CN115074334A - 猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有良好免疫原性的现有流行株，猪流行性腹泻病毒NH‑TA2020株，其制备的疫苗组合物能在低免疫量时提供针对现有流行野毒株的免疫保护。本发明还提供了扩增培养该毒株的方法，先通过胰蛋白酶孵育，然后在细胞维持液中添加柠檬酸，使得培养的病毒滴度提高2个数量级以上。本发明还提供了制备疫苗组合物的方法。

Description

猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合 物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒株，其扩增培养方法，及其制备的疫苗组合物，制备疫苗组合物的方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。各种年龄的猪均易感，尤其以哺乳仔猪受害最严重。

目前尚无治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主，而病毒株及其培养的成功与否是疫苗研制的关键因素。特别是近年来，流行株毒力基因发生改变，造成疫苗免疫失败，我国多省爆发PED，给养猪业造成了严重的经济损失。因此，筛选新毒株，制备猪流行性腹泻疫苗用于预防猪流行性腹泻是十分必要的。同时，由于现有疫苗株的免疫原性有一定限制，制备的疫苗中需要高含量的抗原才能产生良好的免疫效果，不仅对扩增培养工艺有较高要求，还增加了生产成本。

受限于上述因素，同时还由于现有的猪流行性腹泻扩增培养过程培养的病毒滴度不高，不能满足于生产上的制苗的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒株以及由其制得的疫苗组合物，该猪流行性腹泻病毒株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效保护，显示出良好的免疫特性。

本发明的第一个方面在于提供一种猪流行性腹泻病毒株，其中所述病毒株S基因如序列SEQ ID NO.1所示核苷酸编码。

本发明提供了猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株，保藏编号为：CCTCC NO.V202097。

本发明的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株为现在流行株的强毒株，其灭活全病毒抗原具有良好的免疫原性，在低免疫量时即能保护猪对流行株的强毒株的攻毒。

猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株(Porcine epidemic diarrhea virus,strainNH-TA2020)，生物保藏编号为：CCTCC NO.V202097，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2020年12月16日。

本发明还提供了一种扩增培养所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)向形成有单层传代细胞的培养容器内加入胰蛋白酶和细胞维持液，放置细胞培养箱中孵育3分钟并弃去，其中胰蛋白酶的用量为细胞维持液体积用量的0.05％V/V；步骤(2)将所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株接种于所述步骤(1)胰蛋白酶孵育后的单层的传代细胞，吸附；步骤(3)在所述步骤(2)的所述吸附了猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的传代细胞中加入3％W/V柠檬酸和细胞维持液，其中柠檬酸的用量为细胞维持液体积用量的0.1％V/V，扩增培养所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株；以及步骤(4)当所述步骤(3)的所述的传代细胞CPE达到80％以上时，收获所述扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株。

本发明的扩增培养病毒方法先通过胰蛋白酶孵育，然后在细胞维持液中添加柠檬酸，能将扩增的病毒滴度提高2个数量级以上，大大提高扩增效率，降低生产成本。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的扩增方法中，所述步骤(1)的所述传代细胞为Vero细胞；所述细胞维持液为含有1％v/v胎牛血清的99％v/v DMEM。

本发明还提供了一种含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)制备铝胶佐剂组合物，将5％w/v硫酸铝溶液和5％w/v氢氧化钠溶液按体积比2.5:1搅拌混合，待生成铝胶沉淀后，离心分离所述铝胶，用生理盐水洗涤所述分离的铝胶，然后用与硫酸铝溶液的等体积的生理盐水悬浮所述洗涤的铝胶，在所述悬浮的铝胶中依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖，使其终浓度分别为聚丙烯酸2mg/ml，硫酸葡聚糖0.4mg/ml，搅拌均匀，得到佐剂组合物，均质所述佐剂组合物，得到所述铝胶佐剂组合物；步骤(2)灭活所述扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株，得到猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原；以及步骤(3)将所述铝胶佐剂组合物和所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原按1:9混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

