CN112972667A - 一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法，所述的疫苗含有绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MMC)以及蜂胶佐剂，采用以下方法制备而成：1、制备支原体培养基；2、支原体的扩增培养；3、支原体培养物的灭活；4、灭活的支原体与蜂胶佐剂混合制成疫苗。本发明的疫苗可同时预防丝状支原体山羊亚种(MMC)和绵羊肺炎支原体(MO)引起的疾病，避免单一病原制备疫苗顾此失彼的缺点，对不同生理状况和年龄的山羊均安全，适用于不同品种、各种年龄的山羊。
Description
技术领域
本发明属于畜牧业动物疫苗技术领域，特别涉及一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
山羊支原体肺炎是指由支原体引起的发生于山羊的一种接触性呼吸道传染病，其临诊特征为高热、咳嗽，胸和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，取急性和慢性经过，发病率在22％～30％，有的高达60％～80％，死亡率在15％～30％。
山羊支原体肺炎的防制面临较大困难，主要原因是其病原学因素复杂。除了我国流行的优势病原丝状支原体山羊亚种(MMC)和绵羊肺炎支原体(MO)外，目前世界上已报道的本病病原还包括山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种和丝状支原体丝状亚种大菌落型。这些病原之间无交叉保护，且各国流行的优势病原不尽相同，加上支原体基因组较小，同一种支原体也易发生变异而导致抗原差异，因此世界各国一般都根据本地具体流行情况针对性地研制适合于本地区的灭活疫苗进行免疫预防。
由于流行于我国的山羊支原体肺炎病原丝状支原体山羊亚种(MMC)和绵羊肺炎支原体(MO)之间缺乏交叉保护，而所致疾病临床上很难区分，且常会混合感染，因此应用单一病原制成的疫苗很难适应我国生产实际，而目前我国还没有可以同时预防这两种病原的二联灭活疫苗。
发明内容
针对现有单一病原制成的疫苗存在的局限性，本发明提供一种可同时预防丝状支原体山羊亚种(MMC)和绵羊肺炎支原体(MO)这两种病原的二联灭活疫苗及其制备方法，用于山羊支原体肺炎的免疫预防。
本发明是通过以下技术方案实现的：
(一)一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，含有绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MMC)以及蜂胶佐剂。
所述的菌种从发病山羊肺组织分离取得，用于制备疫苗的菌种严格控制在其分离取得后传8代以内的代次，在培养基中生长活菌的滴度达1×109CCU/mL。
强毒菌株绵羊肺炎支原体菌株(GXFS20772)和丝状支原体山羊亚种(GXNP1312)均由广西壮族自治区兽医研究所分离鉴定，并已经向广东省微生物菌种保藏中心申请保存。
所述的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照培养基量4％的比例分别将绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)接种于各自的支原体培养基中，于37℃摇床培养5天，至菌液生长滴度达到1×107～1×109CCU/mL，得到初始制苗菌液；取初始制苗菌液于12000r/min下离心3min，弃上清液，沉淀用灭菌生理盐水溶解，最终使绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)的菌浓度均为4×109CCU/mL，得到绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液；
(2)在绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液中分别加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度均为0.15％；充分混匀，在37℃下灭活24～48h，期间摇瓶4～5次，得到灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液；将灭活后的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液接种于支原体培养基中，于37℃下培养5～7d，支原体培养基均无被接种支原体和其他微生物生长即判为灭活完全；
(3)在无菌操作下，取灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液按照1:1混合，得到混合菌液，再于混合菌液中加入蜂胶佐剂，使蜂胶佐剂在混合菌液中的最终含量为10～15mg/mL，充分摇匀，获得山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
(二)山羊支原体肺炎二联灭活疫苗质量标准与使用
(1)疫苗的无菌检验：
将疫苗接种于营养琼脂培养基和支原体培养基中，37℃、5％的CO2下培养3～7d，应无微生物生长。
(2)疫苗的安全性检验：
用体重1.5～2.0kg健康家兔2只各肌肉注射疫苗2ml，观察14天，应无减食、精神沉郁、体温、注射局部炎症等不良反应，均应健活。
(3)疫苗的效力检验：
