunnen de glycolipiden worden geïsoleerd door een water/methanol-oplossing van 15 de reactieprodukten en de uitgangsmaterialen enige malen met een hydrofoob oplosmiddel te wassen* waardoor het- vrije- en omomgezette vetamine wordt verwijderd, de water-methanol-oplossing droog te vriezen en het residu in bijvoorbeeld· chloroform/methanol op te nemen* De- onomgezette-oligosacchariden en reductiemiddelen gaan daarbij niet- in oplossing 20 en kunnen worden af gefiltreerd. De oplossing bevat zuiver glycolipxde.

De liposomen worden in principe bereid analoog beschreven in de J. Mol. Biol. 13 * 238 (1965) en Immunology 37» 503 (1979)·· Zij bestaan uit een lipide dubbellaag, die meestal is opgebonwd uit fosfolipi-den* zoals lecithinen, en een sterol, veelal cholesterol, waarvan de po— 25 laire groepen de dubbellaag begrenzen. Tussen de verschillende dubbellagen bevinden zich compartimenten. Deze compartimenten vormen de ruimten waar de bovengenoemde glycolipiden aan de liposomen worden verankerd. Daartoe worden passende hoeveelheden fosfolipide (lecithine), sterol en glycolipxde opgelost, vervolgens drooggedampt, in een passende, liefst 30 fysiologische zoutoplossing opgenomen en korte tijd ultrasoon getrild.

Aldus worden vloeistof-suspensies verkregen, die bij inspuiten in zoogdieren, hieraan een goede en duurzame Immuniteit tegen de bacteriën, waarvan de oorspronkelijke polysacchariden afkomstig zijn, verlenen. Werden bijvoorbeeld muizen ingespoten met een als boven ver-35 kregen liposoam met een beladingsgraad van ca. 5 mol% glycolipxde in een hoeveelheid van 1 n Mol glycolipxde en 7 dagen later met een dodelijke 82 0 25Tl - -.........“.....-.............— Γ . 1 '........ Γ" ' ” 1 ; it- dosis, van de bacterie,, waarvan het glycolipide herkomstig was , dan bleken, alle muizen beschermd. Werd. echter in plaats van het op liposoom verankerde glycolipide met een overeenkomstige hoeveelheid van het oorspron-. kelijka· polysaccharide., een overeenkomstige hoeveelheid daaruit bereid 5 oligosaccharide of' onbeladen, liposoom geïmmuniseerd, dan bleek een inspuiting T dagen later van een dodelijke dosis van het betreffende· organisme, alle proefdieren te doden. De te bhreiken immuniteit is voorts specifiek·' gebleken. Bij immunisatie met oligosaccharide-liposomen die ; · uitsluitend afkomstig waren van Str. pneumoniae type XII,· werd. geen TO enkele immuniteit tegen bijvoorbeeld type IX verkregen. Een inspuiting' met een dodelijke dosis van de laatste was ook na een onderhavige- immu-' nisatie tegen type- III even fataal als. tevoren.

Voor de bereiding van een definitief vaccin kan als gebruikelijk nog een adjuvans worden toegevoegd,, bijvoorbeeld in de vorm. 15 van dimethyi-dioctadecylammoniumbromide, dat in de onderhavige vaccins goed voldoet.

Het was- uitgesproken, verrassend,, dat aldus· behandelde polysacchariden (gehydrolyseerd, reductief geamineerd en aan liposoom. verankerd) niet. alleen nog een duidelijke immuniteit verleenden, maar 20 zelfs een aanmerkelijk verbeterde en langer aanhoudende immuniteit' deden ontstaan.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe zonder deze tot dit voorbeeld-materiaal te beperken.

Voorbeeld Γ 25 Bereiding van een actieve oligosaccharide-fractie

Streptococcus pneumoniae type III werd na isolatie b dagen gekweekt op· een hersen-hart-infusie-bouillon. (Difco) met daarin 2 g/1 glucose en 5 g/l NaHCO^. Na afloop hiervan werden de cellen'geïsoleerd, met 2N natronloog geneutraliseerd en 5 g/l calciumchloride aan deze cel-30 suspensie toegevoegd. Er vormde zich een neerslag van onzuiver kapsel-polysaccharide, dat tweemaal met een ca. 20-voudige hoeveelheid gedestilleerd water werd uitgewassen. Dit neerslag werd met Whatman 50 filtreer-papier afgefiltreerd. Hierna werd dit neerslag ter zuivering opgelost in