本发明制备的疫苗组合物能在低免疫量灭活全病毒抗原的条件下，提供针对现有流行野毒的强毒株的完全保护。

本发明所用的术语“疫苗组合物”系指含有猪流行性腹泻病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪流行性腹泻病毒的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株NH-TA2020可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明所用的术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，表达的猪流行性腹泻病病毒的S蛋白可用于制备亚单位疫苗。

本发明所用的术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。

在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。

优选地，本发明选用的佐剂为铝胶佐剂，所述铝胶佐剂包括铝盐、聚丙烯酸、硫酸葡聚糖。

优选地，所述铝盐选自氢氧化铝、磷酸铝。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物制备方法中，所述步骤(1)制备铝胶佐剂组合物中所述搅拌速率为500转/分钟；所述均质条件为均质机800bar、50℃均质4次；以及所述步骤(2)中所述灭活使用β-丙内酯进行灭活。

本发明还提供了所述制备方法制备的含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原含量为灭活前≥10^6.0TCID₅₀/ml。

本发明制备的疫苗组合物由于其抗原的良好免疫原性，能在含量低至10^6.0TCID₅₀/ml时，仍能提供针对现有流行野毒的强毒株的完全保护。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml。

本发明还提供了所述含有疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪流行性腹泻或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪流行性腹泻病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。

本发明还提供了猪流行性腹泻病毒S蛋白，其如SEQ ID No.1或其简并序列编码。由于S蛋白为猪流行性腹泻病毒的主要抗原蛋白，其在相当程度上决定了本发明的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的良好的免疫原性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例中所用细胞生长液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。

硫酸葡聚糖通常以其钠盐形式出售，因此，术语硫酸葡聚糖还包含其盐形式，所述盐形式包含其钠盐形式。优选地，硫酸葡聚糖的平均分子量范围为15000-35000，平均分子量可以是15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000或35000。

聚丙烯酸的平均分子量范围为1000-3500，平均分子量可以是1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400或3500。

实施例1猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的分离

猪流行性腹泻病毒在我国大范围传播，近几年来，许多地区出现免疫猪流行性腹泻疫苗的猪场依然感染猪流行性腹泻病毒，提示该病毒可能进化新的流行趋势，最终造成免疫失败，为此，针对病毒的变异情况开展大量的流行病学调查研究，最终成功从山东某猪场发病猪群中分离出一株猪流行性腹泻病毒。

将临床采集的猪流行性腹泻典型发病的小肠连同肠内容物，用无菌的剪刀剪碎，按质量体积比1:3加入无菌的PBS(pH 7.4)，用无菌研磨器在冰上小心研磨完全。收集研磨后的液体，10000rpm、4℃离心15min。取离心后的上清，用0.22μm滤器过滤，取过滤液1ml接种Vero细胞(25T细胞瓶)，37℃吸附2h，之后补加细胞维持液至适当体积，置于37℃、5％CO₂培养，每天更换80％体积的细胞维持液，培养6天后收获病毒液保存于-20℃；使用该毒种连续盲传5代即看见明显的细胞病变。

根据PEDV核酸序列设计特异性引物，用PCR方法进行检测，结果显示PEDV阳性，证实了该分离株确实为猪流行性腹泻病毒，命名为猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株。经测定，其S基因序列如SEQ ID NO.1所示。

将猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株提交保藏。

另外，采用PCR的方法(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒、猪圆环PCR检测试剂盒和猪伪狂犬PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品；BVDV、TGEV和轮状病毒为实验室自建方法)对分离株NH-TA2020株进行外源微生物的检测，结果显示PRRSV、CSFV、PPV、PCV1/2、PRV、BVDV、TGEV、轮状病毒和支原体均为阴性，表明该毒种纯净。

