JPS59501160A - 莢膜ポリサッカライドを有する病原性細菌に対するワクチン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 莢膜ホリサ、カライドを有する病原性細菌に対するワクチン及びその製造方法 この発明は莢膜ポリサッカライド（Ｃａｐｓｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ ｄｅ　）を有する病原性細菌及びこの種類のワクチンの製造方法に関する。

莢膜ポリサッカライドによシ包囲された細菌、病原性ワクチンが問題である。こ の莢膜ポリサッカライドは、唐者の細胞による食菌作用に対して細菌を非常に効 果的に保護する。このため、ヒト及び動物〒の、１５１Ｊサツカライドに対する 抗体の産生を特異的に刺激するワクチンを見出すことが試みられている。

このような抗体が保護莢膜と反応した後、感染細胞のその後の破壊は急速であり 確実である。前記の種類の細菌の無傷（１ｎｔａｃｔ　）の莢膜ホリサッカライ ドを基礎にするワクチンを用いる試験により、この種のワクチンは限定された効 果を有することが明らかになった。これらの２リサツカライドは複数の反復単位 ７１≧ら成るため、このポリサッカライドからのオリゴサツカライドの形の分解 生成物がより効果的であるか否かが試験された。事実、２〜１２、好ましくは６ 〜１０のモノサッカライド単位を有するオリゴサツカライド区分が、蛋白質担体 上に存在する場合、強い抗原活性を発揮することが見出された。

しかしながら、この種の万すゴサ、カライドをヒト及び動物に投与する場合、こ れらがその抗原活性を発揮する前又は無傷のポリサッカライドに対する抗原の産 訃を刺激する前に、体内でしばしば分解されることか、追加の試験により明らか になった。従って、この発明唇おいては、オリゴサツカライドを、これらが患者 の体内での分解に対して適切に保護されそしてヒト又は動物の抗体産生が十分に 刺激され得る形で投与する可能性を追求した。この発明に従えは、オリゴゞす、 カライドが、炭素原子数１４〜２２個の親脂性第一アルキルアミン、又は強い疎 水性部分を有する他のアミン類、例えば一連のホスファチツルエタノールアミン からのアミンを介してリポゾーム中に捕捉された場合、前記のような保護が達成 される。この発明のワクチンはアルキルアミンを介してリポゾームに捕捉された オリゴサツカライドを含んで成る。

種々の細菌に由来するオリゴサツカライドをリポゾーム中に捕捉することにより 、種々の細菌に対する多価ワクチンが得られる。しかしながら、化学的経路に従 って製造されたオリゴサツカライドを使用することも可能である。

この発明Ｏワクチンの部分を下記する。

最も活囲なオリゴサツカライド区分を得るために、無傷の２リサツカライドから 出発する。後者は、該当する細菌を適切な発酵培地中で培養し、得られた培養物 をアルカリ性＠液で甲和し、ポリサッカライドを塩化カルシウム又は他の適当な 塩により沈澱せしめ、水で洗浄し、そして酸、塩基又は塩の溶液に再溶解しそし て次に例えばエタノール又はアセトンで沈澱せしめることを数回反復することに より得られる。このようにして、十分に純粋なポリサッカ２１１区分が最終的に 得られる。これから、部分加水分解により所望のオリゴサツカライドが得られる 。

この加水分解は、酵素的に又は化学的に、特に酸加水分解により行うことができ る。得られた。ｆｅ　１７サツ力ライド区分を酸性媒体中である期１間加熱する ことによシ所望のオリゴサツカライド区分が得られる。

通常、ＩＮ酸溶液中で１００℃にて３０分間加熱するのが最適である。前記酸性 加水分解により、２〜多数のサツカライド単位を■する多数のオＩＪ　、Ｓサツ カライドが得られる。これらのオリゴサツカライドは、クロマトグラフィーによ り、例えばセフアゾ。