O

met 8 cur per liter- ^N HC1 aangezuurd water en met 2 volumedelen 96%' s 35 ethanol neergeslagen en met 75$'s ethanol uitgewassen. Het residu werd in net voldoende gedestilleerd water opgelost, de. pH met weinig natronloog op 10 gebracht en opnieuw met ethanol van 96% neergeslagen. Na uit- 8202527 , i 5 É wassen-met T5$rs ethanol werd het residu wederom opgelost in. net voldoende gedestilleerd waterr OA g/1 natriumacetaat toegevoegd en wederom, met 96/5’s. ethanol neergeslagen. Restanten eiwit werden ten slotte ver-; wi j der d. door dit laatste neerslag ia gedestilleerd water op te lossen 5 en deze· oplossing-te· schudden met T A volume van- een mengsel chloroform: hutanolrijsazijn (20 : h : t volumina) en de waterfase af' te scheiden.

Na. nogmaals- precipiteren met ethanol en: opnemen in water werd gevriesdroogd. Aldus werden de: zuivere, kapsel-polysacchariden geïsoleerd.

300 mg van- deze kapsel-polysacchariden werden opgelost 3 .3 10 xn 15- cm· gedestilleerd water,, hieraan. 15 cm 2ΪΓ H^SO^ toegevoegd en dit geheel 30 minuten op TQQ°C verhit . Vervolgens werd met bariumhydro— xyde: geneutraliseerd en het daarbij gevormde- BaSOj,-neerslag afgecentri- ^ 3 fugeerd. Het centrifugaat werd drooggevroren en opgelost xn 10 cm water. De gevormde olxgosacchariden werden gefractioneerd over een kolom 15 Sèphadex O. 25 superfine- van Pharmacia (130 x 2,2 cm), waarbij werd ge-elueerd met gedestilleerd water. De uitvloeiende fracties werden op oligosaccharide onderzocht door detectie met een Uvicord S bij 206 nm,„ met' dexferan-blauw en K^Cr^O^ .

De afzonderlijke oligosaccharide· houdende fracties 20 werden naar hun loopsnelheid door Bio-Gel PA in fracties van verschillende ketenlengte gescheiden. Op dunne-laag-chromatografie-platen (met loopmiddel butanol:pyridine.:water (6:5:5 volumina.) en gaschromato-grafisch werd de ketenlengte· bepaald volgens Tsai (Anal. Biochem. 36, 11 i • (1979)» Vervolgens werden deze fracties op hun vermogen getest om een 25 antigeenrantilichaam-reactie van de oorspronkelijke polysacchariden te remmen... De oligosaccharide-fractie, die deze reactie het' sterkst remt, concurreeert het beste met de oorspronkelijke polysacchariden, heeft dus de meeste affinitiet jegens de antiliehamea en heeft dus: de beste immunogene 'eigenschappen. Dit bleek de oligosaccharide-fractie met 6 mono-30 saccharide-eenheden. De oligosaccharide-fracties, verkregen na de Sepha-dex-fractionering met als hoofdbestanddeel een oligosaccharide met 6 mo-nosaccharide-eenheden werden hierop samengevoegd en voor de volgende proeven gebruikt.

Voorbeeld II

35 30 mg· van de oligomeer-fractie, dia volgens voorbeeld I

3 werd verkregen werd opgelost xn 2,0 cm van een mengsel van THF en water -82 0 25 2 7 - ------------- -TV Λ> : : 6 I : ........

«* · (5 : 2) en hieraan onder roeren 36 mg· stearylamine en 5 mg HaCHBH^ toegevoegd: en de pE op· 8 ingesteld. Vervolgens werd 1Ö dagen bij kamertemperatuur geroerd. Het reaetiemengseX werd na afloop dnnnelaag-chromato— grafisch onderzocht, (met loopmiddel chloroform : methanol water (13 : 5 5:1 volumina)waarbij bleek dat geen onomgezet oligosaccharide-ma- teriaal meer aanwezig was·. De gevormde glycolipiden werden geïsoleerd door het reaetiemengseX onder verminderde druk droog te dampen,, het residu op·..te lossen in. chloroform, een gelijk volume water toe te voegen, te schudden·, en. de daarbij gevormde emulsie-tussenlaag door centrifugeren 10 te isoleren. Deze laag werd vervolgens drooggedampt♦

Voorbeeld IH

^3*8 mg- (30 nmol) van het volgens' voorbeeld II verkregen! glycolipide werd in chloroform r methanoX (3 : T volumina) opgelost.

3

Deze oplossing werd in een rondbodem van 50 cm samengevoegd met een 15 chloroform-oplossing van 37^,5 mg (510 nmol) dipalmitoyl-L-a-fosfatidyl- choline· en een chloroform-oplossing van 23,2 kg (60- mmol) .'cholesterol.