实施例2猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的扩增

2.1.单层细胞的培养：将Vero细胞传代，以细胞生长液于37℃培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。

2.2.将形成单层细胞的培养容器内的细胞生长液弃去，并用PBS洗涤3次；

2.3.弃去PBS，向形成有单层细胞的培养容器内加入胰蛋白酶和细胞维持液，并放置细胞培养箱中孵育3分钟，其中胰蛋白酶的用量为细胞维持液体积用量的0.05％；

2.4.弃去细胞维持液，接种猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株，并进行吸附2小时；

2.5.病毒吸附完成后加入3％W/V柠檬酸溶液和细胞维持液，进行猪流行性腹泻病毒的扩增，其中柠檬酸溶液的用量为细胞维持液体积用量的0.1％V/V；

2.6.当CPE达到80％以上时，收获猪流行性腹泻病毒。

病毒TCID50测定：Vero细胞传代后，按照3万细胞/孔，铺96孔细胞板，每孔100μl；置于37℃、5％CO₂培养箱培养1天，细胞长成良好单层。将收获的病毒液用维持液进行10倍梯度稀释(10^-1、10^-2…10^-9)，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9 6个稀释度，加入到长成单层细胞的96孔细胞板中，每个稀释度做8个重复，每孔100μl，置于37℃5％CO₂培养箱培养4天，每天观察细胞病变。根据细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒毒价。

猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株TCID50由培养扩增前的毒种中10^5.0TCID₅₀/ml提高到10^7.5TCID₅₀/ml以上。

实施例3 NH-TA2020株PEDV灭活苗制备

3.1.铝胶佐剂组合物的制备

(1)取5％W/V硫酸铝溶液2500mL，在500转/分钟搅拌下加入5％W/V氢氧化钠溶液1000mL，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使总量达2500mL；

(2)依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖，使其终浓度为聚丙烯酸2mg/ml，硫酸葡聚糖0.4mg/ml，搅拌均匀；

(3)经过均质机(加拿大ATS均质机)800bar、50℃均质4次即可。

3.2.将实施例2收获的病毒液用β-丙内酯进行灭活处理，并对灭活后的病毒液进行灭活检验。将灭活检验合格的抗原按9:1的体积比与3.1制备的铝胶佐剂组合物乳化配苗，即制备成猪流行性腹泻灭活疫苗，具体配比见表1。

表1 NH-TA2020株疫苗组合物成分配比

	疫苗1	疫苗2
			NH-TA2020株抗原	10<sup>6.0</sup> TCID <sub>50</sub>/ml	10<sup>7.0</sup> TCID <sub>50</sub>/ml
铝胶佐剂(V/V％)	10％	10％

实施例4 NH-TA2020株PEDV灭活苗安全性试验

将PEDV抗原和抗体阴性的怀孕母猪10头，随机分成2组，第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，颈部肌肉接种，产前7周进行第一次免疫，接种剂量为4ml/头，产前4周进行第二次免疫，接种剂量为4ml/头；另设第3组怀孕母猪2头为对照组，不做任何处理。观察接种部位情况，统计母猪产仔数量及质量。结果见表2。

表2 NH-TA2020株PEDV灭活苗安全性试验结果

5头怀孕母猪接种NH-TA2020株灭活疫苗后未见明显临床症状，接种部位无异常情况。观察至母猪分娩，免疫组和对照组仔猪各有1头弱仔，无仔猪流产和死胎情况。免疫组和对照组平均产仔数没有明显差异，说明该疫苗对母猪安全。

安全性试验结果表明，本发明猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株对怀孕母猪安全，无副作用。

实施例5 NH-TA2020株PEDV灭活苗免疫原性试验

选择11头PEDV抗原和抗体阴性的后备母猪用于本试验。将后备母猪随机分为3组，第4组为疫苗1免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第5组为疫苗2免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第6组为空白对照组，3头，颈部肌肉接种PBS，2ml/头。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表3。

