CN112843228B

CN112843228B - 一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN112843228B
Application number: CN202110385637.7A
Authority: CN
Inventors: 王锦祥; 谢喜平; 孙世坤; 陈岩锋; 陈冬金; 桑雷
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-10
Filing date: 2021-04-10
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-04-10
Also published as: CN112843228A

Abstract

本发明涉及一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法。所述灭活疫苗含有兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmA04（CCTCC NO：M 2021202），及兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmD01（CCTCCNO：M 2021201）。所述的二价灭活疫苗是用多杀性巴氏杆菌PmA04和多杀性巴氏杆菌PmD01作为抗原灭活后再加入体积终浓度为10%的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂制备得到。本发明的二价灭活疫苗能同时预防A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌对兔的感染，具有一针两防的效果，且灭活疫苗安全可靠，不存在散毒的隐患。

Description

一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法，属于兔用疫苗制备技术领域。

背景技术

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染引起兔的一种传染病。该病一年四季均可发生，且所有日龄的兔均可发病，是兔的常发病和多发病。临床上，兔巴氏杆菌病以呼吸道症状多见，也可见中耳炎、结膜炎和子宫积脓等症状。多杀性巴氏杆菌在我国兔群中广泛流行，其感染常常引起严重的经济损失，是阻碍兔产业发展的重要病原之一。多杀性巴氏杆菌血清型众多，根据多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原可将其分为5种血清型，即A、B、D、E和F型，各血清型的菌株之间无交叉保护。近年来的研究调查表明，A型多杀性巴氏杆菌和D型的多杀性巴氏杆菌已经成为我国兔群中的主要流行菌株，且常见这两种血清型菌株的混合感染。然而，目前我国仅有针对兔A型多杀性巴氏杆菌的商品化灭活疫苗。当前我国兔群中D型多杀性巴氏杆菌也很常见，现有疫苗不能对其起到预防作用。因此，亟需一种新的能同时预防我国兔群中A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌的二价灭活疫苗以有效地预防和控制兔巴氏杆菌病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含了A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌的二价灭活疫苗及其制备方法。所述菌株的血清型能代表我国兔群中主要流行菌株的血清型，通过该方法制备得到的灭活疫苗可以更好、更全面的保护兔抵抗多杀性巴氏杆菌的感染。

本发明所提供的二价灭活疫苗，包含抗原和佐剂，其中抗原为灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌和兔D型多杀性巴氏杆菌；佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02PR佐剂。

所述的兔A型多杀性巴氏杆菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离和筛选得到的对兔具有强致病性的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida ）PmA04，该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021202。地址为武汉大学。

所述的兔D型多杀性巴氏杆菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离和筛选得到的对兔具有强致病性的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida ）PmD01，该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2021201。地址为武汉大学。

所述的二价灭活疫苗中，兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为1.8×10¹⁰-9.0×10¹⁰ CFU/mL。

本发明提供的二价灭活疫苗，其制备方法如下：

1）将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01分别接种到脑心浸液培养基中扩大培养，得到兔A型多杀性巴氏杆菌菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌菌液；

2）分别向步骤1）培养好的兔A型多杀性巴氏杆菌菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌菌液中加入终浓度为0.2%（V/V）的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时，得到灭活菌液；

3）将步骤2）所得的兔A型多杀性巴氏杆菌灭活菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌灭活菌液按体积比为1:1混合均匀，再将混合的灭活菌液与法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，得到二价灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。

本发明提供的兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗制备方法简单。此外，该灭活疫苗选取我国兔群中多杀性巴氏杆菌的优势流行菌株作为疫苗株，能更好、更全面地预防兔巴氏杆菌病的发生。

附图说明

图1 兔A型多杀性巴氏杆菌kmt1基因和hyaD基因以及兔D型多杀性巴氏杆菌kmt1基因和dcbF基因的PCR扩增结果，其中M：DL2000 DNA Marker； 1:兔A型多杀性巴氏杆菌kmt1基因（260bp）; 2:兔A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因（419bp）; 3:兔A型多杀性巴氏杆菌kmt1基因阴性对照; 4:兔A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因阴性对照; 5:兔D型多杀性巴氏杆菌kmt1基因（260bp）; 6:兔D型多杀性巴氏杆菌dcbF基因（580bp）; 7:兔D型多杀性巴氏杆菌kmt1基因阴性对照; 8:兔D型多杀性巴氏杆菌dcbF基因阴性对照。

