CN115068599A - 猪流行性腹泻病疫苗组合物、制备方法和应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病疫苗组合物、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病疫苗组合物以及该疫苗组合物的制备方法和应用。本发明提供的灭活疫苗能够有效地保护流行强毒株的攻击，具有很好的交叉保护作用，可以有效地保护猪群抵抗猪流行性腹泻，提高猪群的生产力。

Description

猪流行性腹泻病疫苗组合物、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病疫苗组合物以及该疫苗组合物的制备方法和应用，属于生物医药领域。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性的猪肠道传染病。各种年龄的猪均易感，尤其以哺乳仔猪受害最严重，其死亡率和发病率接近100％，该病已经成为猪养殖产业发展中的一个严重问题。
目前尚无治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主，而现有的灭活疫苗所需抗原含量普遍较高，需要制备较高滴度的病毒液，生产成本较高。为此，急需一种成本可控，免疫效力较高的灭活疫苗来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗组合物，该疫苗组合物免疫效力高，可以在较低抗原含量下对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著的交叉免疫特性。
本发明的一个方面在于提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒株的抗原和药学上可接受的载体；所述猪流行性腹泻病毒株抗原为灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪流行性腹泻病毒株为猪流行性腹泻病毒HN1303株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1303)，所述HN1303株生物保藏编号为：CCTCC NO.V201514，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年3月4日，公开于中国专利申请CN106148287A。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒株的灭活全病毒；所述灭活的猪流行性腹泻病毒全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml～107.0TCID50/ml。
本发明所用的术语“疫苗组合物”系指含有猪流行性腹泻病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪流行性腹泻病毒的免疫反应。疫苗组合物为免疫量的猪流行性腹泻病毒株的灭活疫苗。
本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株HN1303株可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不会导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株抗原灭活前含量≥106.0TCID50/ml。
优选地，在所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株抗原灭活前含量为106.0TCID50/ml～107.0TCID50/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活全病毒抗原；所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述疫苗组合物中所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml～107.0TCID50/ml。
本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是天然来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。
在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。
基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。
优选地，本发明选用的佐剂为铝胶佐剂，所述铝胶佐剂包括铝盐、聚丙烯酸、硫酸葡聚糖。
优选地，所述铝盐选自氢氧化铝、磷酸铝。
作为本发明的一种实施方式，本发明铝胶佐剂通过以下方法制备：
(1)取5％W/V硫酸铝溶液，在500转/分钟搅拌下加入占硫酸铝溶液体积的0.4倍的5％W/V氢氧化钠溶液，用生理盐水离心洗涤沉淀，再悬入生理盐水中使其体积与硫酸铝溶液体积相同；
(2)依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖，搅拌均匀；
(3)经过均质机均质；优选地在800bar、50℃均质4次。
硫酸葡聚糖通常以其钠盐形式出售，因此，术语“硫酸葡聚糖”还包含其盐形式，所述盐形式包含其钠盐形式。优选地，硫酸葡聚糖的平均分子量范围为15000-35000，平均分子量可以是15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000或35000。
优选地，聚丙烯酸的平均分子量范围为1000-3500，平均分子量可以是1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400或3500。
优选地，聚丙烯酸的添加量为2mg/ml，硫酸葡聚糖的添加量为0.4mg/ml。
本发明的另一方面在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：
(1)培养增殖所述的猪流行性腹泻病毒；
(2)灭活所述步骤(1)增殖的所述猪流行性腹泻病毒；以及
(3)加入佐剂，乳化。
本发明的另一方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪流行性腹泻或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪流行性腹泻病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。
发明优点