クスにより分離することができ、こうして異る鎖長４ のオリゴサツカライドが回収されそして分離される。

最も活性な区分は分子当り６〜８のモノサッカライド単位を有する区分である。

この区分は、薄層クロマトクラフィー、気−液クロマトグラフイー、マススペク トル及び核磁気共鳴唇より同定することができる。

こうして得られたオリゴサツカライド区分ハリポゾームに直接に結合することは できず、これらを捷ずグリコリピドの形に変える。こうするだめの最良の方法は 、オリゴサツカライドを、アルキルアミン及び還元剤、例えばＮａ　ＣＮＢＨ３ を用いて還元的にアミン化する方法である。この方法は、非結合オリゴサツカラ イドの大部分が消失するまで７〜１４日間室温において行われる。この反応は薄 層クロマトグラフィ、−によりチェ、りする。合理的な反応時間にわたって、好 ましくは大過剰の、好ましくは５倍過剰量のアミン及び還元剤を適用する。この 反応が生ずる媒体として、この反応体を十分に溶解する任意の溶剤を使用するこ とかでさる。

目的つグリコリピドを純粋な形で得るため、反応混合物を蒸発乾燥した後、疎水 性浴剤、例えばクロロホルムに入れ、この後同容量の水を加え、混合物全体を振 とうしてエマルジョンを得、このエマルション中間層を遠心分離によ部分離し、 目的Ｄグリコリピドを中間層から回収する。グリコリピドは、反応生成物及び出 発物質の＠液を疎水性溶剤により数回洗浄することにより遊離のそして転換され ていないアルキルアミンを除去し、次に水／メタノール溶液を凍結乾燥し、そし て残渣を例えばクロロホルム／メタノールに溶解することによっても回収するこ とができる。未転換オリゴサツカライド及び還元剤は溶解せず、そして濾過する ことができない。溶液は純粋なグリコリピドを含有する。

記載されている方法により調製する。す２シームは脂質二重層から成り、ホスホ リピド、例えばレンチント、ステロール、通常’ｔ”ｉコレステロールドカラ、 通常は構成され、その極性基が二重層を限定する。

種々の二重層の間に区画室が存在する。前記のグリコリピドはリボゾームの脂質 二重層に捕捉される。

従って、適切な量のホスホリピド（し／チン）、ステロール及びグリコリピドを 溶解し、次にこの溶液を乾燥し、残渣を適当な、好ましくは生理的塩溶液中で処 理し、そして短時間にわたり超音波振動処理する。

こうして懸濁液を得る。このものは、動物に注射した場合、出発ポリサッカライ ドを得た細菌に対して良好で且つ持続的な免疫を供する。例えば、約５モル係の グリコリピドのチャーゾ量を有する上記のリポゾーム懸濁液を、１１モルのグリ コリピドの量においで、マウスに注射し、そして７日間後に、グリコリピドの炭 水化物部分を得た雑菌の致死量を注射した場合、すべてのマウスが保護された。

しかしなから、リポゾーム中に捕捉されたグリコリピドを、対応量の出発ポリサ ッカライド、このぼりサツカライドから調製されたオリゴ゛す、カライドで置き 換えた場合又は負荷されていないリノ／−ムを用いて免疫した場合、７日後に前 記微生物り致死量を注射することによりすべての試験動物が死亡した。さらに、 得られた免疫は特異的であった。Ｓｔｒ、ニューモニアタイプ■のみに由来する オリゴサ、カライドーリホズームを用いる免疫処理によシ、し１］えばタイプ■ に対する免疫は全く得られなかった。タイプ■に対する前記免疫処理後の後者の 細菌の致死量の注射は、前の場合と同様致死的であった。

最終的なワクチンの製造のために、アジュバントを常法通り、例えばノメチルー ノオクタデ／ルーアンモニウムプロミドの形で刃口えることができ、このものは この発明Ｏワクチンにおいて満足すべきものである。

このようにして（加水分解、還元的アミン化、及びリボゾームへの捕捉）処理さ れたポリサッカライドは明確な免疫を供するのみならず、相当に改良されたそし て長時間持続する免疫を生じさせることは非常に驚くべきことであった。