图2 兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01分别以1.0×10⁶CFU活菌数经鼻腔攻毒引起试验兔的纤维素性肺炎，其中A:兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04感染试验兔后引起的纤维素性肺炎; B:兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01感染试验兔后引起的纤维素性肺炎。

具体实施方式

实施例1

兔A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌的分离、鉴定和筛选

1）无菌采集呼吸道病死兔的肺脏样品，接种于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板，37℃倒置培养24-48小时，挑取圆形，光滑，半透明，不溶血，直径小于1.0毫米，边缘整齐的小菌落，在5%（V/V）脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，得到纯培养物。

2）取上述纯培养物，均匀地涂布在载玻片上，经革兰氏染色后显微镜观察细菌形态，选取革兰氏染色为阴性小杆菌的分离菌。

3）提取步骤2）筛选的纯培养物的因组DNA，利用kmt1、hyaD和dcbF基因引物分别扩增分离菌的kmt1、hyaD和dcbF基因。kmt1基因上游引物为kmt1-F，引物序列为：5’-GTTTTATGCCACTTGAAATGGGAA-3’；kmt1基因下游引物为kmt1-R，引物序列为5’-TAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATT-3’。hyaD基因上游引物为hyaD-F，引物序列为：5’-ACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGG-3’；hyaD基因下游引物为hyaD-R，引物序列为5’-ATTAAAAGTGCAAATTGGAACCAA-3’。dcbF基因上游引物为dcbF-F，引物序列为：5’-TAGTCAGTATTATAATGACTTCTCATAATACAG-3’；dcbF基因下游引物为dcbF-R，引物序列为5’-TCACGCATTGTGTTATAATACAGTG-3’。

PCR反应体系为50 μL：包含25 μL 2×PCR Mix，基因组DNA 1 μL，上下游引物（10μM）各2 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、57.5℃ 30秒、72℃ 45秒，35个循环；72℃延伸10分钟。A型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因和hyaD基因阳性，kmt1基因和hyaD基因PCR扩增的目的片段大小分别为260bp和419bp（图1）。D型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因和dcbF基因阳性，kmt1基因和dcbF基因PCR扩增的目的片段大小分别为260bp和580bp（图1）。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收，送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。选取kmt1基因序列和hyaD基因序列以及kmt1基因基因和dcbF基因序列分别与GenBank中多杀性巴氏杆菌的相应序列同源性高于99%以上的菌株，用于进一步的动物回归试验。

4）将步骤3）筛选得到的兔A型多杀性巴氏杆菌和兔D性多杀性巴氏杆菌做动物回归试验。将这些菌株分别以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，每天观察试验兔的临床症状，包括试验兔的精神状态，是否出现咳嗽，是否出现鼻腔分泌物，采食量是否减少等。剖检试验期内死亡的试验兔和试验结束时存活的试验兔，观察试验兔肺脏的病变，采集肺脏样品进行细菌的再分离和鉴定。

结果显示，在本发明分离到的兔A型多杀性巴氏杆菌中，多杀性巴氏杆菌PmA04攻毒后能导致最高的发病率和最高的死亡率，分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）。在本发明分离到的兔D型多杀性巴氏杆菌中，多杀性巴氏杆菌PmD01攻毒后能导致最高的发病率和最高的死亡率，分别为100%（12/12）和33.33%（4/12）。试验兔人工感染兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01后较不活泼，采食量下降，咳嗽，鼻腔有浆液性或脓性分泌物，剖检还可见纤维素性肺炎（图2），且能从试验兔的肺脏样品中分别回收到相应的攻毒菌株。因此，在本发明中选取兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01制备二价灭活疫苗。