本发明制备的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗具有良好的免疫原性和稳定性，接种仔猪和后备母猪后，均能够刺激机体快速地产生免疫力，产生较高的中和抗体水平，且抗体持续维持在一个较高水平；该灭活疫苗对仔猪和怀孕母猪均安全。本发明灭活疫苗能够有效地保护流行强毒株的攻击，具有很好的交叉保护作用，可以有效地保护猪群抵抗猪流行性腹泻，提高猪群的生产力。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪流行性腹泻病毒HN1303株的增殖培养
1.病毒繁殖
将分离的猪流行性腹泻病毒HN1303株病毒液进行100倍稀释，取1ml接种Vero细胞(25T)，37℃吸附2h，之后补加维持液至适当体积，置于37℃、5％CO2培养，培养36-48h后，待细胞病变达到80％以上时收获病毒液。病毒含量不低于107.0TCID50/ml。
2.病毒TCID50测定
Vero细胞传代后，按照3万细胞/孔，铺96孔细胞板，每孔100μl。置于37℃、5％CO2培养箱培养1天，细胞长成良好单层。将收获的病毒液用维持液进行10倍梯度稀释(10-1、10-2…10-8)，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度，加入到长成单层细胞的96孔细胞板中，每个稀释度做8个重复，每孔100μl，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4天，每天观察细胞病变。根据细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒毒价。PEDV TCID50可达107.0TCID50/ml以上。
实施例2佐剂的制备
1.佐剂A的制备
取5％W/V硫酸铝溶液2500mL，在500转/分钟搅拌下加入5％W/V氢氧化钠溶液1000mL，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使总量达2500mL。
2.佐剂B的制备
(1)取5％W/V硫酸铝溶液2500mL，在500转/分钟搅拌下加入5％W/V氢氧化钠溶液1000mL，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使总量达2500mL；
(2)依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖(聚丙烯酸2mg/ml，硫酸葡聚糖0.4mg/ml)，搅拌均匀；
(3)经过均质机(加拿大ATS均质机)800bar、50℃均质4次即可。
实施例3 HN1303株PEDV灭活苗制备
将实施例1收获的病毒液用β-丙内酯进行灭活处理，并对灭活后的病毒液进行灭活检验。将灭活检验合格的抗原按9:1的体积比与实施例2制备的佐剂乳化配苗，即制备成猪流行性腹泻灭活疫苗，具体配比见表1。
表1 HN1303株疫苗组合物成分配比
疫苗1 疫苗2 疫苗3 疫苗4
HN1303株抗原 10<sup>6.0</sup>TCID<sub>50</sub>/ml 10<sup>7.0</sup>TCID<sub>50</sub>/ml 10<sup>6.0</sup>TCID<sub>50</sub>/ml 10<sup>7.0</sup>TCID<sub>50</sub>/ml
佐剂A 10％ 10％ - -
佐剂B - - 10％ 10％
实施例4 HN1303株PEDV灭活苗的安全性试验
1.仔猪的安全性试验
将PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪25头，随机分成5组，每组5头，第1组、第2组、第3组和第4组分别用检验合格的疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4颈部肌肉接种(参见表2)，于首免后14日进行二免。首免和二免接种双倍剂量4ml/头，免后连续观察14天，观察仔猪的接种部位及临床症状。同时设立第5组为对照组，不做任何处理。结果见表2。
表2仔猪安全性实验结果
Figure BDA0002976631760000071
各免疫组5头仔猪接种PEDV灭活苗后，连续观察14天，精神、饮食正常，体温未见升高，未见腹泻相关临床症状。二免后14天剖杀，取接种部位进行病理切片观察，未见异常。说明各疫苗对仔猪安全。
2.怀孕母猪安全性试验
将PEDV抗原和抗体阴性的怀孕母猪20头，随机分成4组，每组5头，第6组、第7组、第8组和第9组分别用检验合格的疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4颈部肌肉接种(参见表3中的组别)，产前7周进行第一次免疫，接种剂量为4ml/头，产前4周进行第二次免疫，接种双倍剂量4ml/头。观察接种部位情况，统计母猪产仔数量及质量。同时设立第10组2头为对照组不做任何处理。结果见表3。
表3怀孕母猪安全性实验结果
Figure BDA0002976631760000072
Figure BDA0002976631760000081
各免疫组5头怀孕母猪接种PEDV灭活疫苗后未见明显临床症状，接种部位无异常情况。观察至母猪分娩，免疫组和对照组仔猪各有1头弱仔，无仔猪流产和死胎情况。免疫组和对照组平均产仔数没有明显差异，说明该疫苗对母猪安全。
安全性试验结果表明，本发明猪流行性腹泻病毒HN1303株对仔猪和怀孕母猪均安全，无副作用。
实施例5 HN1303株PEDV灭活苗的免疫效力试验
1.仔猪免疫效力试验
将PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪25头，随机分成5组，每组5头，第11组、第12组、第13组和第14组分别用检验合格的疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4颈部肌肉接种(参见表4中的组别)，2ml/头，同时设立第15组为对照组，不做任何处理。于首免后14日进行二免，免后连续观察14天，观察仔猪的接种部位及临床症状，二免2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表4。
表4 PEDV灭活疫苗免疫仔猪后中和抗体结果
Figure BDA0002976631760000082
Figure BDA0002976631760000091
免疫组仔猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，疫苗2组、疫苗3组和疫苗4组在免后第3周，5头仔猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第五周之后逐渐下降；疫苗1组在免后第4周，5头仔猪的中和抗体才达到1:32，维持到第5周，第6周已降到1:32以下；疫苗3在较低抗原含量下，中和抗体达到或超过较高抗原含量的疫苗2。该试验结果表明，对于8-10日龄仔猪，含有佐剂B的PEDV灭活疫苗抗原含量更低，免疫效力更好，免疫力持续时间更长。
