CN113069539B

CN113069539B - 一种兔a型、d型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN113069539B
Application number: CN202110385712.XA
Authority: CN
Inventors: 王锦祥; 谢喜平; 孙世坤; 陈岩锋; 陈冬金; 桑雷
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-10
Filing date: 2021-04-10
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-04-10
Also published as: CN113069539A

Abstract

本发明公开了三联灭活疫苗，该灭活疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌。所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmA04，保藏编号为CCTCC NO：M 2021202；所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmD01，保藏号为CCTCC NO：M 2021201；所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌SA472，保藏号为CCTCC NO：M 2021200。本发明的三联灭活疫苗安全性好，疫苗单剂量和超剂量接种试验动物后试验动物健康活泼，无任何局部和全身的不良反应。本发明的三联灭活疫苗免疫保护性良好，免疫保护期长，能有效地预防兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病的发生。

Description

一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗。

背景技术

兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病是兔的常发病和多发病。兔巴氏杆菌病的病原为多杀性巴氏杆菌，该病一年四季均有发生，能危害所有品种和所有日龄的兔，临床上发病兔主要表现为呼吸道症状，有些养兔场该病的发病率甚至高达70%以上。近年来的研究调查发现，我国兔群中多杀性巴氏杆菌的流行情况日趋复杂，由原来的A型多杀性巴氏杆菌为主要流行菌株变为A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌为主要流行菌株。兔葡萄球菌病的病原为金黄色葡萄球菌，该病也常年发生，尤其是高温高湿的季节多发，该病对成年公兔和成年母兔的危害尤为严重，临床上发病兔主要表现为脚皮炎、乳房炎和呼吸道症状，严重地影响着养兔场的正常生产。

临床上常见多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌对兔的混合感染，给养兔场的疫病防控带来巨大的挑战。目前，我国市售的兔巴氏杆菌病疫苗仅针对兔A型多杀性巴氏杆菌，可见现有的兔巴氏杆菌病疫苗不能同时有效地预防我国兔群中流行的A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌。此外，目前我国还没有市售的商品化兔葡萄球菌病疫苗用于预防兔金黄色葡萄球菌的感染。为解决上述问题，进行一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的研制用于预防和控制多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌对兔的感染对保障我国兔产业的发展具有重要的意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗，所述疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌抗原、灭活的兔D型多杀性巴氏杆菌抗原和灭活的兔金黄色葡萄球菌抗原以及佐剂；该三联灭活疫苗对兔群中优势流行的多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的预防和控制效果。

所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（pasteurella multocida）PmA04，该菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的A型多杀性巴氏杆菌。将多杀性巴氏杆菌PmA04以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021202，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。

所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）PmD01，该菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的D型多杀性巴氏杆菌。将多杀性巴氏杆菌PmD01以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和33.33%（4/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021201，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。

所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）SA472，该菌是从多例葡萄球菌病病死兔的化脓性肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的金黄色葡萄球菌。将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌株引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）；将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×10³ CFU活菌数经乳导管接种12只哺乳期母兔，观察30天，该菌引起的试验动物发病率和死亡率分别为100%（12/12）和16.67%（2/12）；将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×10³ CFU活菌数经试验兔后脚踏地部皮下接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和8.33%（1/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021200，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。

所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂。

所述的兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04的抗原含量不低于1.2×10¹⁰ CFU/mL；所述的兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的抗原含量不低于1.2×10¹⁰ CFU/mL；所述的兔金黄色葡萄球菌SA472的抗原含量不低于3.0×10¹⁰ CFU/mL。

所述佐剂在三联灭活疫苗中的体积终浓度为10%。

本发明的目的之二是提供一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1.将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01和兔金黄色葡萄球菌SA472分别接种到脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，获得菌液；

2.向兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌液中分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时；向兔金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时；获得三种灭活菌液。

3.将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04灭活菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01灭活菌液和兔金黄色葡萄球菌SA472灭活菌液按体积比为1:1:1混合均匀，得到混合菌液；将混合菌液与法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，得到三联灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。

本发明的有益效果在于：本发明提供的三联灭活疫苗制备方法简单，具有良好的免疫保护效果，能同时有效地预防兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌对兔的感染。疫苗单剂量和超剂量接种试验动物后试验动物健康活泼，无任何局部和全身的不良反应。本发明的三联灭活疫苗免疫保护性良好，免疫保护期长，能有效地预防兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病的发生。

