CN103110583A - 一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，改良了绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，提供了一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备方法。本发明所述的方法筛选到理想的绵羊肺炎支原体高效灭活疫苗佐剂，并使抗原内毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。疫苗免疫羊只后，抗体产生早、效价高、持续时间长，可有效防控绵羊肺炎支原体感染。

Description

一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺

技术领域    

     本发明涉及兽用生物制品中绵羊肺炎支原体灭活疫苗，具体涉及绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺。

背景技术    

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）引起绵羊及山羊非典型肺炎，临床上以流鼻涕、咳嗽、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎为主要特征。1963年Mackay等首次从患肺炎的绵羊肺中分离得到MO，此后在其它多个国家和地区相继报道MO感染引起绵羊和山羊发病。目前绵羊肺炎支原体在全球范围内分布，近年来该病的发生率呈逐年上升趋势，给养羊业造成巨大经济损失。此外，羊只感染绵羊肺炎支原体后，对其它病原（如多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌及流感病毒）的易感性明显增加（[1]Dassanayake RP, Shanthalingam S, Herndon CN, Subramaniam R, Lawrence PK, Bavananthasivam J, Cassirer EF, Haldorson GJ, Foreyt WJ, Rurangirwa FR, Knowles DP, Besser TE, Srikumaran S. Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatal Mannheimia haemolytica pneumonia. Vet Microbiol., 2010, 145(3-4): 354-359.），从而使其危害性更为突出。绵羊肺炎支原体在我国流行同样十分广泛，危害严重（[2]郭晗, 储岳峰, 赵萍, 高鹏程, 贺英, 冯晓明, 樊祜卿, 逯忠新. 青海省绵羊肺炎支原体的血清学调查. 安徽农业科学, 2009, 37(33): 16391-16409.[3]张萍慧, 郝永清, 张爱荣, 范利霞, 白龙. 绵羊肺炎支原体的分离与鉴定. 畜牧与饲料科学, 2010, 31(1): 142-143.[4]王华，杨发龙，王永，汤承. 四川省山羊支原体性肺炎流行病学调查, 中国畜牧兽医，2011, 38(1): 210-213.），对该病的综合防治迫在眉睫。

针对绵羊肺炎支原体，采用药物治疗可收到一定效果，但不易根治本病，且存在药物残留、对肉质的影响及用药后易产生耐药株等一系列问题。因此，研制安全有效的疫苗，实施预防免疫是防控MO感染最为有效的方法。在疫苗研制方面，由于支原体的基因组较小，生物合成能力较弱，免疫原性较差，在实际应用中保护率低，一直是生产中需要解决的问题。此外，影响疫苗免疫效果的关键在于疫苗的制备工艺，其中抗原内毒素的含量和佐剂的选用对疫苗质量的影响很大。为了提高疫苗的安全性，必须降低抗原内毒素的含量；为了提高抗原的免疫原性，必须在抗原中添加佐剂以增强其诱导免疫反应的能力（[5]Cupla R K, Relyve E H, Lindblad E B, et al. Adjuvant balance between luxieity and adjuvanlicity[J]. Vaccine, 1993, 11: 293-306）。佐剂的种类很多,不同的佐剂免疫增强效力有所不同。目前未见制备绵羊肺炎支原体灭活疫苗去除抗原内毒素及不同佐剂免疫辅佐效力评价的报道。

发明内容  

      鉴于现有技术的不足，本发明的目的是改良绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，制备一种安全有效的绵羊肺炎支原体灭活疫苗。本发明使抗原内毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。另外，本发明还筛选到理想的绵羊肺炎支原体高效灭活疫苗佐剂。疫苗免疫羊只后，抗体产生早、效价高、持续时间长，可有效防控绵羊肺炎支原体感染。

附图说明  

图1 绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫羊血清抗体效价

具体实施方式

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

1.抗原制备

（1）培养基的制备

   采用改良Thiaucourt’s培养基。培养基成分如下：PPLO肉汤 21.0 g，新鲜酵母浸出液 100 mL，灭活马血清200 mL，0.5g/ml的葡萄糖2ml，0.5g/mL的丙酮酸钠8 ml，0.5%酚红3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸铊 0.1 g，用去离子水补足到1000 mL，调节pH值7.6～7.8，经0.22μm细菌滤器过滤除菌后分装，于4℃保存备用。

（2）绵羊肺炎支原体的增殖

取绵羊肺炎支原体冻干菌种加入1 mL改良Thiaucourt’s培养基溶解，将1 mL菌液接入10 mL改良Thiaucourt’s培养基，37 C°160 rpm摇床培养48 h（培养基颜色由红色逐渐变成橙黄色，菌液澄清透亮、无菌膜、无混浊现象）时收获；将第一代培养物按3%接种量接种于改良Thiaucourt’s培养基，置于37 ℃条件下160 r/min空气浴摇床培养20 h，连续传代至第4代，测定其活菌滴度即颜色变化单位（color chang unite，CCU）（[5]Loens K,Mackay W G,Scott C,et al.Amulticenter pilot external quality asscssment programme to assess the quality of molecular detection of Chlamydophila pneumonia and Mycoplasma pneumonia.J Microbiol Meth.2010）。