用0.6～1岁体重25kg左右、且绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种抗体为阴性的山羊7只，分成2组，疫苗组4只，阴性对照组3只。疫苗组每只颈侧皮下注射本发明制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗5mL，阴性对照组每只颈侧皮下注射灭菌生理盐水5mL。30天后都以强毒菌株MO和MMC各自液体培养物制成浓缩混合(MO+MMC)菌液(MO：4×108CCU/mL；MMC：4×108CCU/mL)，每只山羊均气管均接种5mL，临床观察25～30天，剖解观察肺部特征病变，并进行攻毒支原体的分离，阴性对照组3只山羊全部发病，并能分离得相应的攻毒支原体，而疫苗组4只山羊至少有3只得到保护，所制山羊支原体肺炎二联灭活疫苗效力检验为合格。
(4)山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的应用：
疫苗为蜂胶佐剂的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，规格为100mL/瓶，免疫保护期为1年。采用颈部皮下或肌肉注射，注射剂量为半岁以上的羊5mL，半岁以下的羔羊3mL。使用时充分摇匀。疫苗存放于2～8℃环境中保质期暂定12个月。
作为本发明的进一步改进，所述的支原体培养基主要由猪肺消化汤、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鲜酵母浸出液组成，按以下步骤制备：
(1)胰腺提取液的制备
取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500mL ddH2O和500mL无水乙醇，室温下每隔2～4h振荡一次，72h后用滤纸过滤即得；
(2)猪肺消化汤的制备
取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000mL ddH2O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8％的无水NaHCO3 2500mL，混匀后冷至45℃，加入胰腺提取液500mL、氯仿50mL，混匀置37℃下6～7h，之后加浓硫酸40mL，100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1moL/L NaOH溶液调pH至8.0，100℃蒸汽加热1h，趁热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；
(3)1％水解乳蛋白胨Earle液的制备
配制原液甲：NaCl 20.0g，KCl 4.0g，NaH2PO4·2H2O 1.4g，葡萄糖20.0g，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制原液乙：NaCl 2.0g，MgCl2·6H2O 1.7g，0.4％酚红液50mL，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比1:100混合完全溶解，装瓶，115℃高压灭菌20min，冷却即得；
(4)25％新鲜酵母浸出液的制备
将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH2O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却，3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，滤纸初滤后，0.22μL滤膜过滤除菌，即得；
将步骤(2)至(4)获得的猪肺消化汤、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鲜酵母浸出液按体积百分数48％、50％、2％在无菌条件下混合，即得支原体培养基。
作为本发明的进一步改进，所述的蜂胶佐剂的制备方法如下：称取一定质量的蜂胶(W1)，让其充分溶于体积浓度为95％的乙醇(V)中，过滤得到不能溶解的杂质，将杂质风干并称其质量(W2)，滤液为蜂胶佐剂，其蜂胶含量为(W1-W2)mg/V(ml)。
本发明的有益效果如下：
1、从临床支原体肺炎病羊的肺组织中分离取得毒力强、抗原性好的MO和MMC菌株作为制苗的抗原菌，通过适当的工艺而制成的二联蜂胶灭活疫苗，能同时预防MO和MMC的感染，更全面防止山羊支原体肺炎疾病的发生。
2、本发明的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，能同时预防MO和MMC的感染，避免单一病原制备疫苗顾此失彼的缺点，对不同生理状况和年龄的山羊均安全，适用于不同品种、各种年龄的山羊。
3、本发明制备的疫苗采用了生物质蜂胶为佐剂，在机体吸收、应激和增强免疫作用方面均优于铝胶和矿物油等佐剂。
4、本发明使用了高效的支原体培养基，更适应丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的快速生长繁殖，和传统培养基比降低了牛或马血清使用量50％，从而降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备
1、制备支原体培养基：
(1)胰腺提取液的制备
取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500mL ddH2O和500mL无水乙醇，室温下每隔2～4h振荡一次，72h后用滤纸过滤即得；
(2)猪肺消化汤的制备
取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000mL ddH2O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8％的无水NaHCO3 2500mL，混匀后冷至45℃，加入胰腺提取液500mL、氯仿50mL，混匀置37℃下6～7h，之后加浓硫酸40mL，100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1moL/L NaOH溶液调pH至8.0，100℃蒸汽加热1h，趁热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；