2.母猪免疫效力试验
将PEDV抗原和抗体阴性的后备母猪20头，随机分成5组，每组4头，第16组、第17组、第18组和第19组分别用检验合格的疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4各颈部肌肉接种(参见表5中的组别)，2ml/头，第20组为空白对照组，不作任何处理。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表5。
表5灭活疫苗免疫后备母猪后中和抗体结果
Figure BDA0002976631760000092
Figure BDA0002976631760000101
免疫组母猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，疫苗2组、疫苗3组和疫苗4组在免后第3周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第五周之后逐渐下降；疫苗1组在免后第4周，4头后备母猪的中和抗体才达到1:32，维持到第5周，第6周已降到1:32以下；疫苗3在较低抗原含量下，中和抗体达到或超过较高抗原含量的疫苗2。该试验结果表明，本发明接种母猪后，含有佐剂B的PEDV灭活疫苗抗原含量更低，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。
实施例6 HN1303株PEDV灭活苗的攻毒保护比较试验
选择3头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。分成3组，第21组母猪接种疫苗1，第22组母猪接种疫苗3，第23组母猪接种PBS。所有母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。各组各选10头状态良好的仔猪用于攻毒试验，其中各组又随机分为两组，每组5头；5头母乳喂养；5头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(105.667TCID50/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表6。
表6 HN1303株PEDV灭活苗的攻毒保护比较试验结果
Figure BDA0002976631760000111
结果表明本发明含有佐剂B的灭活疫苗在较低抗原含量下对猪流行性腹泻病毒流行毒株的攻击具有良好的保护性能，而含有佐剂A的灭活疫苗在较低抗原含量下对流行毒株的攻击保护率仅为2/5，攻毒对照组全数发病。
综上所述，本发明所制备含有佐剂B的灭活疫苗对于仔猪有着良好的免疫保护效果，能对流行毒株有着良好的免疫保护效果。
实施例7 HN1303株PEDV灭活苗的攻毒保护广谱试验
选择2头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。分成2组，第24组母猪接种疫苗3，第25组母猪接种PBS。所有母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。各组各选10头状态良好的仔猪用于攻毒试验，其中各组又随机分为两组，每组5头；5头母乳喂养；5头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(105.667TCID50/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表7。
表7 HN1303株PEDV灭活苗的攻毒保护广谱试验结果
Figure BDA0002976631760000121
结果表明本发明含有佐剂B的灭活疫苗在较低抗原含量下对猪流行性腹泻病毒经典毒株的攻击具有良好的保护性能，攻毒对照组全数发病。
说明本发明所制备含有佐剂B的灭活疫苗对于仔猪有着良好的免疫保护效果，不仅能对流行毒株有着良好的免疫保护效果，而且对经典毒株有着良好的交叉免疫保护效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒株的抗原和药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂为铝胶佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒株为HN1303株，所述HN1303株生物保藏编号为：CCTCC NO.V201514，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年3月4日。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活全病毒抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml；优选地，所述疫苗组合物中所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml～107.0TCID50/ml。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述铝胶佐剂包括铝盐、聚丙烯酸、硫酸葡聚糖。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述铝盐选自氢氧化铝、磷酸铝。
7.一种制备权利要求5所述铝胶佐剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)取5％硫酸铝溶液，在强烈搅拌下加入占硫酸铝溶液体积的0.4倍的5％氢氧化钠溶液，用生理盐水离心洗涤沉淀，再悬入生理盐水中；
(2)依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖，聚丙烯酸添加量为终浓度2mg/ml，硫酸葡聚糖添加量为终浓度0.4mg/ml，搅拌均匀；
(3)经过均质机均质。
8.一种制备权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)增殖培养权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒株；
(2)灭活所述步骤(1)中增殖的所述猪流行性腹泻病毒株；以及
(3)加入佐剂，乳化。
9.根据权利要求8所述的制备疫苗组合物的方法，其特征在于，所述佐剂通过权利要求7所述的方法制备。
10.根据权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物在制备、预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
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