（3）绵羊肺炎支原体培养物的浓缩

取绵羊肺炎支原体培养物12000rpm离心30min，菌体用pH7.2  0.15mol/L 的PBS重悬，将浓度调整至10⁹ CCU/mL。

（4）抗原灭活及内毒素的去除

将浓缩后的培养物置60 ℃水浴1 h，加入0.05%甲醛（v/v）及终浓度0.02%的重铬酸钾溶液，置37 ℃ 160 r/min空气浴摇床24h，进行灭活和去除内毒素。

（5）灭活检验

随机抽样灭活的绵羊肺炎支原体，分别接种改良Thiaucourt’s培养基 2支，置37 ℃，160 r/min空气浴摇床培养3日，无支原体生长者为灭活完全。

2.  疫苗配制

采用一步乳化法，制备成油包水型乳剂疫苗

水相成分：向绵羊肺炎支原体灭活抗原中加入万分之一的硫柳汞溶液。水相成分占疫苗总量的30%～35%。

油相成分：ISA-760油佐剂，油相成分占疫苗总量的65%～70%。

乳化方法：将ISA-760佐剂在高速搅拌器中缓慢搅拌乳化1-2 min，然后再取抗原缓慢加入，快速搅拌直至乳化完全，疫苗抗原终浓度为l0⁹ CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳剂灭活苗。

3.  疫苗的物理性状检验及无菌检验

该疫苗为油包水型，外观呈乳白色，3000rpm离心15min不分层。用出口内径为1.2mm的1mL细管，吸取25℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL的时间为4秒。

无菌检验按中华人民共和国兽药典（2005版）附录15页进行，均无细菌生长。

4. 比较试验证实ISA-760佐剂制备的灭活疫苗比白油佐剂、ISA-206佐剂及Buonavoglial’s佐剂制备的灭活疫苗的免疫抗体及达到高峰时间均提早一周，抗体水平高1～2个滴度，且持续时间长（详见实施例2）。因此，ISA-760是理想的绵羊肺炎支原体高效灭活疫苗佐剂。

实施例1  抗原内毒素的测定、疫苗安全检验及效力检验

（1）内毒素的测定

采用动态浊度法测定绵羊肺炎支原体灭活抗原内毒素含量，结果显示重铬酸钾处理后，抗原内毒素含量大大下降。未用重铬酸钾处理的抗原内毒素含量为912 EU/mL，经重铬酸钾处理的抗原内毒素含量仅为38 EU/mL，也就是说，经重络酸钾处理后，抗原内毒素含量降低了24倍，提高了疫苗的安全性。

（2）安全检验

5月龄左右健康成都麻羊5只（用MO间接血凝诊断试剂盒测定其无抗体，用鼻腔棉拭子提取DNA，PCR鉴定无MO），颈部肌肉注射疫苗6ml/只。观察30日，无食欲减退、精神沉郁、体温反应、注射部位炎症等不良反应，且全部健活。

（3）效力检验

12月龄健康山羊10只，分别检测MO抗原和抗体均为阴性，随机分为两组，免疫组和对照组各5只。免疫组颈部肌肉注射疫苗3mL/只，对照组颈部肌肉注射生理盐水3mL/只。免疫后30日，免疫组和对照组山羊气管注射MO培养物10mL/只，观察30日。对照组全部发病，免疫羊保护4只。

实施例2  疫苗佐剂的筛选

     选取灭活疫苗常用的佐剂：白油佐剂、ISA-206佐剂、Buonavoglial’s佐剂及ISA-760佐剂分别与灭活抗原配制成疫苗，免疫健康成年家兔，通过检测其血清抗体水平，评价佐剂对疫苗的辅佐效力，筛选出理想的灭活疫苗佐剂。

方法：

1. 抗原制备：抗原的制备按照具体实施方式所述的方法进行。

2. 灭活疫苗的配制：

（1）白油佐剂灭活疫苗的制备：按抗原体积加入终浓度为3%的灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，制成灭活疫苗水相。水相与白油佐剂的体积比为1:1。将白油佐剂在高速搅拌器中缓慢搅拌乳化1～2 min，然后再取相同体积的水相缓慢加入，直至乳化完全。

（2）ISA-206佐剂灭活疫苗的制备：将抗原和佐剂在33℃孵育15 min之后，将ISA-206佐剂在磁力搅拌器中进行搅拌，再将抗原按质量比1:1加入佐剂中进行乳化，加速搅拌10 min，乳化成水包油包水型双向油乳剂灭活疫苗。

（3）Buonavoglial’s佐剂灭活疫苗的制备：按Domenico等（[6]）介绍的方法配制。

（4）ISA-760佐剂灭活疫苗的制备：按照具体实施方式所述的疫苗配制方法进行。

以上4种佐剂疫苗的抗原终浓度均为10⁹ CCU/mL。疫苗物理性状检验和无菌检验按《中国兽药典》进行。结果显示，这4种佐剂制备的灭活疫苗其物理外观、粘稠度、稳定性、无菌检验等指标均符合要求。