さらにこの発明を説明するために次に例を記載するが、これによりこの発明を限 定するものではない。

タイプ■を、２１／ｌのグルコース及び５１／ｌのＮ　ａ　ＨＣＯ３を含有する ブレ、インーーーートーインフーーソヨンブロス（ディフコ）上で４日間培養し た。この後、細胞を回収し、２Ｎ水酸化ナトＩＪウムで中和し、そして示田柄粁 １゛蜀ｆ夜に５９　／　ｌの塩化カルシウムを加えた。玉押な莢膜Ｉリサ、カラ イドの沈澱を生成せしめ、これを約２０倍量の蒸留水で２回洗浄した。

この沈澱をワットマン５０Ｐ紙により濾過しだ。この後、前記の沈澱を精製のた めに水に溶解し、８ｃｒｎ５／ｌの４Ｎ塩酸てより酸性化し、２容量部の９６％ エタノールで沈澱せしめ、そして７５％のエタノールで洗浄した。残渣をちょう ど十分量の蒸留水に溶解し、そして少量の水酸化ナトリウムによりＰＨをｌＯに 調整した後、９６％エタノールにより再度沈澱せしめた。７５乃のエタノールで 洗浄した後、残渣をちょうど十分量の蒸留水に再溶解し、そして８ ０．４ｇ／ｌの酢酸ナトリウムを加えた後９６チエタノールによシ再度沈澱せし めた。最後に、この沈澱を蒸留水に溶解し、この溶液をクロロポルム：ブタノー ル゛氷酢酸（２０：４：１容量比）の混合物１／４容量と共に振とうし、そして 水相を分離することにより残留蛋白質を除去した。再びエタノールで沈澱せしめ た後、水に溶解し、生成物を凍結乾燥した。このようにして純粋な莢膜ポリサッ カライドを分離した。

３００ｍ９・の前記莢膜ポリサッカライドを１５　ｔｙｎ５の蒸留水に溶解し、 これに１５ｃｒｎ３の２Ｎ硫酸を加え、そしてこの全体を１００℃にて３０分間 加熱した。

次にこれを水酸化バリウムにより中和し、生じた硫酸バリウム沈澱を遠心分離ｊ た。上清液を凍結乾燥し、゛そして１０（７）６の水に溶解した。生成したオリ ゴサツカライドを、蒸留水を用いながら、ファルマシアのセファデックスＧ２５ （微粉）のカラム（１３゜Ｘ　２．５　ｃｍ　）を通して分画した。溶出区分を 、デキストラノーブルー及びに２Ｃｒ２０７をカラムマーカーとして用いながら 、ユビコードＳを用いて２０６ＭＷ＋において検出することにより、オリゴサツ カライドについて試験した。

オリゴサツカライドき有区分を、ビオーケ゛ルｐ−４を用いてさらに精製した。

薄層クロマトグラフ板上で〔ｎ−ブタノール：ピリノン：水（６：５：５容量比 〕〕、及びガスクロマトグラフィーを用いて、Ｔｓａｉ［Ａｎａｌ−Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、３６　、１１４（１９７９）］に従って鎖長を測定した。次にこれらの区 分を、もとのポリサッカライドの抗原−抗体反応を阻害する能力について試験し た。前記の反応を最も強く阻害するオリコゝザッカライド区分は、もとのポリサ ッカライドと最も良く競争し、従って抗体に対する最も高い親和性を有しており 、従って抗原決定基を含有する。

これは、６のモノサッカライド単位を有するオリゴサツカライド区分である。こ の後、ビオーケ゛ルｐ−４分画の後に得られた、６のモノサッカライド単位を有 するオリゴゞす、カライドを有するオリゴゞす、カライド区分を一緒にし、そし て次の試験のために使用した。

列２ 汐１］１に従って得られた３０ｍ９のオリゴマー区分を、ＴＨＦ及び水（５：２ ）の混合物２ｏα２に溶解し、そして攪拌しながら３６ｍ９のステアリルアミン 及び５ｍ９のＮａＣＮＢＨ４をこれに加え、そしてＰＨを８に調整した。次に、 混合物を室温にて１０日間攪拌した。この後、反応混合物を薄層クロマトグラフ ィー〔クロロホルム、メタノール：水Ｃ容量比１３　：　５　：　ｌ　）により 溶出〕にかけた。未転換オリゴサツカライド０ 材料はもはや存在しなかった。反応混合物を減圧下で蒸発乾燥し、残渣をクロロ ホルムに溶解し、同容量の水を加え、振とうし、そして生成したエマルション中 間層を遠心分離により分離することによって、生成したグリコリピドを回収した 。次に前記の層を蒸発乾燥した。