具体实施方式

实施例1

兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备和安全性检测

1.兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备

将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01和兔金黄色葡萄球菌SA472以体积比为0.1%分别接种到500 mL脑心浸液培养基（Oxoid公司，货号：CM1135B），37℃ 180rpm培养24小时，获得菌液。

向兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌液中分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时；向兔金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时；获得三种灭活菌液。

将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04灭活菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01灭活菌液和兔金黄色葡萄球菌SA472灭活菌液按体积比为1:1:1混合均匀，获得混合菌液；将混合菌液与法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，得到三联灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。

兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的安全性检测

1）无菌检测：取0.2 mL步骤1制备的三联灭活疫苗，均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，37℃倒置培养72小时。结果为阴性，说明无细菌污染。

2）动物安全性试验：

a.将步骤1制备的三联灭活疫苗经腹腔注射5周龄健康的BALB/c小鼠10只，公母各5只，每只小鼠注射0.5 mL，作为试验组；再取5周龄健康的BALB/c小鼠10只，公母各5只，经腹腔注射0.5 mL灭菌脑心浸液培养基，作为对照组。观察14天。观察期间，试验组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水均正常，说明灭活疫苗安全。

b.取35日龄健康兔30只，平均为3组，每组10只，公母各5只。试验一组：颈背部皮下注射步骤1制备的三联灭活疫苗1 mL；试验二组：颈背部皮下分2点注射步骤1制备的三联灭活疫苗各1.5 mL，共3 mL；对照组：颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。观察30天。观察期间，试验一组、试验二组和对照组的试验兔均健康活泼，采食和饮水正常，无局部和全身的不良反应，说明本发明制备的三联灭活疫苗安全可靠。

实施例2

兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的免疫效果评价

1.三联灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

a)抗体检测用抗原的制备

抗体检测用多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备：分别将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01以0.1%（V/V）接种至20 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时；10000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，沉淀分别用5 mL 2.5%（W/V）氯化钠溶液重悬；重悬液置56℃水浴中孵育2小时，水浴时每20分钟摇匀一次，12000rpm 4℃离心30分钟，取上清；上清分别转移至分子截留量为3.5 KD的透析袋中，用500 mL灭菌生理盐水于4℃透析12小时，重复3次，最后用0.45 μm无菌滤器过滤，分别得到12.5 mL兔A型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原和12 mL兔D型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原。

抗体检测用金黄色葡萄球菌灭活菌体抗原的制备：将兔金黄色葡萄球菌SA472以0.1%（V/V）接种至50 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，得到菌液；向菌液中加入甲醛，至体积终浓度为0.3%，37℃ 100rpm灭活24小时，得到灭活菌液；将灭活菌液10000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，菌体沉淀用10 mL灭菌生理盐水洗涤3次，然后菌体沉淀用3mL灭菌生理盐水重悬得到灭活菌体抗原；

b)动物试验

取健康兔40只，平均分为2组，每组20只，公母各半。免疫组：35日龄时颈背部皮下注射实施例1制备的三联灭活疫苗1 mL，50日龄时再次注射实施例1制备的三联灭活疫苗1mL，约230日龄（母兔空怀期）第三次免疫本发明的三联灭活疫苗1 mL；对照组：35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄时再次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，约230日龄（母兔空怀期）第三次注射灭活脑心浸液培养基1 mL。于第二次免疫后和第三次免疫后第7天、第14天、第21天、第2个月、第3个月、第4个月、第5个月和第6个月经耳缘静脉采集试验兔全血，分离血清，以兔A型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原为检测抗原通过琼脂扩散试验测定试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌的抗体效价和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价，以灭活的金黄色葡萄球菌菌体为检测抗原通过微量凝集试验测定实验兔血清中抗兔金黄色葡萄球菌的抗体效价。

抗体效价的测定

取50μL步骤a）所得的兔A型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原分别加入不同梅花型孔的中间孔，将步骤b）所得的血清用灭菌生理盐水进行连续的2倍倍比稀释至1:1024，取各个稀释度的血清50 μL分别加入兔A型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原和兔D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原对应梅花型孔的周边孔，同时取50 μL灭菌生理盐水加入梅花型孔的周边孔作为阴性对照，37℃湿盒中反应12小时，分别测定试验兔血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌和抗兔D型多杀性巴氏杆菌的抗体效价。

取10 μL步骤a）所得的兔金黄色葡萄球菌灭活菌体抗原滴加在干净的载玻片上，将步骤b）所得的血清用灭菌生理盐水进行连续的2倍倍比稀释至1:1024，取各个稀释度的血清10 μL分别与兔金黄色葡萄球菌灭活菌体抗原混合均匀，同时设置阴性对照，37℃湿盒中反应15分钟，测定试验兔血清中抗兔金黄色葡萄球菌的抗体效价。