(3)1％水解乳蛋白胨Earle液的制备
配制原液甲：NaCl 20.0g，KCl 4.0g，NaH2PO4·2H2O 1.4g，葡萄糖20.0g，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制原液乙：NaCl 2.0g，MgCl2·6H2O 1.7g，0.4％酚红液50mL，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比1:100混合完全溶解，装瓶，115℃高压灭菌20min，冷却即得；
(4)25％新鲜酵母浸出液的制备
将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH2O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却，3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，滤纸初滤后，0.22μL滤膜过滤除菌，即得；
将步骤(2)至(4)获得的猪肺消化汤、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鲜酵母浸出液按体积百分数48％、50％、2％在无菌条件下混合，即得支原体培养基。
2、支原体的培养
按照培养基量4％的比例分别将绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)接种于各自的支原体培养基中，于37℃摇床培养5天，至菌液生长滴度达到1×107～1×109CCU/mL，得到初始制苗菌液；取初始制苗菌液于12000r/min下离心3min，弃上清液，沉淀用灭菌生理盐水溶解，最终使绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)的菌浓度均为4×109CCU/mL，得到绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液；
3、支原体培养物的灭活
在绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液中分别加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度均为0.15％；充分混匀，在37℃下灭活24～48h，期间摇瓶4～5次，得到灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液；将灭活后的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液接种于支原体培养基中，于37℃下培养5～7d，支原体培养基均无被接种支原体和其他微生物生长即判为灭活完全；
4、山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备
在无菌操作下，取灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液按照1:1混合，得到混合菌液，再于混合菌液中加入蜂胶佐剂，使蜂胶佐剂在混合菌液中的最终含量为10～15mg/mL，充分摇匀，获得山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
所述的蜂胶佐剂的制备方法如下：称取一定质量的蜂胶(W1)，让其充分溶于体积浓度为95％的乙醇(V)中，过滤得到不能溶解的杂质，将杂质风干并称其质量(W2)，滤液为蜂胶佐剂，其蜂胶含量为(W1-W2)mg/V(ml)。
实施例2：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的无菌检验
将实施例1制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗接种于营养琼脂培养基和支原体培养基中，37℃、5％的CO2下培养3～7d，均无微生物生长。
实施例3：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的安全性检验
(1)材料：
体重1.5～2.0kg家兔2只。
实施例1所制的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
(2)检验方法：
将实施例1所制的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗摇匀，每只家兔大腿部肌肉注射2mL，正常状态下饲养14天，注射后第1、5、10、14天测温并观察其采食、精神状态和注射部位有无炎症反应。
(3)检验结果
注射疫苗后2只家兔均无异常反应，注射部位无炎症反应，体温均在38.5～39.0℃，说明所制疫苗是安全的。
实施例4：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的效力测定
1、材料
(1)MO和MMC强毒株，支原体培养基；
(2)实施例1制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
(3)0.6～1岁体重25kg左右，MO和MMC抗体阴性的健康山羊7只。
2、测定方法
(1)将7只山羊分成免疫组4只和对照组3只，免疫组每只颈侧皮下注射山羊支原体肺炎二联灭活疫苗5mL，对照组每只颈侧皮下注射灭菌生理盐水5mL，在相同的饲养管理条件下饲养30天。