ｇＡｊ３゜ 汐１１２に従って得られた４３．８１１１９（３０ｎモル）のグリコリピドをク ロロホルム：メタノール（容量比３：１）に溶解した。５０　ｔｙｎ’の丸底フ ラスコ中で、モル）のコレステロールの、容液と一緒にした。３７℃にて注意深 くクロロホルムを蒸発せしめた後、丸底フラスコの室に薄層が形成された。燐蛮 塩で緩衝化した生理的塩溶液１５　ｃｍ３を加え、この後こｎを６１℃において １０分間注意深く振とうした。次に、１時間室温に放置し、■期間に１５秒間の 中間期間を伴って３０秒間にわたり７μｍの強度で超音波振動処理した。こうし て、ｆＦＵ２に従って製造されたグリコリピドを中に捕捉したりポゾームを得た 。このりＩシーム標品を室温に１時装置いた後動物を免疫するのに使用した。

１０週齢の雌性マウスに、列３に従って製造された材料を増加する量で、すなわ ち３０ｎモルのグリコリピド（リポゾームに捕捉されている）に対応する量まで 注射した。７週間後、方群に、致死量の２５　倍量ノ５ｔｒ−，ニューモニアタ イプ■を腹腔内圧射した。０．５ｎモルに対応する量以上のグリコリピドにより 保護が効果的に生じた。対照動物・はすべで死亡し、０．５ｎモル以上の捕捉グ リコリピドにより免疫されたすべての動物が生存を続けた。この保護は比的であ った。

国際調量報告 ＩｎｍｎａＩ′ｏｍｌ　Ａ＋＋９１１ｃａｌｌｏｆｉ　ＮＬ　ＰＣＴ／ＮＬ　８ ３１０００２４第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　炭素原子数１４〜２２個のアルキルアミン、又は一連のホスファチノルエ タノールアミンからのアミンのような他のアミンを介してリポゾーム中に捕捉さ れた適当なオリゴサツカライドを含有すると原細菌に対するワクチン。 ２　リポゾーム中に、異なっていてもよい病原細菌のポリサッカライドに由来す るオリゴ”？、カライドを含有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のワ クチン。 特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のワクくは６〜ｌＯのモノサッカラ イド単位を有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に 記載のワクチン。 ５、　アルキルアミンが炭素原子数１６〜２０個の親脂性第一アルキルアミンで あることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項記載のワクチン。 ６　り醪ゾ〜ムがホスホリピド及びステロールの二重層から成ることを特徴とす る請求の範囲第１項〜第５項記載のワクチン。 ７　さらにアジ−パントを含有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項 のいずれか１項に記載のワクチン。 ８　アノユバントがノメチルージオクタデシルアンモニウムブロミドであること を特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。 ９、莢膜ポリサッカライドを有する細菌による感染に対するワクチンの製造方法 において、前記ポリサッカライドを加水分解して６〜１０のモノサッカライド単 位を有するオリゴサツカライドにし、抗原決定基を含有する得られたオリゴサツ カライドを選択し、そして炭素原子数１４〜２２個のアルキルアミン、又は一連 のホスファチジルエタノールアミンからのアミンのような他のアミンにより還元 的にアミノ化し、そして得られたグリコリピドをり？シームに捕捉することを特 徴とする方法。 １０、ストレプトコ、”カス・ニューモニアの莢膜ポリサッカライドを加水分解 により、例えば酵素的に又は酸加水分解的に分解して６〜８のモノサ、ツカライ ド単位を有するオリゴサツカライドにし、このオリゴサツカライドを、炭素原子 数１６〜２０個の親脂性第一アルキルアミン及びＮａＣＮＢＨ４により還元的に アミン化し、そして得られたグリコリピドをレシ１４ チン及びステロールを使用するりポゾームに捕捉することを特徴とする請求の範 囲第９項記載の方法。