3. 免疫接种及血清抗体检测：每种疫苗免疫家兔3只，每只家兔颈背部皮下分2点注射，每点注射2mL。在免疫后1、2、3、4、5、6、7、8、9周分别经耳缘静脉采血，分离血清，采用MO正向间接血凝诊断试剂盒测定血清抗体水平。

结果：

用MO间接血凝试剂盒测定MO灭活疫苗免疫家兔后的血清效价，抗体消长规律见表1。ISA-206佐剂和白油佐剂制备灭活疫苗免疫家兔后第4周达到抗体高峰（4.33 lg2±0.57 lg2，5.00 lg2±0.00 lg2），免疫后第9周下降约1个滴度；ISA-760和Buonavoglia1’s佐剂制备的灭活疫苗免疫家兔后第3周到达抗体高峰（5.67 lg2±0.70 lg2，6.00 lg2±0.00 lg2），免疫后第9周维持抗体高峰（6.00 lg2±0.00 lg2，6.00 lg2±1.00 lg2）。利用统计软件SPSS18.0对4种佐剂MO灭活疫苗对MO免疫辅佐效力的影响进行统计分析，结果显示，ISA-206佐剂和白油佐剂、ISA-760佐剂、Buonavoglia1’s佐剂制备的MO灭活疫苗对MO免疫辅佐效力的影响差异显著（P＜0.05）；ISA-206佐剂和白油佐剂制备的两种MO灭活疫苗对MO免疫辅佐效力影响差异不显著（P＞0.05）；ISA-760佐剂和Buonavoglia1’s佐剂制备的两种MO灭活疫苗对MO免疫辅佐效力的影响差异显著（P＜0.05）；综上所述，ISA-760佐剂为制备MO灭活疫苗的理想佐剂。

实施例3 疫苗免疫羊只后血清抗体效价的测定

绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备按照具体实施方式所述的制备方法进行。选取5月龄左右健康成都麻羊5只（用MO间接血凝诊断试剂盒测定其无抗体，用鼻腔棉拭子提取DNA，PCR鉴定无MO），颈部肌肉注射疫苗3ml/只，分别于免疫后7d、14d、21d、28d颈静脉采血，分离血清测定血清抗体效价（图1）。

结果表明：疫苗免疫羊只后7天左右产生抗体，抗体效价逐渐升高，持续时间较长。

Claims (1)

1.一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，其特征在于操作步骤如下：

A．抗原制备

(1) 培养基的制备

采用改良Thiaucourt’s培养基；培养基成分如下：PPLO肉汤 21.0 g，新鲜酵母浸出液 100 mL，灭活马血清200 mL，0.5g/ml的葡萄糖2ml，0.5g/mL的丙酮酸钠8 ml，0.5%酚红3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸铊 0.1 g，用去离子水补足到1000 mL，调节pH值7.6～7.8，经0.22μm细菌滤器过滤除菌后分装，于4℃保存备用；

(2) 绵羊肺炎支原体的增殖

取绵羊肺炎支原体冻干菌种加入1 mL改良Thiaucourt’s培养基溶解，将1 mL菌液接入10 mL改良Thiaucourt’s培养基，37℃ 160 rpm摇床培养48 h（培养基颜色由红色逐渐变成橙黄色，菌液澄清透亮、无菌膜、无混浊现象）时收获；将第一代培养物按3%接种量接种于改良Thiaucourt’s培养基，置于37 ℃条件下160 r/min空气浴摇床培养20 h，连续传代至第4代，测定其活菌滴度即颜色变化单位（color chang unite，CCU）；

(3) 绵羊肺炎支原体培养物的浓缩

取绵羊肺炎支原体培养物12000rpm离心30min，菌体用pH7.2  0.15mol/L 的PBS重悬，将浓度调整至109CCU/mL；

(4) 抗原灭活及内毒素的去除  

将浓缩后的培养物置60 ℃水浴1 h，加入0.05%甲醛（v/v）及终浓度0.02%的重铬酸钾溶液，置37 ℃ 160 r/min空气浴摇床24h，进行灭活和去除内毒素；

(5) 灭活检验

随机抽样灭活的绵羊肺炎支原体，分别接种改良Thiaucourt’s培养基 2支，置37 ℃，160 r/min空气浴摇床培养3日，无支原体生长者为灭活完全； 

B. 疫苗配制

采用一步乳化法，制备成油包水型乳剂疫苗

水相成分：向绵羊肺炎支原体灭活抗原中加入万分之一的硫柳汞溶液，水相成分占疫苗总量的30%～35%；

油相成分：ISA-760油佐剂，油相成分占疫苗总量的65%～70%；

乳化方法：将ISA-760佐剂在高速搅拌器中缓慢搅拌乳化1-2 min，然后再取抗原缓慢加入，快速搅拌直至乳化完全，疫苗抗原终浓度为l0⁹ CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳剂灭活苗；

C. 疫苗的物理性状检验及无菌检验

该疫苗为油包水型，外观呈乳白色，3000rpm离心15min不分层；用出口内径为1.2mm的1mL细管，吸取25℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL的时间为4秒；

无菌检验按中华人民共和国兽药典（2005版）附录15页进行，均无细菌生长。

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