(2)将MO和MMC强毒株分别接种支原体培养基培养5天，然后根据各自菌液浓度制成的浓缩混合(MO+MMC)菌液，使MO和MMC在其中的含菌均达到4×108CCU/mL，作攻毒用。
(3)攻毒试验前3天所有羊每天测体温1次，然后免疫组和对照组山羊在免疫接种后30天时用步骤(2)制作的(MO+MMC)浓缩混合菌液每只山羊均气管接种5mL，在相同的饲养管理条件下临床观察25～30天，记录每天体温，流涕、咳嗽和呼吸变化的情况以及食欲和精神状态，剖解免疫组和对照组各一只山羊观察肺部特征病变，并从鼻拭子和肺组织中进行攻毒支原体的分离和回收。
(3)测定结果
表1山羊支原体肺炎二联灭活疫苗效力测定结果
表1结果表明：接种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗30天后，免疫组和对照组均以强毒菌株MO和MMC混合菌液进行攻毒试验，阴性对照组3只山羊全部发病，并能从鼻拭子和肺组织中分离得相应的攻毒支原体，而疫苗组4只山羊全部得到保护，可知本发明所制山羊支原体肺炎二联灭活疫苗效力检验为合格。
实施例5：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗免疫有效保护期测定
1、材料
(1)MO和MMC强毒株；支原体培养基；
(2)实施例1制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
(3)0.6～1岁左右、体重25kg大小，MO和MMC抗体阴性的健康山羊10只。
(4)合成特异性引物MMC(序列：5’-CAATCC AGA TCA TAAAAA ACC T-3’；5’-CTCCTCATATTCCCCTAGAA-3’)和MO(序列：5’-TGA ACG GAA TAT GTT AGC TT-3’；5’-GAC TTCATC CTG CAC TCT GT-3’)
2、测定方法
(1)将10只山羊分成免疫组8只和对照组2只，免疫组每只颈侧皮下注射山羊支原体肺炎二联灭活疫苗5mL，对照组每只颈侧皮下注射灭菌生理盐水5mL，在相同的饲养管理条件下饲养。
(2)攻毒用MO和MMC浓缩混合强毒株菌液制作方法同实施例4。
(3)分别在免疫接种后6个月和12个月作攻毒保护试验，每次试验用免疫组4只山羊和对照组1只山羊。具体操作是在攻毒试验前3天所有羊每天测体温1次，然后免疫和对照山羊均气管接种5mL用步骤(2)制作的(MO+MMC)浓缩混合菌液每只山羊，在相同的饲养管理条件下临床观察25～30天，记录每天体温，流涕、咳嗽和呼吸变化的情况以及食欲和精神状态，从攻毒后第1、5、10、20、30天采集试验羊的鼻拭子用MO和MMC特异性的PCR检测攻毒支原体。
3、测定结果
表2山羊支原体肺炎二联灭活疫苗免疫有效保护期测定结果
表2试验结果表明，用本发明制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，免疫山羊后满12个月仍可抵抗MO和MMC强毒的攻击，仍具有保护作用。
实施例6：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗在2～8℃环境中保存保质期测定
1、材料
(1)MO和MMC强毒株，支原体培养基
(2)实施例1制备在2～8℃保存6个月和12个月的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
(3)0.6～1岁左右、体重25kg大小，MO和MMC抗体阴性的健康山羊10只
(4)特异性引物同实施例5。
2、方法
(1)将10只山羊分成免疫组8只和对照组2只，免疫组分别用2～8℃保存下6个月(保质期6个月)和12个月(保质期12个月)的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗各颈侧皮下注射接种4只山羊，每只5ml。对照组每只颈侧皮下注射灭菌生理盐水5mL，在相同的饲养管理条件下饲养。
(2)攻毒用MO和MMC浓缩混合强毒株菌液制作方法同实施例4。
(3)攻毒试验前3天所有羊每天测体温1次，然后免疫组和对照组山羊在免疫接种后30天时用步骤(2)制作的(MO+MMC)浓缩混合菌液每只山羊均气管接种5mL，在相同的饲养管理条件下临床观察25～30天，记录每天体温，流涕、咳嗽和呼吸变化的情况以及食欲和精神状态，从攻毒后第1、5、10、20、30天采集试验羊的鼻拭子用MO和MMC特异性的PCR检测攻毒支原体。
3、结果
表3山羊支原体肺炎二联灭活疫苗在2～8℃环境中保存保质期测定结果
结果表明：本发明制备的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗在2～8℃环境中保存6个月和12个月，用其分别免疫的共8只山羊均能抵抗住强毒的攻击而不发病，对照组2只山羊发病，并能从随后采集的鼻拭子中检测到攻毒MO和MMC。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，其特征在于：含有绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MMC)以及蜂胶佐剂；
所述的菌种从发病山羊肺组织分离取得，用于制备疫苗的菌种严格控制在其分离取得后传8代以内的代次，在培养基中生长活菌的滴度达1×109CCU/mL。