表3 NH-TA2020株PEDV灭活苗免疫原性试验结果

免疫组母猪猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，NH-TA2020株灭活疫苗组在免后第3周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，本发明接种母猪后，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。同时，本实施例中第4组免疫的是本发明低含量(10^6.0TCID₅₀/ml)灭活全病毒抗原的疫苗1，这说明本发明的低含量灭活全病毒抗原的疫苗即能对母猪产生良好的免疫效力。

实施例6 NH-TA2020株PEDV灭活苗攻毒保护比较试验

选择3头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。分成3组，第7组母猪接种疫苗1，第8组母猪接种PEDV商品苗，第9组母猪接种PBS。所有母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。第7～9组母猪生产后，各组各选10头状态良好的仔猪用于攻毒试验，其中各组又随机分为两组，每组5头；5头母乳喂养；5头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(10^5.0TCID₅₀/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表4。

表4 NH-TA2020株PEDV灭活苗攻毒保护比较试验结果

结果本发明灭活疫苗免疫母猪后，通过母乳喂养仔猪，其乳汁中的母源抗体能保护仔猪对抗猪流行性腹泻病毒流行毒株的攻击，且具有良好的保护性能，保护率100％(5/5)；而商品疫苗对流行毒株的攻击保护率仅为2/5，攻毒对照组全数发病。

综上所述，本发明所制备的灭活疫苗免疫母猪后对于所产仔猪有着良好的免疫保护效果，能对流行毒株有着良好的免疫保护效果。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 夏津新希望六和农牧有限公司 洛阳惠中生物技术有限公司 新希望六和股份有限公司 山东新希望六和集团有限公司 青岛嘉智生物技术有限公司 闫之春 李孝文

<120> 猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合物、制备方法和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4161

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus ）

<400> 1

atgaagtctt taacttactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60

caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180

gttaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240

tttcttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta atggtaacac taatgctact 360

gcgcgattgc gcatttgcca gtttcccagc attaaaacat tgggccccac tgctgataac 420

gatgttacaa caggtcgtaa ctgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tatcattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acttactaca tgcttaatgt tactagtgct 660

ggtgaggatg gtatttctta tcaactctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720

gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780

cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840

gtcaattgtc ttttggccat gcctaagatt tatggactag gccaattttt ctccttcaat 900

caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960

tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcacactgct 1020

ttaggaacaa atctttcttt tgtttgcagt aattcttcag accctcattt agctaccttc 1080

gccatacccc tgggtgctac ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140

aattccactg tttataaatt tttggctgtt ttacctccta ctgtcaggga aattgtcatc 1200

accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggatacc tgcatctcgg tttgttggat 1260

gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg atgtttctgg tttttggacc 1320

atagcatcga ctaattttgt tgatgcactc atcgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380

attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440

gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500

tttgttactc tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt ctctgcttcc 1560

tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggcttagt 1620

tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680

tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740

gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800

atagatcttt ttggttatcc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860

caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttagagg tgtcattgac 1920

gtttctttta tgactctgga tgtgtgcacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980

ggtatcatta cccttacaaa ttctagcatt ttggcaggtg tttattacac atctgattct 2040

ggacagttgt tagcttttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt cacgccatgt 2100

tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160

tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220

ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280

agtattggct acgtcccatc tcagtctggc caagtcaaaa ttgcacccac ggttactggg 2340

aatatcagta ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400

aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460

caactactca cccagtacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520

gctaggcttg agtctgttga agttaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580

ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640

tctgtgtatg atcctgcaag tggcagggtg gtacaaaaaa ggtcttttat tgaagacctg 2700

ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760

tctaatggtc gctctgtggc agatctagtc tgtgcacagt attactctgg tgtcatggta 2820

ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880

atggtgctag gaggttttac ttctgcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagct 2940

agacttaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000

gagtctttta actctgctat tggtaatata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060

attagtcaaa cttccaaggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120

gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttactg tacagctgca acacaacttc 3180

caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactctcgac tggacattct ctcagccgat 3240

gttcaggttg accgtcttat taccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300

accctcacta agtatactga ggttcaggct agcaggaagc tagcacagca aaaggttaat 3360

gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420

ttctctctgg tacaggcagc acctcagggc ctgctgtttt tacatacagt acttgtaccg 3480

ggtgactttg tagatgttat tgccatcgct ggcttatgcg ttaacgatga aattgccttg 3540

actctacgtg agcctggctt agtcctgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600

gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660

gttcaaattg agagttgtgt ggtcacctat gtcaatttga ctagagacca actaccagat 3720

gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattttagc ttctctgccc 3780

aatagaactg gtccaagttt tcctttagat gtttttaatg ccacttatct taatctcact 3840

ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaggagctc 3900

caaagtctta tatataatat caacaacaca ctagttgacc ttgagtggct caaccgagtt 3960

gagacatata tcaagtggcc gtggtgggtt tggttgatta tttttattgt tctcatcttt 4020

gttgtgtcat tactagtgtt ctgctgcatt tccacgggtt gttgtggatg ctgcggctgc 4080

tgctgtgctt gtttttcagg ttgttgtagg ggtcctagac ttcaacctta cgaagttttt 4140

gaaaaggtcc acgtgcagtg a 4161

Claims (9)

1.猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株，保藏编号为：CCTCC NO.V202097。

2.一种扩增培养权利要求1所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)向形成有单层传代细胞的培养容器内加入胰蛋白酶和细胞维持液，放置细胞培养箱中孵育3分钟并弃去，其中胰蛋白酶的用量为细胞维持液体积用量的0.05％V/V；

步骤(2)将所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株接种于所述步骤(1)胰蛋白酶孵育后的单层的传代细胞，吸附；

步骤(3)在所述步骤(2)的所述吸附了猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株的传代细胞中加入3％W/V柠檬酸和细胞维持液，其中柠檬酸的用量为细胞维持液体积用量的0.1％V/V，扩增培养所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株；以及

步骤(4)当所述步骤(3)的所述的传代细胞CPE达到80％以上时，收获所述扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(1)的所述传代细胞为Vero细胞；所述细胞维持液为含有1％v/v胎牛血清的99％v/vDMEM。

4.一种含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：

步骤(1)制备铝胶佐剂组合物，

将5％w/v硫酸铝溶液和5％w/v氢氧化钠溶液按体积比2.5:1搅拌混合，待生成铝胶沉淀后，离心分离所述铝胶，用生理盐水洗涤所述分离的铝胶，然后用与硫酸铝溶液的等体积的生理盐水悬浮所述洗涤的铝胶，

在所述悬浮的铝胶中依次加入聚丙烯酸和硫酸葡聚糖，使其终浓度分别为聚丙烯酸2mg/ml，硫酸葡聚糖0.4mg/ml，搅拌均匀，得到佐剂组合物，

均质所述佐剂组合物，得到所述铝胶佐剂组合物；

步骤(2)灭活权利要求2所述扩增培养方法扩增培养的猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株，得到猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原；以及

步骤(3)将所述步骤(1)的所述铝胶佐剂组合物和所述步骤(2)的所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原按1:9混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述步骤(1)制备铝胶佐剂组合物中所述搅拌速率为500转/分钟；所述均质条件为均质机800bar、50℃均质4次；以及

所述步骤(2)中所述灭活使用β-丙内酯进行灭活。

6.根据权利要求4～5任一项所述制备方法制备的含有猪流行性腹泻病毒抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原含量为灭活前≥10^6.0TCID₅₀/ml。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020株灭活全病毒抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml。

8.根据权利要求6～7任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

9.猪流行性腹泻病毒S蛋白，其如SEQ ID No.1或其简并序列编码。