实施例2

兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备和安全性检测

1.兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备

分别将活菌数为2.0×10¹¹ CFU/mL的兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01以0.1%（V/V）接种到500 mL脑心浸液培养基中，37℃ 180rpm培养24小时。分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时，得到灭活菌液。将两种灭活菌液按体积比为1:1混合均匀，再将混合的灭活菌液与法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TMGEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，得到二价灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。

2 兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗的安全性检测

1）无菌检测：取0.2 mL步骤1制备的二价灭活疫苗，均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，37℃倒置培养72小时。结果为阴性，说明无细菌污染。

2）动物安全性试验：

a.将步骤1制备的二价灭活疫苗经腹腔注射5周龄健康BALB/c小鼠10只，公母各5只，每只小鼠注射0.5 mL，作为试验组；再取5周龄健康BALB/c小鼠10只，公母各5只，经腹腔注射0.5 mL灭菌脑心浸液培养基，作为对照组。观察14天，观察期间，试验组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常，说明灭活疫苗安全。

b.取35日龄健康兔30只，平均分为3组，每组10只，公母各5只。试验一组：颈背部皮下注射步骤1制备的二价灭活疫苗1 mL；试验二组：颈背部皮下分2点注射步骤1制备的二价灭活疫苗各1.5 mL，共3 mL；对照组：颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。观察30天。观察期间，试验一组、试验二组和对照组的试验兔均健康活泼，采食和饮水正常，也未观察到由疫苗注射引起的任何局部的和全身的不良反应，说明本发明的二价灭活疫苗安全。

实施例3

兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗的免疫效果评价

1.二价灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

a）抗体检测用多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备：将活菌数为2.0×10¹¹ CFU/mL的兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01以0.1%（V/V）分别接种至20 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时；10000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，沉淀分别用5mL 2.5%（W/V）氯化钠溶液重悬；重悬液置56℃水浴中孵育2小时，水浴时每20分钟摇匀一次，12000rpm 4℃离心30分钟，取上清；上清分别转移至分子截留量为3.5 KD的透析袋中，用500 mL灭菌生理盐水于4℃透析12小时，重复3次，最后用0.45 μm的无菌滤器过滤，分别得到12.3 mL兔A型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原和12.5 mL兔D型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原。

b）动物试验：取多杀性巴氏杆菌阴性和抗多杀性巴氏杆菌抗体阴性的健康兔40只，平均分为2组，每组20只，公母各10只。免疫组：35日龄时颈背部皮下注射实施例2制备的二价灭活疫苗1 mL（兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为9.0×10¹⁰ CFU/mL），50日龄再次注射实施例2制备的二价灭活疫苗1 mL（兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为9.0×10¹⁰ CFU/mL）；对照组：35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。于第二次免疫后7天、14天、21天、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月经耳缘静脉采集试验兔全血，分离血清，分别以兔A型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原为检测抗原通过琼脂扩散试验测定试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价。

c）琼脂扩散试验：取50 μL步骤a）所得的兔A型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原分别加入不同梅花型孔的中间孔，将步骤b）所得的血清用灭菌生理盐水进行连续的2倍倍比稀释至1:1024，取各个稀释度的血清50 μL分别加入兔A型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原对应梅花型孔的周边孔，再取50 μL灭菌生理盐水加入梅花型孔的周边孔作为阴性对照，37℃湿盒中反应12小时，分别测定试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌的抗体效价和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价。

结果显示，二价灭活疫苗免疫后试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌的抗体效价和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价均较快速地升高，第二次免疫后第28天至第6个月试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌的抗体效价和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价均能维持在高于7.0 log₂以上的较高水平。