2.根据权利要求1所述的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照培养基量4％的比例分别将绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)接种于各自的支原体培养基中，于37℃摇床培养5天，至菌液生长滴度达到1×107～1×109CCU/mL，得到初始制苗菌液；取初始制苗菌液于12000r/min下离心3min，弃上清液，沉淀用灭菌生理盐水溶解，最终使绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)的菌浓度均为4×109CCU/mL，得到绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液；
(2)在绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液中分别加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度均为0.15％；充分混匀，在37℃下灭活24～48h，期间摇瓶4～5次，得到灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液；将灭活后的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)制苗菌液接种于支原体培养基中，于37℃下培养5～7d，支原体培养基均无被接种支原体和其他微生物生长即判为灭活完全；
(3)在无菌操作下，取灭活的绵羊肺炎支原体(MO)和丝状支原体山羊亚种(MMC)菌液按照1:1混合，得到混合菌液，再于混合菌液中加入蜂胶佐剂，使蜂胶佐剂在混合菌液中的最终含量为10～15mg/mL，充分摇匀，获得山羊支原体肺炎二联灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的支原体培养基主要由猪肺消化汤、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鲜酵母浸出液组成，按以下步骤制备：
(1)胰腺提取液的制备
取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500mL ddH2O和500mL无水乙醇，室温下每隔2～4h振荡一次，72h后用滤纸过滤即得；
(2)猪肺消化汤的制备
取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000mLddH2O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8％的无水NaHCO3 2500mL，混匀后冷至45℃，加入胰腺提取液500mL、氯仿50mL，混匀置37℃下6～7h，之后加浓硫酸40mL，100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1moL/L NaOH溶液调pH至8.0，100℃蒸汽加热1h，趁热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；
(3)1％水解乳蛋白胨Earle液的制备
配制原液甲：NaCl 20.0g，KCl 4.0g，NaH2PO4·2H2O 1.4g，葡萄糖20.0g，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制原液乙：NaCl 2.0g，MgCl2·6H2O 1.7g，0.4％酚红液50mL，将以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比1:100混合完全溶解，装瓶，115℃高压灭菌20min，冷却即得；
(4)25％新鲜酵母浸出液的制备
将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH2O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却，3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，滤纸初滤后，0.22μL滤膜过滤除菌，即得；
将步骤(2)至(4)获得的猪肺消化汤、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鲜酵母浸出液按体积百分数48％、50％、2％在无菌条件下混合，即得支原体培养基。
4.根据权利要求2所述的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的蜂胶佐剂的制备方法如下：称取一定质量的蜂胶，让其充分溶于体积浓度为95％的乙醇中，过滤得到不能溶解的杂质，滤液为蜂胶佐剂。
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| 马春霞等: ""丝状支原体山羊亚种GXNP株的分离和鉴定"", 《中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会论文集》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113430214A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-09-24 | 贵州大学 | 一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法 |
| CN113444743A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-09-28 | 贵州大学 | 含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法 |
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