Ha voorzichtig verdampen van de- chloroform bij' 37°0 vormde· zich een 3 dunne· film op. de wand. van de rondbodem. Toegevoegd werd 15 cm. van een met fosfaat gebufferde, fysiologische zoutoplossing, waarna voorzichtig 20- gedurende 10 minuten bij 6l°C werd geschud. Vervolgens werd het geheel 1 uur bij kamertemperatuur weggezet, drie maal 30 seconden met een tussentijd van telkens 15 seconden ultrasoon met een amplitude van T yum getrild en de suspensie ten minste 1 uur bij kamertemperatuur weggezet.

Aldus werd een liposoom met daarop verankerd een volgens voorbeeld IV ver-25 kregen glycolipide verkregen.

Voorbeeld IV

Vrouwelijke muizen van 10 weken oud werden ingespoten met oplopende hoeveelheden van het volgens voorbeeld III verkregen materiaal en wel tot een hoeveelheid, die overeenkwam met 30 nmol glyco-30 lipide (verankerd in liposoom). Ha 7 dagen werd elke groep i.p. ingespoten met een 25-voudige lethale dosis van Str. pneumoniae type III.

Vanaf een dosis overeenkomende met 0,5 nmol glycolipide bleek de bescherming effectief. Alle controledieren stierven, alle met meer dan 0,5 nmol verankerd glycolipide geïmmuniseerde dieren bleven in leven.

35 Deze bescherming is specifiek voor Str. pneumoniae· type III, want een latere inspuiting van Str. pneumoniae type IX bleek voor deze proefdieren dodelijk.

""8202527

Claims (7)

1- Vaccins^ tegen door bacteriën; met kapsel-polysacchariden. verwette ziekten, met het kenmerk* dat deze vaccins· geschikte oligosaccha'-riden. "bevatten*, welke via. alkylaminen,. desgewenst gesubstitueerd: door bijvoorbeeld alkylaryl, met - 22' koolstof at amen, of' andere aminen,. 5 zoals- die uit de reeks van de f osfatidylethanolaminen * in een lipo— i soom zijn verankerd-

2. Vaccin'volgens conclusie 1, met het-kenmerk, dat in het liposoom oligosacchariden afkomstig uit polysacchariden van, eventueel verschillende,, ziekte verwekkende bacteriën zijn verankerd- 10. 3- Vaccin volgens- conclusie 1 of 2, met het. kenmerk, dat de oligosacchariden afkomstig zijn. van polysacchariden van Streptococcus ' • pneumoniae- ίί·. Vaccin, volgens conclusies 1 - 3* met het kenmerk, dat. de oligosacchariden per molecuul 2 — T2, bij voorkeur 6 — 10 monosaccha— 15 ride-eenheden tellen..

5- Vaccin volgens conclusies 1 - met het kenmerk, dat het alkylamine een primair lipofiel alkylamine met 16 — 20 koolstof— aminen is.

6- Vaccin volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat 20 het liposoom is opgebouwd· uit een. dubbellaag van. een fosfolipide en een sterol. T. Vaccin volgens conclusies 1-6, met het kenmerk, dat het tevens een adjuvans bevat.

8. Vaccin volgens conclusie T, met het kenmerk, dat het 25 adjuvans dimethyl-dioctadecylammoniumbromide is.

9. Werkwijze voor het bereiden van een vaccin, gericht tegen infecties door bacteriën met kapsel-polysacchariden, met het kenmerk, dat men deze kapsel-polysacchariden tot oligosacchariden. met 6 — 10 monosaccharide-eenheden hyirolyseert, de verkregen oligosacchariden met 30 immunogene activiteit selecteert en reductief amineert met een alkylamine, desgewenst gesubstitueerd, door bijvoorbeeld alkylaryl, met -22 koolstofatomen, of andere aminen, zoals die uit. de reeks van de fosfa— tidylethanolaminen, en de daarbij verkregen glycolipiden in een liposoom verankert. 82 02 5 2 7............. ~9~- - +» i ~ " " " '. \ · . I i * 8

10. Werkwijze volgens conclusie 9r met het kenmerk,, dat men de kapsel-polysaechariden van. Streptococcus pneumoniae door· hydrolyse,, bijvoorbeeld enzymatische.· of zure hydrolyse,, tot. oligosacchariden met 6-8 monosaccharide-eenheden. afbreekt, deze oligosacchariden met een. 5 primair lipofiel alkylami ne- met 16 — 20' koolstof atomen en KaCÏÏBÏÏ^ ami— neert en de verkregen: glycolipiden door een. reactie met lecithine en een sterol, in een. liposoom verankert.» -..........82 6 2 5 2 7--------------------------------------------------------- -...........-