注：“－”为阴性。

2 二价灭活疫苗的免疫保护效力

取健康兔150只，分为3组。疫苗组：60只，公母各30只，35日龄颈背部皮下注射实施例2的疫苗1 mL（兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为9.0×10¹⁰ CFU/mL），50日龄再次注射实施例2的疫苗1 mL（兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为9.0×10¹⁰ CFU/mL），第二次免疫后的第21天攻毒，其中30只（公母各15只）经鼻腔接种100 μL兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌悬液，活菌数为1.0×10⁶CFU；另外30只（公母各15只）经鼻腔接种100 μL兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU；对照组：60只，公母各30只，35日龄颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1mL，50日龄再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，第二次免疫后的第21天攻毒，其中30只（公母各15只）经鼻腔接种100 μL兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU；另外30只（公母各15只）经鼻腔接种100 μL兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU；正常对照组：30只，公母各15只，不做任何处理。试验期30天，试验期间各组的试验兔每2只（1公1母）饲养于1个铁丝笼中，自由采食和饮水。剖检试验期间死亡的试验兔和试验结束时存活的试验兔，采集试验兔的肺脏进行细菌的分离鉴定。计算试验期间试验兔由兔A型多杀性巴氏杆菌和兔D型多杀性巴氏杆菌攻毒引起的发病率和死亡率。

疫苗组部分：攻毒兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04的30只试验兔在试验期间无死亡，30只试验兔健康活泼，采食和饮水正常，试验结束后从1只（3.33%，1/30）试验兔的肺脏中分离到攻毒菌株；攻毒兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的30只试验兔在试验期间无死亡，30只试验兔健康活泼，采食和饮水正常，试验结束后未从试验兔的肺脏中分离到攻毒菌株。

对照组部分：攻毒兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04的30只试验兔在试验期间死亡13只（43.33%，13/30），试验结束后在剩余的17只试验兔的肺脏中均分离到了攻毒菌株；攻毒兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的30只试验兔在试验期间死亡11只（36.67%，11/30），试验结束后在剩余的19只试验兔的肺脏中均分离到了攻毒菌株；

正常对照组部分：30只试验兔，试验期间无死亡，健康活泼，采食和饮水正常，试验结束后未从试验兔的肺脏中分离到兔A型多杀性巴氏杆菌和兔D型多杀性巴氏杆菌，也未分离到其他常见的兔呼吸道疾病病原菌，如支气管败血波氏杆菌、金黄色葡萄球菌、兔病毒性出血症病毒等。

上述试验结果表明，本发明的兔巴氏杆菌二价灭活疫苗具有良好的免疫保护效力。

表1 巴氏杆菌病二价灭活疫苗接种程序和剂量

注：试验兔35日龄时一免，试验兔50日龄时二免。

表2 兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗免疫后由兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01攻毒引起的发病率和死亡率

注：发病的判定依据为：发病兔呼吸道有病变且病变组织中兔A型或D型多杀性巴氏杆菌阳性，同时无引起试验兔发病的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、金黄色葡萄球菌、支气管败血波氏杆菌等）；死亡的判定依据为：死亡兔呼吸道有病变且病变组织中兔A型或D型多杀性巴氏杆菌阳性，同时无引起试验兔死亡的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、金黄色葡萄球菌、支气管败血波氏杆菌等）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttatgcc acttgaaatg ggaa 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagaaacgt aactcaacat ggaaatatt 29

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgagtaata gattaataaa aactgagg 28

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attaaaagtg caaattggaa ccaa 24

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtcagtat tataatgact tctcataata cag 33

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcacgcattg tgttataata cagtg 25

Claims

1.一种兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的抗原及佐剂；所述兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021202；所述兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021201；

所述的两种灭活抗原菌液的体积比为1:1，两种灭活抗原的总体积为二价灭活疫苗体积的90%，佐剂的体积为10%；

兔A型多杀性巴氏杆菌抗原含量和兔D型多杀性巴氏杆菌抗原含量均为1.8×10¹⁰-9.0×10¹⁰ CFU/mL。

2.一种制备权利要求1所述的兔巴氏杆菌病二价灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将所述兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01分别接种到菌株培养基中扩大培养，得到兔A型多杀性巴氏杆菌菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌菌液；

2）分别向步骤1）所得的兔A型多杀性巴氏杆菌菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌菌液中加入甲醛至体积终浓度为0.2%，37℃ 100rpm灭活24小时，即为灭活菌液；

3）将步骤2）所得的兔A型多杀性巴氏杆菌灭活菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌灭活菌液按体积比为1:1混合均匀，再将混合的灭活菌液与佐剂按体积比为9:1混合，即为二价灭活疫苗，分装后密封，4℃保存；

步骤1）所述菌株培养基为脑心浸液培养基。