结果显示，试验兔第二次免疫本发明的三联灭活疫苗后，血清中抗兔A型多杀性巴氏杆菌抗体、抗兔D型多杀性巴氏杆菌抗体和抗兔金黄色葡萄球菌抗体的效价均能较快速地升高，这三种抗体的效价在第二次免疫后的第21天至第5个月均能维持在高于7.0 log₂以上的较高水平。试验兔第三次免疫后，血清中的抗兔A型多杀性巴氏杆菌抗体、抗兔D型多杀性巴氏杆菌抗体和抗兔金黄色葡萄球菌抗体的效价均较平稳地升高，这三种抗体的效价在第三次免疫后的第14天至第5个月均能维持在高于7.0 log₂以上的较高水平。详细结果见表1。

表1 三联灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

注：“－”为阴性。

三联灭活疫苗的免疫保护效力

选取健康兔150只，平均分为3组，每组50只，公母各25只。疫苗组： 35日龄时颈背部皮下注射本发明的三联灭活疫苗1 mL，50日龄时第二次免疫本发明的三联灭活疫苗1mL，约230日龄（母兔空怀期）第三次免疫本发明的三联灭活疫苗1 mL；对照组： 35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄时第二次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，约230日龄（母兔空怀期）第三次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL；正常对照组：50只健康兔，不做任何处理。试验期12个月，试验期间所有试验兔单笼单只饲养，自由采食和饮水。母兔于150日龄初配，采用本交和42天繁殖周期模式，即妊娠期30天，分娩后第12天再次配种。公兔于180日龄初次配种，本交，隔一天使用一次，每次使用仅配种一次。计算整个试验期试验兔由A型多杀性巴氏杆菌、D型多杀性巴氏杆菌或金黄色葡萄球菌感染引起的发病率和死亡率。结果显示，疫苗组试验兔发病率为2%（1/50），死亡率为0（0/50）；对照组试验兔发病率为74%（37/50），死亡率为18%（9/50）；正常对照组试验兔发病率为70%（35/50），死亡率为18%（9/50）。结果说明，本发明的三联灭活疫苗具有良好的免疫保护力。详细结果见表2和表3。

表2 兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗接种程序和剂量

注：第一次免疫于试验兔35日龄时进行；第二次免疫于试验兔50日龄时进行；第三次免疫于试验兔230日龄进行。

表3 兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗免疫后由A型多杀性巴氏杆菌、D型多杀性巴氏杆菌或金黄色葡萄球菌感染引起的发病率及死亡率

注：发病的判定依据为：发病兔有乳房炎、脚皮炎或呼吸道症状，如同一只发病兔具有乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状的一种、两种或三种只计为1只试验兔感染，感染兔的病变组织和器官中A型多杀性巴氏杆菌、D型多杀性巴氏杆菌或金黄色葡萄球菌阳性，同时该发病兔的病变组织和器官以及其他组织和器官中无引起试验兔发病的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、支气管败血波氏杆菌等）；死亡的判定依据为：死亡兔有乳房炎、脚皮炎或呼吸道症状，如同一只死亡兔具有乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状的一种、两种或三种只计为1只试验兔死亡，死亡兔的病变组织和器官中A型多杀性巴氏杆菌、D型多杀性巴氏杆菌或金黄色葡萄球菌阳性，同时该死亡兔的病变组织和器官以及其他组织和器官中无引起试验动物死亡的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、支气管败血波氏杆菌等）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有兔A型多杀性巴氏杆菌灭活菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌灭活菌液和兔金黄色葡萄球菌灭活菌液以及佐剂；

所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（pasteurella multocida）PmA04，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021202；

所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）PmD01，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021201；

所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）SA472，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021200；

2.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂在三联灭活疫苗中的体积终浓度为10%。

3.一种制备如权利要求1~2任一项所述的三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）灭活菌液的制备；

2）灭活疫苗的配制。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的灭活菌液的制备包括如下步骤：将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01和兔金黄色葡萄球菌SA472分别接种至脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，获得菌液；向兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌液中分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时；向兔金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时；获得三种灭活菌液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）所述灭活疫苗的配制包括如下步骤：将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04灭活菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01灭活菌液和兔金黄色葡萄球菌SA472灭活菌液按体积比为1:1:1混合均匀，再向混合的灭活菌液中加入体积终浓度为10%的佐剂。